La evaluación de la toxicidad genética es la evaluación de los agentes por su capacidad para inducir cualquiera de los tres tipos generales de cambios (mutaciones) en el material genético (ADN): genético, cromosómico y genómico. En organismos como los humanos, los genes están compuestos de ADN, que consta de unidades individuales llamadas bases de nucleótidos. Los genes están dispuestos en estructuras físicas discretas llamadas cromosomas. La genotoxicidad puede tener efectos significativos e irreversibles sobre la salud humana. El daño genotóxico es un paso crítico en la inducción del cáncer y también puede estar involucrado en la inducción de defectos de nacimiento y muerte fetal. Las tres clases de mutaciones mencionadas anteriormente pueden ocurrir dentro de cualquiera de los dos tipos de tejidos que poseen organismos como los humanos: espermatozoides u óvulos (células germinales) y el tejido restante (células somáticas).
Los ensayos que miden la mutación génica son aquellos que detectan la sustitución, adición o eliminación de nucleótidos dentro de un gen. Los ensayos que miden la mutación cromosómica son aquellos que detectan rupturas o reordenamientos cromosómicos que involucran uno o más cromosomas. Los ensayos que miden la mutación genómica son aquellos que detectan cambios en el número de cromosomas, una condición llamada aneuploidía. La evaluación de la toxicidad genética ha cambiado considerablemente desde el desarrollo por parte de Herman Muller en 1927 del primer ensayo para detectar agentes genotóxicos (mutagénicos). Desde entonces, se han desarrollado más de 200 ensayos que miden mutaciones en el ADN; sin embargo, menos de diez ensayos se utilizan comúnmente hoy en día para la evaluación de la toxicidad genética. Este artículo revisa estos ensayos, describe lo que miden y explora el papel de estos ensayos en la evaluación de la toxicidad.
Identificación de riesgos de cáncer antes del desarrollo del Campo de Toxicología Genética
La toxicología genética se ha convertido en una parte integral del proceso general de evaluación de riesgos y ha ganado prestigio en los últimos tiempos como predictor fiable de la actividad cancerígena. Sin embargo, antes del desarrollo de la toxicología genética (antes de 1970), se usaban y todavía se usan otros métodos para identificar los riesgos potenciales de cáncer para los humanos. Hay seis categorías principales de métodos utilizados actualmente para identificar los riesgos de cáncer humano: estudios epidemiológicos, bioensayos in vivo a largo plazo, bioensayos in vivo a mediano plazo, bioensayos in vivo e in vitro a corto plazo, inteligencia artificial (estructura-actividad), e inferencia basada en mecanismos.
La Tabla 1 muestra las ventajas y desventajas de estos métodos.
Tabla 1. Ventajas y desventajas de los métodos actuales para identificar los riesgos de cáncer en humanos
| Ventajas | Desventajas | |
| Estudios epidemiológicos | (1) los humanos son los últimos indicadores de enfermedad; (2) evaluar poblaciones sensibles o susceptibles; (3) cohortes de exposición ocupacional; (4) alertas ambientales centinela |
(1) generalmente retrospectivo (certificados de defunción, sesgos de recuerdo, etc.); (2) insensible, costoso, extenso; (3) datos de exposición confiables a veces no disponibles o difíciles de obtener; (4) exposiciones combinadas, múltiples y complejas; falta de cohortes de control apropiadas; (5) experimentos en humanos no realizados; (6) detección del cáncer, no prevención |
| Bioensayos in vivo a largo plazo | (1) evaluaciones prospectivas y retrospectivas (validación); (2) excelente correlación con carcinógenos humanos identificados; (3) niveles de exposición y condiciones conocidas; (4) identifica la toxicidad química y los efectos cancerígenos; (5) resultados obtenidos con relativa rapidez; (6) comparaciones cualitativas entre clases químicas; (7) sistemas biológicos integrativos e interactivos relacionados estrechamente con los humanos | (1) raramente replicado, intensivo en recursos; (3) instalaciones limitadas adecuadas para tales experimentos; (4) debate sobre la extrapolación de especies; (5) las exposiciones utilizadas se encuentran a menudo en niveles muy superiores a los que experimentan los seres humanos; (6) la exposición a un solo químico no imita la exposición humana, que generalmente es a múltiples químicos simultáneamente |
| Bioensayos in vivo e in vitro a medio y corto plazo | (1) más rápido y menos costoso que otros ensayos; (2) muestras grandes que se replican fácilmente; (3) se miden puntos finales biológicamente significativos (mutación, etc.); (4) se puede utilizar como ensayos de detección para seleccionar productos químicos para bioensayos a largo plazo |
