أدى ظهور تقنيات معقدة في البيولوجيا الجزيئية والخلوية إلى حدوث تطور سريع نسبيًا في علوم الحياة ، بما في ذلك علم السموم. في الواقع ، يتحول تركيز علم السموم من حيوانات كاملة ومجموعات من حيوانات كاملة إلى خلايا وجزيئات الحيوانات الفردية والبشر. منذ منتصف الثمانينيات ، بدأ علماء السموم في استخدام هذه المنهجيات الجديدة في تقييم آثار المواد الكيميائية على النظم الحية. كتقدم منطقي ، يتم تكييف هذه الأساليب لأغراض اختبار السمية. عملت هذه التطورات العلمية جنبًا إلى جنب مع العوامل الاجتماعية والاقتصادية لإحداث تغيير في تقييم سلامة المنتج والمخاطر المحتملة.

ترتبط العوامل الاقتصادية بشكل خاص بحجم المواد التي يجب اختبارها. يتم إدخال عدد كبير من مستحضرات التجميل والأدوية ومبيدات الآفات والمواد الكيميائية والمنتجات المنزلية الجديدة في السوق كل عام. يجب تقييم كل هذه المنتجات لسميتها المحتملة. بالإضافة إلى ذلك ، هناك تراكم للمواد الكيميائية المستخدمة بالفعل ولم يتم اختبارها بشكل كافٍ. ستكون المهمة الهائلة المتمثلة في الحصول على معلومات سلامة مفصلة عن جميع هذه المواد الكيميائية باستخدام طرق اختبار الحيوانات الكاملة التقليدية مكلفة من حيث المال والوقت ، إذا كان من الممكن تحقيق ذلك.

هناك أيضًا مشكلات مجتمعية تتعلق بالصحة والسلامة العامة ، فضلاً عن زيادة القلق العام بشأن استخدام الحيوانات في اختبار سلامة المنتجات. فيما يتعلق بسلامة الإنسان ، تمارس جماعات المصلحة العامة والدعوة البيئية ضغوطًا كبيرة على الوكالات الحكومية لتطبيق أنظمة أكثر صرامة على المواد الكيميائية. ومن الأمثلة الحديثة على ذلك تحرك بعض المجموعات البيئية لحظر الكلور والمركبات المحتوية على الكلور في الولايات المتحدة. تكمن إحدى الدوافع لمثل هذا الإجراء المتطرف في حقيقة أن معظم هذه المركبات لم يتم اختبارها بشكل كافٍ. من منظور علم السموم ، فإن مفهوم حظر فئة كاملة من المواد الكيميائية المتنوعة على أساس وجود الكلور هو مفهوم غير سليم علميًا وغير مسؤول. ومع ذلك ، فمن المفهوم أنه من منظور الجمهور ، يجب أن يكون هناك بعض التأكيد على أن المواد الكيميائية المنبعثة في البيئة لا تشكل مخاطر صحية كبيرة. مثل هذا الموقف يؤكد الحاجة إلى طرق أكثر كفاءة وسرعة لتقييم السمية.

القلق المجتمعي الآخر الذي أثر في مجال اختبار السمية هو الرفق بالحيوان. أعرب العدد المتزايد من مجموعات حماية الحيوان في جميع أنحاء العالم عن معارضة كبيرة لاستخدام حيوانات كاملة في اختبار سلامة المنتجات. تم شن حملات نشطة ضد الشركات المصنعة لمستحضرات التجميل ومنتجات العناية المنزلية والشخصية والمستحضرات الصيدلانية في محاولة لوقف التجارب على الحيوانات. أدت هذه الجهود في أوروبا إلى تمرير التعديل السادس للتوجيه 76/768 / EEC (توجيه مستحضرات التجميل). نتيجة هذا التوجيه هو أن مستحضرات التجميل أو مكونات مستحضرات التجميل التي تم اختبارها على الحيوانات بعد 1 يناير 1998 لا يمكن تسويقها في الاتحاد الأوروبي ، ما لم يتم التحقق من صحة الطرق البديلة بشكل غير كاف. في حين أن هذا التوجيه ليس له سلطة قضائية على بيع مثل هذه المنتجات في الولايات المتحدة أو دول أخرى ، فإنه سيؤثر بشكل كبير على تلك الشركات التي لديها أسواق دولية تشمل أوروبا.

