L'émergence de technologies sophistiquées en biologie moléculaire et cellulaire a stimulé une évolution relativement rapide dans les sciences de la vie, y compris la toxicologie. En effet, le centre d'intérêt de la toxicologie se déplace des animaux entiers et des populations d'animaux entiers vers les cellules et les molécules d'animaux et d'humains individuels. Depuis le milieu des années 1980, les toxicologues ont commencé à utiliser ces nouvelles méthodologies pour évaluer les effets des produits chimiques sur les systèmes vivants. En tant que progression logique, ces méthodes sont adaptées aux fins d'essais de toxicité. Ces avancées scientifiques se sont conjuguées à des facteurs sociaux et économiques pour modifier l'évaluation de la sécurité des produits et des risques potentiels.

Les facteurs économiques sont spécifiquement liés au volume de matériaux qui doivent être testés. Une multitude de nouveaux produits cosmétiques, pharmaceutiques, pesticides, chimiques et ménagers sont introduits sur le marché chaque année. Tous ces produits doivent être évalués pour leur toxicité potentielle. En outre, il existe un arriéré de produits chimiques déjà utilisés qui n'ont pas été suffisamment testés. L'énorme tâche d'obtenir des informations détaillées sur la sécurité de tous ces produits chimiques en utilisant des méthodes traditionnelles d'expérimentation sur des animaux entiers serait coûteuse en termes d'argent et de temps, si elle pouvait même être accomplie.

Il existe également des problèmes de société liés à la santé et à la sécurité publiques, ainsi qu'une préoccupation croissante du public concernant l'utilisation d'animaux pour les tests de sécurité des produits. En ce qui concerne la sécurité humaine, les groupes d'intérêt public et de défense de l'environnement ont exercé une pression importante sur les agences gouvernementales pour qu'elles appliquent des réglementations plus strictes sur les produits chimiques. Un exemple récent de cela a été un mouvement de certains groupes environnementaux pour interdire le chlore et les composés contenant du chlore aux États-Unis. L'une des motivations d'une telle action extrême réside dans le fait que la plupart de ces composés n'ont jamais été suffisamment testés. D'un point de vue toxicologique, le concept d'interdire toute une classe de produits chimiques divers sur la simple base de la présence de chlore est à la fois scientifiquement non fondé et irresponsable. Pourtant, il est compréhensible que du point de vue du public, il doit y avoir une certaine assurance que les produits chimiques rejetés dans l'environnement ne posent pas de risque important pour la santé. Une telle situation souligne la nécessité de méthodes plus efficaces et rapides pour évaluer la toxicité.

L'autre préoccupation sociétale qui a eu un impact sur le domaine des tests de toxicité est le bien-être animal. Le nombre croissant de groupes de protection des animaux à travers le monde ont exprimé une opposition considérable à l'utilisation d'animaux entiers pour les tests de sécurité des produits. Des campagnes actives ont été menées contre les fabricants de cosmétiques, de produits ménagers et de soins personnels et de produits pharmaceutiques pour tenter d'arrêter les tests sur les animaux. Ces efforts en Europe ont abouti à l'adoption du sixième amendement à la directive 76/768/CEE (la directive sur les cosmétiques). La conséquence de cette directive est que les produits cosmétiques ou les ingrédients cosmétiques qui ont été testés sur des animaux après le 1er janvier 1998 ne peuvent être commercialisés dans l'Union européenne, sauf si des méthodes alternatives sont insuffisamment validées. Bien que cette directive n'ait aucune compétence sur la vente de ces produits aux États-Unis ou dans d'autres pays, elle affectera de manière significative les entreprises qui ont des marchés internationaux qui incluent l'Europe.