(1) in vitro no completamente predictivo de in vivo; (2) generalmente organismo u órgano específico; (3) potencias no comparables con animales completos o humanos |
| Asociaciones estructura química-actividad biológica | (1) relativamente fácil, rápido y económico; (2) fiable para ciertas clases de productos químicos (p. ej., nitrosaminas y tintes de bencidina); (3) desarrollado a partir de datos biológicos pero no dependiente de experimentación biológica adicional | (1) no “biológico”; (2) muchas excepciones a las reglas formuladas; (3) retrospectivo y rara vez (pero llegando a ser) prospectivo |
| Inferencias basadas en mecanismos | (1) razonablemente precisa para ciertas clases de productos químicos; (2) permite refinamientos de hipótesis; (3) puede orientar las evaluaciones de riesgo a poblaciones sensibles | (1) mecanismos de carcinogénesis química indefinidos, múltiples y probablemente específicos de una clase o sustancia química; (2) puede no resaltar las excepciones a los mecanismos generales |
Justificación y base conceptual para los ensayos de toxicología genética
Aunque los tipos exactos y la cantidad de ensayos utilizados para la evaluación de la toxicidad genética están en constante evolución y varían de un país a otro, los más comunes incluyen ensayos para (1) mutaciones genéticas en bacterias y/o células de mamíferos cultivadas y (2) mutaciones cromosómicas en células de mamífero cultivadas y/o médula ósea dentro de ratones vivos. Algunos de los ensayos dentro de esta segunda categoría también pueden detectar aneuploidía. Aunque estos ensayos no detectan mutaciones en células germinales, se utilizan principalmente debido al costo adicional y la complejidad de realizar ensayos de células germinales. No obstante, los ensayos de células germinales en ratones se utilizan cuando se desea obtener información sobre los efectos de las células germinales.
Los estudios sistemáticos durante un período de 25 años (1970-1995), especialmente en el Programa Nacional de Toxicología de EE. UU. en Carolina del Norte, han resultado en el uso de un número discreto de ensayos para detectar la actividad mutagénica de los agentes. El fundamento para evaluar la utilidad de los ensayos se basó en su capacidad para detectar agentes que causan cáncer en roedores y que se sospecha que causan cáncer en humanos (es decir, carcinógenos). Esto se debe a que los estudios realizados durante las últimas décadas han indicado que las células cancerosas contienen mutaciones en ciertos genes y que muchos carcinógenos también son mutágenos. Por lo tanto, se considera que las células cancerosas contienen mutaciones de células somáticas, y la carcinogénesis se considera un tipo de mutagénesis de células somáticas.
Los ensayos de toxicidad genética que se utilizan más comúnmente en la actualidad se han seleccionado no solo por su gran base de datos, su costo relativamente bajo y su facilidad de ejecución, sino porque se ha demostrado que detectan muchos carcinógenos en roedores y, presumiblemente, en humanos. En consecuencia, los ensayos de toxicidad genética se utilizan para predecir la carcinogenicidad potencial de los agentes.
Un desarrollo conceptual y práctico importante en el campo de la toxicología genética fue el reconocimiento de que muchos carcinógenos fueron modificados por enzimas dentro del cuerpo, creando formas alteradas (metabolitos) que con frecuencia eran la forma carcinogénica y mutagénica final de la sustancia química original. Para duplicar este metabolismo en una placa de Petri, Heinrich Malling demostró que la inclusión de una preparación de hígado de roedor contenía muchas de las enzimas necesarias para realizar esta conversión o activación metabólica. Por lo tanto, muchos ensayos de toxicidad genética realizados en placas o tubos (in vitro) emplean la adición de preparaciones enzimáticas similares. Las preparaciones simples se denominan mezcla S9 y las preparaciones purificadas se denominan microsomas. Algunas células bacterianas y de mamíferos ahora han sido modificadas genéticamente para contener algunos de los genes de roedores o humanos que producen estas enzimas, lo que reduce la necesidad de agregar una mezcla S9 o microsomas.
Ensayos y técnicas de toxicología genética
Los principales sistemas bacterianos utilizados para la detección de toxicidad genética son el ensayo de mutagenicidad de Salmonella (Ames) y, en mucha menor medida, la cepa WP2 de Escherichia coli. Los estudios realizados a mediados de la década de 1980 indicaron que el uso de solo dos cepas del sistema de Salmonella (TA98 y TA100) fue suficiente para detectar aproximadamente el 90% de los mutágenos de Salmonella conocidos. Por lo tanto, estas dos cepas se utilizan para la mayoría de los fines de detección; sin embargo, varias otras cepas están disponibles para pruebas más extensas.