يتم تعريف مفهوم البدائل ، الذي يشكل الأساس لتطوير الاختبارات بخلاف تلك التي يتم إجراؤها على الحيوانات الكاملة ، من خلال الثلاثة Rs: تخفيض في عدد الحيوانات المستخدمة ؛ التنقيح من البروتوكولات بحيث تعاني الحيوانات من إجهاد أو انزعاج أقل ؛ و إستبدال من الاختبارات الحالية على الحيوانات مع الاختبارات في المختبر (أي الاختبارات التي أجريت خارج الحيوان الحي) ، أو النماذج الحاسوبية أو الاختبارات على أنواع الفقاريات أو اللافقاريات الدنيا. الثلاثة Rتم تقديمه في كتاب نشره عام 1959 عالمان بريطانيان هما WMS Russell و Rex Burch ، مبادئ التقنية التجريبية الإنسانية. أكد راسل وبورتش أن الطريقة الوحيدة التي يمكن من خلالها الحصول على نتائج علمية صحيحة هي من خلال المعاملة الإنسانية للحيوانات ، واعتقدوا أنه يجب تطوير طرق لتقليل استخدام الحيوانات واستبدالها في النهاية. ومن المثير للاهتمام أن المبادئ التي حددها راسل وبورتش لم تحظ باهتمام كبير حتى عودة ظهور حركة رعاية الحيوان في منتصف السبعينيات. اليوم مفهوم الثلاثة Rs هي في المقدمة إلى حد كبير فيما يتعلق بالبحث والاختبار والتعليم.

باختصار ، لقد تأثر تطوير منهجيات الاختبار في المختبر بمجموعة متنوعة من العوامل التي تقاربت على مدى السنوات العشر إلى العشرين الماضية. من الصعب التأكد مما إذا كان أي من هذه العوامل وحدها كان له مثل هذا التأثير العميق على استراتيجيات اختبار السمية.

مفهوم اختبارات السمية في المختبر

سيركز هذا القسم فقط على الطرق المختبرية لتقييم السمية ، كأحد البدائل للاختبار على الحيوانات الكاملة. تمت مناقشة البدائل الإضافية غير الحيوانية مثل النمذجة الحاسوبية والعلاقات الكمية بين البنية والنشاط في مقالات أخرى من هذا الفصل.

تُجرى الدراسات في المختبر عمومًا على خلايا أو أنسجة حيوانية أو بشرية خارج الجسم. تعني كلمة في المختبر حرفياً "في الزجاج" ، وتشير إلى الإجراءات التي يتم إجراؤها على المواد الحية أو مكونات المواد الحية المزروعة في أطباق بتري أو في أنابيب الاختبار في ظل ظروف محددة. قد تتناقض مع الدراسات التي أجريت في الجسم الحي ، أو تلك التي أجريت على "الحيوان الحي". في حين أنه من الصعب ، إن لم يكن من المستحيل ، إسقاط تأثيرات مادة كيميائية على كائن حي معقد عندما تقتصر الملاحظات على نوع واحد من الخلايا في طبق ، فإن الدراسات في المختبر توفر قدرًا كبيرًا من المعلومات حول السمية الجوهرية أيضًا كآليات خلوية وجزيئية من السمية. بالإضافة إلى ذلك ، فإنها توفر العديد من المزايا مقارنة بالدراسات المجراة من حيث أنها أقل تكلفة بشكل عام ويمكن إجراؤها في ظل ظروف أكثر تحكمًا. علاوة على ذلك ، على الرغم من حقيقة أن أعدادًا صغيرة من الحيوانات لا تزال مطلوبة للحصول على خلايا للزراعة في المختبر ، يمكن اعتبار هذه الطرق بدائل اختزال (نظرًا لاستخدام عدد أقل من الحيوانات مقارنة بالدراسات في الجسم الحي) وبدائل التنقية (لأنها تلغي الحاجة لإخضاع الحيوانات للعواقب السامة الضارة التي تفرضها التجارب في الجسم الحي).

من أجل تفسير نتائج اختبارات السمية في المختبر ، وتحديد فائدتها المحتملة في تقييم السمية وربطها بعملية السموم الكلية في الجسم الحي ، من الضروري فهم أي جزء من العملية السمية يتم فحصه. تتكون العملية السمية بأكملها من أحداث تبدأ بتعرض الكائن الحي لعامل فيزيائي أو كيميائي ، وتتقدم من خلال التفاعلات الخلوية والجزيئية وتتجلى في النهاية في استجابة الكائن الحي بأكمله. تقتصر الاختبارات في المختبر بشكل عام على جزء من عملية السموم التي تحدث على المستوى الخلوي والجزيئي. تشمل أنواع المعلومات التي يمكن الحصول عليها من الدراسات المختبرية مسارات التمثيل الغذائي ، وتفاعل المستقلبات النشطة مع الأهداف الخلوية والجزيئية ونقاط النهاية السامة التي يمكن قياسها والتي يمكن أن تكون بمثابة مؤشرات حيوية جزيئية للتعرض. في الحالة المثالية ، ستكون آلية سمية كل مادة كيميائية من التعرض لمظاهر الكائن الحي معروفة ، بحيث يمكن تفسير المعلومات التي تم الحصول عليها من الاختبارات المعملية بشكل كامل وترتبط باستجابة الكائن الحي بأكمله. ومع ذلك ، فإن هذا يكاد يكون مستحيلًا ، حيث تم توضيح عدد قليل نسبيًا من آليات السموم الكاملة. وبالتالي ، يواجه علماء السموم موقفًا لا يمكن فيه استخدام نتائج الاختبار المخبري كتنبؤ دقيق تمامًا للسمية في الجسم الحي لأن الآلية غير معروفة. ومع ذلك ، في كثير من الأحيان أثناء عملية تطوير اختبار في المختبر ، يتم توضيح مكونات الآلية (الآليات) الخلوية والجزيئية للسمية.