La notion d'alternatives, qui est à la base du développement de tests autres que ceux sur animaux entiers, est définie par les trois Rs: réduction du nombre d'animaux utilisés; raffinement de protocoles pour que les animaux ressentent moins de stress ou d'inconfort ; et remplacement des tests actuels sur les animaux avec des tests in vitro (c'est-à-dire des tests effectués en dehors de l'animal vivant), des modèles informatiques ou des tests sur des vertébrés inférieurs ou des espèces d'invertébrés. Les trois Rs ont été introduits dans un livre publié en 1959 par deux scientifiques britanniques, WMS Russell et Rex Burch, Les principes de la technique expérimentale humaine. Russell et Burch ont soutenu que la seule façon d'obtenir des résultats scientifiques valables était le traitement humain des animaux et pensaient que des méthodes devraient être développées pour réduire l'utilisation des animaux et finalement la remplacer. Fait intéressant, les principes énoncés par Russell et Burch ont reçu peu d'attention jusqu'à la résurgence du mouvement de protection des animaux au milieu des années 1970. Aujourd'hui, le concept des trois Rs est très à l'avant-garde en matière de recherche, d'essais et d'éducation.

En résumé, le développement de méthodologies d'essais in vitro a été influencé par une variété de facteurs qui ont convergé au cours des dix à vingt dernières années. Il est difficile de déterminer si l'un de ces facteurs à lui seul aurait eu un effet aussi profond sur les stratégies d'essais de toxicité.

Concept des tests de toxicité in vitro

Cette section se concentrera uniquement sur les méthodes in vitro d'évaluation de la toxicité, comme l'une des alternatives aux tests sur l'animal entier. D'autres alternatives non animales telles que la modélisation informatique et les relations quantitatives structure-activité sont abordées dans d'autres articles de ce chapitre.

Les études in vitro sont généralement menées sur des cellules ou des tissus animaux ou humains à l'extérieur du corps. In vitro signifie littéralement « dans du verre », et fait référence à des procédures effectuées sur du matériel vivant ou des composants de matériel vivant cultivés dans des boîtes de Pétri ou dans des tubes à essai dans des conditions définies. Celles-ci peuvent être opposées aux études in vivo, ou celles réalisées « chez l'animal vivant ». Bien qu'il soit difficile, voire impossible, de projeter les effets d'un produit chimique sur un organisme complexe lorsque les observations se limitent à un seul type de cellules dans une boîte, les études in vitro fournissent également une quantité importante d'informations sur la toxicité intrinsèque. que les mécanismes cellulaires et moléculaires de la toxicité. De plus, elles offrent de nombreux avantages par rapport aux études in vivo en ce sens qu'elles sont généralement moins coûteuses et qu'elles peuvent être réalisées dans des conditions plus contrôlées. De plus, malgré le fait qu'un petit nombre d'animaux sont encore nécessaires pour obtenir des cellules pour les cultures in vitro, ces méthodes peuvent être considérées comme des alternatives de réduction (puisque beaucoup moins d'animaux sont utilisés par rapport aux études in vivo) et des alternatives de raffinement (car elles éliminent le besoin soumettre les animaux aux conséquences toxiques néfastes imposées par les expériences in vivo).

Afin d'interpréter les résultats des tests de toxicité in vitro, de déterminer leur utilité potentielle dans l'évaluation de la toxicité et de les relier au processus toxicologique global in vivo, il est nécessaire de comprendre quelle partie du processus toxicologique est examinée. L'ensemble du processus toxicologique consiste en des événements qui commencent par l'exposition de l'organisme à un agent physique ou chimique, progressent par des interactions cellulaires et moléculaires et se manifestent finalement dans la réponse de l'organisme entier. Les tests in vitro sont généralement limités à la partie du processus toxicologique qui se déroule au niveau cellulaire et moléculaire. Les types d'informations pouvant être obtenues à partir d'études in vitro comprennent les voies métaboliques, l'interaction des métabolites actifs avec des cibles cellulaires et moléculaires et des paramètres toxiques potentiellement mesurables qui peuvent servir de biomarqueurs moléculaires pour l'exposition. Dans une situation idéale, le mécanisme de toxicité de chaque produit chimique résultant de l'exposition à la manifestation de l'organisme serait connu, de sorte que les informations obtenues à partir des tests in vitro pourraient être entièrement interprétées et liées à la réponse de l'organisme entier. Cependant, cela est pratiquement impossible, puisque relativement peu de mécanismes toxicologiques complets ont été élucidés. Ainsi, les toxicologues sont confrontés à une situation dans laquelle les résultats d'un test in vitro ne peuvent pas être utilisés comme une prédiction entièrement précise de la toxicité in vivo car le mécanisme est inconnu. Cependant, fréquemment au cours du processus de développement d'un test in vitro, les composants du ou des mécanismes cellulaires et moléculaires de la toxicité sont élucidés.