Estos ensayos se realizan de diversas formas, pero dos procedimientos generales son los ensayos de incorporación en placa y de suspensión líquida. En el ensayo de incorporación en placa, las células, la sustancia problema y (si se desea) el S9 se agregan en un agar licuado y se vierten sobre la superficie de una placa de Petri de agar. El agar superior se endurece en unos pocos minutos y las placas se incuban durante dos o tres días, después de lo cual las células mutantes han crecido para formar grupos de células detectables visualmente llamados colonias, que luego se cuentan. El medio de agar contiene agentes selectivos o está compuesto de ingredientes tales que solo crecerán las células recién mutadas. El ensayo de incubación líquida es similar, excepto que las células, el agente de prueba y S9 se incuban juntos en un líquido que no contiene agar licuado, y luego las células se lavan para eliminar el agente de prueba y S9 y se siembran en el agar.
Las mutaciones en células de mamífero cultivadas se detectan principalmente en uno de dos genes: hprt y tk. De manera similar a los ensayos bacterianos, las líneas celulares de mamíferos (desarrolladas a partir de células humanas o de roedores) se exponen al agente de prueba en placas o tubos de cultivo de plástico y luego se siembran en placas de cultivo que contienen un medio con un agente selectivo que permite que solo crezcan células mutantes. . Los ensayos utilizados para este propósito incluyen el CHO/HPRT, el TK6 y el linfoma de ratón L5178Y/TK+/- ensayos También se utilizan otras líneas celulares que contienen diversas mutaciones de reparación del ADN, así como algunos genes humanos implicados en el metabolismo. Estos sistemas permiten la recuperación de mutaciones dentro del gen (mutación del gen) así como mutaciones que involucran regiones del cromosoma que flanquean al gen (mutación cromosómica). Sin embargo, este último tipo de mutación es recuperada en mucha mayor medida por la tk sistemas de genes que por el hprt sistemas de genes debido a la ubicación de la tk .
Similar al ensayo de incubación líquida para mutagenicidad bacteriana, los ensayos de mutagenicidad en células de mamíferos generalmente implican la exposición de las células en placas o tubos de cultivo en presencia del agente de prueba y S9 durante varias horas. Luego, las células se lavan, se cultivan durante varios días más para permitir que los productos genéticos normales (de tipo salvaje) se degraden y los productos genéticos recién mutantes se expresen y acumulen, y luego se siembran en un medio que contiene un agente selectivo que permite sólo las células mutantes para crecer. Al igual que los ensayos bacterianos, las células mutantes crecen en colonias detectables visualmente que luego se cuentan.
La mutación cromosómica se identifica principalmente mediante ensayos citogenéticos, que implican la exposición de roedores y/o células humanas o de roedores en placas de cultivo a un producto químico de prueba, lo que permite que ocurran una o más divisiones celulares, la tinción de los cromosomas y luego el examen visual de los cromosomas a través de un microscopio. para detectar alteraciones en la estructura o número de cromosomas. Aunque se puede examinar una variedad de criterios de valoración, los dos que actualmente aceptan las agencias reguladoras como los más significativos son las aberraciones cromosómicas y una subcategoría llamada micronúcleos.
Se requiere una capacitación y experiencia considerables para evaluar la presencia de aberraciones cromosómicas en las células, lo que hace que este sea un procedimiento costoso en términos de tiempo y dinero. Por el contrario, los micronúcleos requieren poco entrenamiento y su detección puede automatizarse. Los micronúcleos aparecen como pequeños puntos dentro de la célula que son distintos del núcleo, que contiene los cromosomas. Los micronúcleos resultan de la rotura cromosómica o de la aneuploidía. Debido a la facilidad para calificar micronúcleos en comparación con las aberraciones cromosómicas, y debido a que estudios recientes indican que los agentes que inducen aberraciones cromosómicas en la médula ósea de ratones vivos generalmente inducen micronúcleos en este tejido, los micronúcleos ahora se miden comúnmente como una indicación de la capacidad de un agente para inducir la mutación cromosómica.