تتعلق إحدى القضايا الرئيسية التي لم يتم حلها والتي تحيط بتطوير وتنفيذ الاختبارات المعملية بالاعتبارات التالية: هل يجب أن تكون قائمة على أساس ميكانيكي أم أنها كافية لتكون وصفية؟ من الأفضل بلا شك من منظور علمي استخدام الاختبارات القائمة على ميكانيكي فقط كبدائل للاختبارات في الجسم الحي. ولكن في حالة عدم وجود معرفة آلية كاملة ، فإن احتمال تطوير اختبارات في المختبر لتحل محل الاختبارات الحيوانية بالكامل في المستقبل القريب يكاد يكون معدومًا. ومع ذلك ، فإن هذا لا يستبعد استخدام أنواع أكثر وصفية من المقايسات كأدوات فحص مبكرة ، وهذا هو الحال في الوقت الحاضر. أدت هذه الشاشات إلى انخفاض كبير في استخدام الحيوانات. لذلك ، حتى يحين الوقت الذي يتم فيه إنشاء المزيد من المعلومات الآلية ، قد يكون من الضروري استخدام اختبارات محدودة ترتبط نتائجها بشكل جيد مع تلك التي تم الحصول عليها في الجسم الحي.

الاختبارات المعملية للسمية الخلوية

في هذا القسم ، سيتم وصف العديد من الاختبارات في المختبر التي تم تطويرها لتقييم قدرة المادة الكيميائية على تسمم الخلايا. بالنسبة للجزء الأكبر ، تكون هذه الاختبارات سهلة الأداء ويمكن أتمتة التحليل. اختبار واحد شائع الاستخدام في المختبر للسمية الخلوية هو المقايسة الحمراء المحايدة. يتم إجراء هذا الاختبار على الخلايا الموجودة في المزرعة ، وبالنسبة لمعظم التطبيقات ، يمكن الحفاظ على الخلايا في أطباق المزرعة التي تحتوي على 96 بئراً صغيراً ، قطر كل منها 6.4 مم. نظرًا لأنه يمكن استخدام كل بئر لتحديد واحد ، فإن هذا الترتيب يمكن أن يستوعب تركيزات متعددة من المادة الكيميائية للاختبار بالإضافة إلى عناصر التحكم الإيجابية والسلبية مع عدد كافٍ من التكرارات لكل منها. بعد معالجة الخلايا بتركيزات مختلفة من المادة الكيميائية الاختبارية التي تتراوح على الأقل مرتين من حيث الحجم (على سبيل المثال ، من 0.01 م إلى 1 م م) ، بالإضافة إلى المواد الكيميائية الضابطة الإيجابية والسلبية ، يتم شطف الخلايا ومعالجتها باللون الأحمر المحايد ، صبغة لا يمكن تناولها والاحتفاظ بها إلا بواسطة الخلايا الحية. يمكن إضافة الصبغة عند إزالة المادة الكيميائية المختبرة لتحديد التأثيرات الفورية ، أو يمكن إضافتها في أوقات مختلفة بعد إزالة مادة الاختبار الكيميائية لتحديد التأثيرات التراكمية أو المتأخرة. تتوافق شدة اللون في كل بئر مع عدد الخلايا الحية في ذلك البئر. يتم قياس شدة اللون بواسطة مقياس طيف ضوئي يمكن أن يكون مزودًا بقارئ لوحة. تمت برمجة قارئ اللوحة لتوفير قياسات فردية لكل من الآبار الـ 96 في طبق الثقافة. تسمح هذه المنهجية الآلية للمحقق بإجراء تجربة تركيز - استجابة سريعًا والحصول على بيانات مفيدة إحصائيًا.

اختبار آخر بسيط نسبيًا للسمية الخلوية هو اختبار MTT. MTT (3 [4,5،2-dimethylthiazol-2,5-yl] -XNUMX،XNUMX-diphenyltetrazolium bromide) عبارة عن صبغة تترازوليوم يتم تقليلها بواسطة إنزيمات الميتوكوندريا إلى اللون الأزرق. فقط الخلايا التي تحتوي على ميتوكوندريا قابلة للحياة هي التي تحتفظ بالقدرة على تنفيذ هذا التفاعل ؛ لذلك ترتبط شدة اللون ارتباطًا مباشرًا بدرجة سلامة الميتوكوندريا. هذا اختبار مفيد للكشف عن المركبات السامة للخلايا العامة وكذلك تلك العوامل التي تستهدف الميتوكوندريا على وجه التحديد.

يستخدم قياس نشاط اللاكتات ديهيدروجينيز (LDH) أيضًا كمقايسة واسعة النطاق للسمية الخلوية. يوجد هذا الإنزيم عادة في سيتوبلازم الخلايا الحية ويتم إطلاقه في وسط استنبات الخلية من خلال أغشية الخلايا المتسربة للخلايا الميتة أو المحتضرة التي تأثرت سلبًا بعامل سام. يمكن إزالة كميات صغيرة من وسط المزرعة في أوقات مختلفة بعد المعالجة الكيميائية للخلايا لقياس كمية LDH المنبعثة وتحديد المسار الزمني للسمية. في حين أن مقايسة إطلاق LDH هي تقييم عام جدًا للسمية الخلوية ، إلا أنها مفيدة لأنها سهلة التنفيذ ويمكن إجراؤها في الوقت الفعلي.

هناك العديد من الطرق الجديدة التي يتم تطويرها لاكتشاف الضرر الخلوي. تستخدم الطرق الأكثر تعقيدًا مجسات الفلورسنت لقياس مجموعة متنوعة من المعلمات داخل الخلايا ، مثل إطلاق الكالسيوم والتغيرات في درجة الحموضة وإمكانات الغشاء. بشكل عام ، هذه المجسات حساسة للغاية وقد تكتشف تغييرات خلوية أكثر دقة ، مما يقلل من الحاجة إلى استخدام موت الخلية كنقطة نهاية. بالإضافة إلى ذلك ، قد تتم أتمتة العديد من فحوصات الفلورسنت هذه باستخدام لوحات 96-بئر وقارئات لوحة الفلورسنت.

بمجرد جمع البيانات عن سلسلة من المواد الكيميائية باستخدام أحد هذه الاختبارات ، يمكن تحديد السمية النسبية. يمكن التعبير عن السمية النسبية لمادة كيميائية ، كما هو محدد في اختبار في المختبر ، على أنها التركيز الذي يمارس تأثيرًا بنسبة 50٪ على استجابة نقطة النهاية للخلايا غير المعالجة. يشار إلى هذا التحديد باسم المفوضية الأوروبية₅₀ (Eخامل Cالتركيز ل 50٪ من الخلايا) ويمكن استخدامها لمقارنة سمية المواد الكيميائية المختلفة في المختبر. (مصطلح مشابه يستخدم في تقييم السمية النسبية هو IC₅₀، يشير إلى تركيز مادة كيميائية تسبب تثبيطًا بنسبة 50 ٪ لعملية خلوية ، على سبيل المثال ، القدرة على تناول اللون الأحمر المحايد.) ليس من السهل تقييم ما إذا كانت السمية النسبية للمواد الكيميائية في المختبر قابلة للمقارنة مع قريبها في سمية الجسم الحي ، نظرًا لوجود العديد من العوامل المربكة في نظام الجسم الحي ، مثل الحركية السمية ، والتمثيل الغذائي ، وآليات الإصلاح والدفاع. بالإضافة إلى ذلك ، نظرًا لأن معظم هذه المقايسات تقيس نقاط نهاية السمية الخلوية العامة ، فإنها لا تستند إلى ميكانيكي. لذلك ، فإن الاتفاق بين السمية النسبية في المختبر وفي الجسم الحي هو ببساطة متلازم. على الرغم من التعقيدات والصعوبات العديدة في الاستقراء من المختبر إلى الجسم الحي ، فقد أثبتت هذه الاختبارات في المختبر أنها ذات قيمة كبيرة لأنها بسيطة وغير مكلفة في الأداء ويمكن استخدامها كشاشات لتحديد الأدوية أو المواد الكيميائية شديدة السمية في المراحل المبكرة من تطوير.

سمية الجهاز المستهدف

يمكن أيضًا استخدام الاختبارات المعملية لتقييم سمية الأعضاء المستهدفة المحددة. هناك عدد من الصعوبات المرتبطة بتصميم مثل هذه الاختبارات ، وأبرزها عدم قدرة الأنظمة المختبرية على الحفاظ على العديد من سمات العضو في الجسم الحي. في كثير من الأحيان ، عندما تؤخذ الخلايا من الحيوانات وتوضع في المزرعة ، فإنها تميل إما إلى التدهور بسرعة و / أو عدم التمايز ، أي تفقد وظائفها الشبيهة بالعضو وتصبح أكثر عمومية. وهذا يمثل مشكلة في أنه في غضون فترة قصيرة من الوقت ، عادةً بضعة أيام ، لم تعد الثقافات مفيدة لتقييم التأثيرات الخاصة بالأعضاء للسم.