Aunque los ensayos de células germinales se usan con mucha menos frecuencia que los otros ensayos descritos anteriormente, son indispensables para determinar si un agente representa un riesgo para las células germinales, cuyas mutaciones pueden tener efectos en la salud de las generaciones futuras. Los ensayos de células germinales que se usan con más frecuencia son en ratones e involucran sistemas que detectan (1) translocaciones hereditarias (intercambios) entre cromosomas (ensayo de translocación heredable), (2) mutaciones genéticas o cromosómicas que involucran genes específicos (locus visible o bioquímico específico). ensayos), y (3) mutaciones que afectan la viabilidad (ensayo letal dominante). Al igual que con los ensayos de células somáticas, la suposición de trabajo con los ensayos de células germinales es que se presume que los agentes positivos en estos ensayos son mutágenos potenciales de células germinales humanas.
Estado actual y perspectivas futuras
Estudios recientes han indicado que solo se necesitaban tres piezas de información para detectar aproximadamente el 90% de un conjunto de 41 carcinógenos de roedores (es decir, presuntos carcinógenos humanos y mutágenos de células somáticas). Estos incluían (1) el conocimiento de la estructura química del agente, especialmente si contiene restos electrofílicos (ver la sección sobre relaciones estructura-actividad); (2) datos de mutagenicidad de Salmonella; y (3) datos de un ensayo de toxicidad crónica de 90 días en roedores (ratones y ratas). De hecho, esencialmente todos los carcinógenos humanos declarados por la IARC son detectables como mutágenos utilizando solo el ensayo de Salmonella y el ensayo de micronúcleo de médula ósea de ratón. El uso de estos ensayos de mutagenicidad para detectar carcinógenos humanos potenciales está respaldado por el hallazgo de que la mayoría de los carcinógenos humanos son carcinógenos tanto en ratas como en ratones (carcinógenos transespecies) y que la mayoría de los carcinógenos transespecies son mutagénicos en Salmonella y/o inducen micronúcleos. en médula ósea de ratón.
Con los avances en la tecnología del ADN, el proyecto del genoma humano y una mejor comprensión del papel de la mutación en el cáncer, se están desarrollando nuevos ensayos de genotoxicidad que probablemente se incorporarán a los procedimientos de detección estándar. Entre estos se encuentran el uso de células transgénicas y roedores. Los sistemas transgénicos son aquellos en los que se ha introducido un gen de otra especie en una célula u organismo. Por ejemplo, ahora se encuentran en uso experimental ratones transgénicos que permiten la detección de mutaciones en cualquier órgano o tejido del animal, basándose en la introducción de un gen bacteriano en el ratón. Las células bacterianas, como Salmonella, y las células de mamíferos (incluidas las líneas celulares humanas) ahora están disponibles y contienen genes implicados en el metabolismo de agentes cancerígenos/mutagénicos, como los genes P450. Análisis molecular de las mutaciones reales inducidas en el gen trans dentro de roedores transgénicos, o dentro de genes nativos como hprt, o los genes objetivo dentro de Salmonella ahora se pueden realizar, de modo que se pueda determinar la naturaleza exacta de las mutaciones inducidas por los productos químicos, proporcionando información sobre el mecanismo de acción del producto químico y permitiendo comparaciones con mutaciones en humanos presuntamente expuestos al agente. .
Los avances moleculares en citogenética ahora permiten una evaluación más detallada de las mutaciones cromosómicas. Estos incluyen el uso de sondas (pequeños fragmentos de ADN) que se adhieren (hibridan) a genes específicos. Los reordenamientos de genes en el cromosoma pueden revelarse luego por la ubicación alterada de las sondas, que son fluorescentes y se visualizan fácilmente como sectores coloreados en los cromosomas. El ensayo de electroforesis en gel unicelular para rotura de ADN (comúnmente llamado ensayo “cometa”) permite la detección de roturas de ADN dentro de células individuales y puede convertirse en una herramienta extremadamente útil en combinación con técnicas citogenéticas para detectar daño cromosómico.
Después de muchos años de uso y la generación de una gran base de datos desarrollada sistemáticamente, la evaluación de la toxicidad genética ahora se puede realizar con solo unos pocos ensayos a un costo relativamente pequeño en un período corto de tiempo (unas pocas semanas). Los datos producidos se pueden utilizar para predecir la capacidad de un agente para ser un roedor y, presumiblemente, carcinógeno humano/mutágeno de células somáticas. Tal capacidad hace posible limitar la introducción en el medio ambiente de agentes mutagénicos y cancerígenos y desarrollar agentes no mutagénicos alternativos. Los estudios futuros deberían conducir a métodos aún mejores con mayor predictibilidad que los ensayos actuales.