يتم التغلب على العديد من هذه المشكلات بسبب التطورات الحديثة في البيولوجيا الجزيئية والخلوية. يمكن استخدام المعلومات التي يتم الحصول عليها حول البيئة الخلوية في الجسم الحي في تعديل ظروف الثقافة في المختبر. منذ منتصف الثمانينيات ، تم اكتشاف عوامل نمو وسيتوكينات جديدة ، والعديد منها متاح الآن تجاريًا. تساعد إضافة هذه العوامل إلى الخلايا في المزرعة على الحفاظ على سلامتها وقد تساعد أيضًا في الاحتفاظ بوظائف أكثر تمايزًا لفترات زمنية أطول. زادت الدراسات الأساسية الأخرى من المعرفة بالمتطلبات الغذائية والهرمونية للخلايا في المزرعة ، بحيث يمكن صياغة وسائط جديدة. تم إحراز تقدم حديث أيضًا في تحديد كل من المصفوفات خارج الخلية الطبيعية والاصطناعية التي يمكن استنبات الخلايا عليها. يمكن أن يكون لثقافة الخلايا على هذه المصفوفات المختلفة تأثيرات عميقة على كل من هيكلها ووظيفتها. الميزة الرئيسية المستمدة من هذه المعرفة هي القدرة على التحكم بشكل معقد في بيئة الخلايا في الثقافة والفحص الفردي لتأثيرات هذه العوامل على عمليات الخلية الأساسية وعلى استجاباتها للعوامل الكيميائية المختلفة. باختصار ، يمكن أن توفر هذه الأنظمة نظرة ثاقبة لآليات السمية الخاصة بالأعضاء.

يتم إجراء العديد من دراسات سمية الأعضاء المستهدفة في الخلايا الأولية ، والتي يتم عزلها حديثًا من عضو ما ، وعادةً ما تظهر عمرًا محدودًا في المزرعة. هناك العديد من المزايا لوجود مزارع أولية لنوع خلية واحدة من عضو لتقييم السمية. من منظور آلي ، هذه الثقافات مفيدة لدراسة أهداف خلوية محددة لمادة كيميائية. في بعض الحالات ، يمكن زراعة نوعين أو أكثر من أنواع الخلايا من العضو معًا ، وهذا يوفر ميزة إضافية تتمثل في القدرة على النظر في تفاعلات الخلايا الخلوية استجابةً للسم. تم تصميم بعض أنظمة الاستزراع المشترك للبشرة بحيث تشكل بنية ثلاثية الأبعاد تشبه الجلد في الجسم الحي. من الممكن أيضًا الاستزراع المشترك لخلايا من أعضاء مختلفة - على سبيل المثال ، الكبد والكلى. قد يكون هذا النوع من الزرع مفيدًا في تقييم التأثيرات الخاصة بخلايا الكلى ، لمادة كيميائية يجب تنشيطها بيولوجيًا في الكبد.

لعبت الأدوات البيولوجية الجزيئية أيضًا دورًا مهمًا في تطوير خطوط الخلايا المستمرة التي يمكن أن تكون مفيدة لاختبار سمية الأعضاء المستهدفة. يتم إنشاء خطوط الخلايا هذه عن طريق نقل الحمض النووي إلى الخلايا الأولية. في إجراء تعداء ، يتم معالجة الخلايا والحمض النووي بحيث يمكن للخلايا امتصاص الحمض النووي. عادة ما يكون الحمض النووي من فيروس ويحتوي على جين أو جينات ، عند التعبير عنها ، تسمح للخلايا بأن تصبح خالدة (أي قادرة على العيش والنمو لفترات طويلة في الثقافة). يمكن أيضًا تصميم الحمض النووي بحيث يتم التحكم في الجين الخالد بواسطة محفز محفز. ميزة هذا النوع من البناء هي أن الخلايا سوف تنقسم فقط عندما تتلقى المحفز الكيميائي المناسب للسماح بالتعبير عن الجين الخالد. مثال على هذا البناء هو جين مستضد T الكبير من Simian Virus 40 (SV40) (الجين الخالد) ، مسبوقًا بمنطقة المروج لجين الميتالوثيونين ، والذي يحدث بسبب وجود معدن في وسط الثقافة. وهكذا ، بعد نقل الجين إلى الخلايا ، يمكن معالجة الخلايا بتركيزات منخفضة من الزنك لتحفيز محفز MT وتشغيل التعبير عن جين مستضد T. في ظل هذه الظروف ، تتكاثر الخلايا. عند إزالة الزنك من الوسط ، تتوقف الخلايا عن الانقسام وتعود في ظل الظروف المثالية إلى الحالة التي تعبر فيها عن وظائفها الخاصة بالأنسجة.

ساهمت القدرة على إنتاج خلايا خالدة جنبًا إلى جنب مع التقدم في تقنية زراعة الخلايا بشكل كبير في إنشاء خطوط خلوية من العديد من الأعضاء المختلفة ، بما في ذلك الدماغ والكلى والكبد. ومع ذلك ، قبل أن يتم استخدام خطوط الخلايا هذه كبديل لأنواع الخلايا الحسنة النية ، يجب وصفها بعناية لتحديد مدى "طبيعتها" حقًا.

أنظمة أخرى في المختبر لدراسة سمية الأعضاء المستهدفة تنطوي على زيادة التعقيد. نظرًا لأن الأنظمة المختبرية تتقدم في التعقيد من خلية واحدة إلى زراعة أعضاء كاملة ، فإنها تصبح أكثر قابلية للمقارنة مع البيئة في الجسم الحي ، ولكن في نفس الوقت يصبح التحكم فيها أكثر صعوبة نظرًا للعدد المتزايد من المتغيرات. لذلك ، فإن ما يمكن اكتسابه من الانتقال إلى مستوى أعلى من التنظيم يمكن أن يضيع في عدم قدرة الباحث على التحكم في البيئة التجريبية. يقارن الجدول 1 بعض خصائص الأنظمة المختبرية المختلفة التي تم استخدامها لدراسة السمية الكبدية.

الجدول 1. مقارنة الأنظمة في المختبر لدراسات السمية الكبدية

يتم استخدام شرائح الأنسجة الدقيقة على نطاق واسع لدراسات السموم. هناك أدوات جديدة متاحة تمكن الباحث من قطع شرائح أنسجة موحدة في بيئة معقمة. تقدم شرائح الأنسجة بعض المزايا على أنظمة زراعة الخلايا من حيث أن جميع أنواع الخلايا في العضو موجودة وتحافظ على بنيتها في الجسم الحي وتواصلها بين الخلايا. وبالتالي ، يمكن إجراء دراسات في المختبر لتحديد نوع الخلية المستهدفة داخل العضو وكذلك للتحقيق في سمية العضو المستهدف المحدد. من عيوب الشرائح أنها تتحلل بسرعة بعد الـ 24 ساعة الأولى من الاستنبات ، ويرجع ذلك أساسًا إلى ضعف انتشار الأكسجين إلى الخلايا الموجودة داخل الشرائح. ومع ذلك ، فقد أشارت الدراسات الحديثة إلى أنه يمكن تحقيق تهوية أكثر كفاءة عن طريق الدوران اللطيف. هذا ، إلى جانب استخدام وسط أكثر تعقيدًا ، يسمح للشرائح بالبقاء لمدة تصل إلى 96 ساعة.

تتشابه إإكسبلنتس الأنسجة من حيث المفهوم مع شرائح الأنسجة ويمكن أيضًا استخدامها لتحديد سمية المواد الكيميائية في أعضاء مستهدفة محددة. يتم إنشاء إإكسبلنتس الأنسجة عن طريق إزالة قطعة صغيرة من الأنسجة (لدراسات المسخ ، جنين سليم) ووضعها في المزرعة لمزيد من الدراسة. كانت الزراعة المستأصلة مفيدة لدراسات السمية قصيرة المدى بما في ذلك التهيج والتآكل في الجلد ودراسات الأسبستوس في القصبة الهوائية ودراسات السمية العصبية في أنسجة المخ.

يمكن أيضًا استخدام الأعضاء المروية المعزولة لتقييم سمية الأعضاء المستهدفة. تقدم هذه الأنظمة ميزة مماثلة لتلك الخاصة بشرائح الأنسجة والإكسبلنتس في أن جميع أنواع الخلايا موجودة ، ولكن بدون إجهاد الأنسجة التي أدخلتها التلاعبات المشاركة في تحضير الشرائح. بالإضافة إلى ذلك ، فهي تسمح بالحفاظ على التفاعلات داخل الأعضاء. العيب الرئيسي هو قابليتها للبقاء على المدى القصير ، مما يحد من استخدامها في اختبار السمية في المختبر. من حيث العمل كبديل ، يمكن اعتبار هذه الثقافات تحسينًا لأن الحيوانات لا تعاني من العواقب السلبية للمعالجة في الجسم الحي بالسموم. ومع ذلك ، فإن استخدامها لا يقلل بشكل كبير من عدد الحيوانات المطلوبة.

باختصار ، هناك عدة أنواع من الأنظمة المختبرية المتاحة لتقييم سمية الأعضاء المستهدفة. من الممكن الحصول على الكثير من المعلومات حول آليات السمية باستخدام واحدة أو أكثر من هذه التقنيات. تظل الصعوبة في معرفة كيفية الاستقراء من نظام في المختبر ، والذي يمثل جزءًا صغيرًا نسبيًا من العملية السمية ، إلى العملية برمتها التي تحدث في الجسم الحي.

اختبارات في المختبر لتهيج العين

ربما يكون اختبار السمية للحيوان الأكثر إثارة للجدل من منظور الرفق بالحيوان هو اختبار Draize لتهيج العين ، والذي يتم إجراؤه في الأرانب. في هذا الاختبار ، يتم وضع جرعة ثابتة صغيرة من مادة كيميائية في إحدى عيني الأرنب بينما يتم استخدام العين الأخرى كعنصر تحكم. يتم تسجيل درجة التهيج والالتهاب في أوقات مختلفة بعد التعرض. يتم بذل جهد كبير لتطوير منهجيات لتحل محل هذا الاختبار ، والذي تم انتقاده ليس فقط لأسباب إنسانية ، ولكن أيضًا بسبب ذاتية الملاحظات وتنوع النتائج. من المثير للاهتمام أن نلاحظ أنه على الرغم من الانتقادات القاسية التي تلقاها اختبار Draize ، فقد أثبت أنه ناجح بشكل ملحوظ في توقع مهيجات العين البشرية ، خاصة المواد المهيجة بشكل طفيف إلى معتدل ، والتي يصعب التعرف عليها بطرق أخرى. وبالتالي ، فإن الطلب على البدائل في المختبر كبير.

البحث عن بدائل لاختبار درايز أمر معقد ، وإن كان من المتوقع أن يكون ناجحًا. تم تطوير العديد من البدائل في المختبر وغيرها وفي بعض الحالات تم تنفيذها. بدائل الصقل لاختبار Draize ، والتي بحكم تعريفها ، أقل إيلامًا أو إزعاجًا للحيوانات ، تشمل اختبار العين منخفض الحجم ، حيث يتم وضع كميات أصغر من مواد الاختبار في عيون الأرانب ، ليس فقط لأسباب إنسانية ، ولكن أيضًا يحاكي عن كثب الكميات التي قد يتعرض لها الأشخاص عن طريق الخطأ. تحسين آخر هو أن المواد التي تحتوي على درجة حموضة أقل من 2 أو أكبر من 11.5 لم تعد مختبرة على الحيوانات حيث من المعروف أنها تسبب تهيجًا شديدًا للعين.

بين عامي 1980 و 1989 ، كان هناك انخفاض يقدر بنسبة 87 ٪ في عدد الأرانب المستخدمة لاختبار تهيج العين لمستحضرات التجميل. تم دمج الاختبارات في المختبر كجزء من نهج اختبار المستوى لتحقيق هذا الانخفاض الهائل في الاختبارات التي أجريت على الحيوانات بأكملها. هذا النهج هو عملية متعددة الخطوات تبدأ بفحص شامل لبيانات تهيج العين التاريخية والتحليل الفيزيائي والكيميائي للمادة الكيميائية المراد تقييمها. إذا لم تسفر هاتان العمليتان عن معلومات كافية ، فسيتم إجراء مجموعة من الاختبارات المعملية. قد تكون البيانات الإضافية التي تم الحصول عليها من الاختبارات المعملية كافية لتقييم سلامة المادة. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فستكون الخطوة الأخيرة هي إجراء اختبارات محدودة في الجسم الحي. من السهل أن نرى كيف يمكن لهذا النهج أن يقضي على أو على الأقل يقلل بشكل كبير من أعداد الحيوانات اللازمة للتنبؤ بسلامة مادة الاختبار.

تعتمد بطارية الاختبارات المختبرية المستخدمة كجزء من استراتيجية اختبار الطبقة هذه على احتياجات الصناعة المعينة. يتم إجراء اختبار تهيج العين بواسطة مجموعة متنوعة من الصناعات من مستحضرات التجميل إلى الأدوية إلى الكيماويات الصناعية. يختلف نوع المعلومات التي تتطلبها كل صناعة ، وبالتالي لا يمكن تحديد بطارية واحدة من الاختبارات المعملية. تم تصميم بطارية الاختبار بشكل عام لتقييم خمسة معايير: السمية الخلوية ، والتغيرات في فسيولوجيا الأنسجة والكيمياء الحيوية ، والعلاقات الكمية بين التركيب والنشاط ، ووسطاء الالتهاب ، والتعافي والإصلاح. مثال على اختبار السمية الخلوية ، وهو أحد الأسباب المحتملة للتهيج ، هو الفحص الأحمر المحايد باستخدام الخلايا المستنبتة (انظر أعلاه). يمكن تقييم التغيرات في فسيولوجيا الخلايا والكيمياء الحيوية الناتجة عن التعرض لمادة كيميائية في مزارع الخلايا الظهارية للقرنية البشرية. بدلاً من ذلك ، استخدم الباحثون أيضًا الأبقار أو مقل أعين الدجاج التي تم الحصول عليها من المسالخ سليمة أو مقطوعة. العديد من نقاط النهاية المقاسة في مزارع الأعضاء هذه هي نفسها التي تم قياسها في الجسم الحي ، مثل عتامة القرنية وتورم القرنية.

غالبًا ما يكون الالتهاب أحد مكونات إصابة العين الناتجة عن المواد الكيميائية ، وهناك عدد من الاختبارات المتاحة لفحص هذه المعلمة. تكتشف فحوصات كيميائية حيوية مختلفة وجود وسطاء تم إطلاقها أثناء العملية الالتهابية مثل حمض الأراكيدونيك والسيتوكينات. يمكن أيضًا استخدام الغشاء المشيمي (CAM) لبيضة الدجاجة كمؤشر على الالتهاب. في اختبار CAM ، تتم إزالة قطعة صغيرة من قشرة جنين كتكوت من 14 إلى XNUMX يومًا لفضح CAM. ثم يتم تطبيق المادة الكيميائية على الطبابة البديلة ويتم تسجيل علامات الالتهاب ، مثل نزيف الأوعية الدموية ، في أوقات مختلفة بعد ذلك.

واحدة من أصعب العمليات في الجسم الحي للتقييم في المختبر هي التعافي وإصلاح إصابة العين. أداة مطورة حديثًا ، مقياس السيليكون الدقيق ، تقيس التغيرات الصغيرة في درجة الحموضة خارج الخلية ويمكن استخدامها لمراقبة الخلايا المستنبتة في الوقت الفعلي. لقد ثبت أن هذا التحليل يرتبط بشكل جيد إلى حد ما مع الانتعاش في الجسم الحي وقد تم استخدامه كاختبار في المختبر لهذه العملية. كانت هذه لمحة موجزة عن أنواع الاختبارات المستخدمة كبدائل لاختبار Draize لتهيج العين. من المحتمل أنه خلال السنوات العديدة القادمة سيتم تحديد سلسلة كاملة من بطاريات الاختبار في المختبر وسيتم التحقق من صحة كل منها لغرضها المحدد.

التحقق

إن مفتاح القبول التنظيمي وتنفيذ منهجيات الاختبار في المختبر هو التحقق من الصحة ، وهي العملية التي يتم من خلالها تحديد مصداقية الاختبار المرشح لغرض محدد. بذلت جهود لتحديد وتنسيق عملية التحقق في كل من الولايات المتحدة وأوروبا. أنشأ الاتحاد الأوروبي المركز الأوروبي للتحقق من صحة الطرق البديلة (ECVAM) في عام 1993 لتنسيق الجهود هناك وللتفاعل مع المنظمات الأمريكية مثل مركز جونز هوبكنز لبدائل اختبار الحيوانات (CAAT) ، وهو مركز أكاديمي في الولايات المتحدة ، ولجنة التنسيق المشتركة بين الوكالات للتحقق من صحة الطرق البديلة (ICCVAM) ، المؤلفة من ممثلين من المعاهد الوطنية للصحة ، ووكالة حماية البيئة الأمريكية ، وإدارة الغذاء والدواء الأمريكية ، ولجنة سلامة المنتجات الاستهلاكية.

يتطلب التحقق من صحة الاختبارات المعملية تنظيمًا وتخطيطًا كبيرًا. يجب أن يكون هناك إجماع بين المنظمين الحكوميين والعلماء الصناعيين والأكاديميين حول الإجراءات المقبولة ، وإشراف كاف من قبل مجلس استشاري علمي لضمان أن البروتوكولات تفي بالمعايير المحددة. يجب إجراء دراسات التحقق من الصحة في سلسلة من المختبرات المرجعية باستخدام مجموعات معايرة من المواد الكيميائية من بنك كيميائي وخلايا أو أنسجة من مصدر واحد. يجب إثبات كل من قابلية التكرار داخل المختبر والتكاثر البيني للاختبار المرشح وإخضاع النتائج للتحليل الإحصائي المناسب. بمجرد تجميع النتائج من المكونات المختلفة لدراسات التحقق من الصحة ، يمكن للمجلس الاستشاري العلمي تقديم توصيات بشأن صحة اختبار (اختبارات) المرشح لغرض محدد. بالإضافة إلى ذلك ، يجب نشر نتائج الدراسات في المجلات التي راجعها النظراء ووضعها في قاعدة بيانات.

تعريف عملية التحقق من الصحة هو حاليا عمل قيد التقدم. ستوفر كل دراسة تحقق جديدة معلومات مفيدة لتصميم الدراسة التالية. يعد الاتصال والتعاون الدوليان ضروريين للتطوير السريع لسلسلة من البروتوكولات المقبولة على نطاق واسع ، لا سيما بالنظر إلى الإلحاح المتزايد الذي يفرضه مرور توجيه EC Cosmetics. قد يوفر هذا التشريع في الواقع الزخم المطلوب لبذل جهود تحقق جادة. لا يمكن البدء بقبول الأساليب المختبرية من قبل المجتمعات التنظيمية المختلفة إلا من خلال إكمال هذه العملية.

وفي الختام

قدمت هذه المقالة نظرة عامة واسعة على الوضع الحالي لاختبار السمية في المختبر. يعتبر علم السموم في المختبر حديثًا نسبيًا ، لكنه ينمو باطراد. يتمثل التحدي في السنوات المقبلة في دمج المعرفة الآلية الناتجة عن الدراسات الخلوية والجزيئية في المخزون الواسع للبيانات في الجسم الحي لتوفير وصف أكثر اكتمالاً لآليات السموم بالإضافة إلى إنشاء نموذج يمكن من خلاله استخدام البيانات المختبرية للتنبؤ بالسمية في الجسم الحي. لن يمكن تحقيق القيمة المتأصلة لهذه الأساليب في المختبر إلا من خلال الجهود المتضافرة لعلماء السموم وممثلي الحكومة.

الرجوع