L'une des principales questions non résolues entourant le développement et la mise en œuvre des tests in vitro est liée à la considération suivante : doivent-ils être basés sur des mécanismes ou suffit-il qu'ils soient descriptifs ? Il est incontestablement préférable, d'un point de vue scientifique, de n'utiliser que des tests basés sur des mécanismes pour remplacer les tests in vivo. Cependant, en l'absence de connaissances mécanistes complètes, la perspective de développer des tests in vitro pour remplacer complètement les tests sur des animaux entiers dans un avenir proche est presque nulle. Cela n'exclut toutefois pas l'utilisation de types de tests plus descriptifs comme outils de dépistage précoce, ce qui est le cas actuellement. Ces écrans ont entraîné une réduction significative de l'utilisation des animaux. Par conséquent, jusqu'à ce que des informations plus mécanistes soient générées, il peut être nécessaire d'employer, dans une mesure plus limitée, des tests dont les résultats sont simplement bien corrélés avec ceux obtenus in vivo.

Tests in vitro de cytotoxicité

Dans cette section, plusieurs tests in vitro qui ont été développés pour évaluer le potentiel cytotoxique d'un produit chimique seront décrits. Pour la plupart, ces tests sont faciles à réaliser et l'analyse peut être automatisée. Un test in vitro couramment utilisé pour la cytotoxicité est le test au rouge neutre. Ce test est effectué sur des cellules en culture et, pour la plupart des applications, les cellules peuvent être maintenues dans des boîtes de culture contenant 96 petits puits de 6.4 mm de diamètre chacun. Étant donné que chaque puits peut être utilisé pour une seule détermination, cet arrangement peut accueillir plusieurs concentrations du produit chimique d'essai ainsi que des contrôles positifs et négatifs avec un nombre suffisant de répétitions pour chacun. Après traitement des cellules avec diverses concentrations du produit chimique d'essai allant d'au moins deux ordres de grandeur (par exemple, de 0.01 mM à 1 mM), ainsi que des produits chimiques témoins positifs et négatifs, les cellules sont rincées et traitées avec du rouge neutre, un colorant qui ne peut être absorbé et retenu que par les cellules vivantes. Le colorant peut être ajouté lors du retrait du produit chimique d'essai pour déterminer les effets immédiats, ou il peut être ajouté à différents moments après le retrait du produit chimique d'essai pour déterminer les effets cumulatifs ou différés. L'intensité de la couleur dans chaque puits correspond au nombre de cellules vivantes dans ce puits. L'intensité de la couleur est mesurée par un spectrophotomètre qui peut être équipé d'un lecteur de plaques. Le lecteur de plaque est programmé pour fournir des mesures individuelles pour chacun des 96 puits de la boîte de culture. Cette méthodologie automatisée permet à l'investigateur d'effectuer rapidement une expérience concentration-réponse et d'obtenir des données statistiquement utiles.

Un autre test relativement simple de cytotoxicité est le test MTT. Le MTT (bromure de 3[4,5-diméthylthiazol-2-yl]-2,5-diphényltétrazolium) est un colorant tétrazolium qui est réduit par les enzymes mitochondriales à une couleur bleue. Seules les cellules possédant des mitochondries viables conserveront la capacité de réaliser cette réaction ; par conséquent, l'intensité de la couleur est directement liée au degré d'intégrité mitochondriale. Il s'agit d'un test utile pour détecter les composés cytotoxiques généraux ainsi que les agents qui ciblent spécifiquement les mitochondries.

La mesure de l'activité de la lactate déshydrogénase (LDH) est également utilisée comme test à grande échelle pour la cytotoxicité. Cette enzyme est normalement présente dans le cytoplasme des cellules vivantes et est libérée dans le milieu de culture cellulaire par les membranes cellulaires non étanches des cellules mortes ou mourantes qui ont été affectées par un agent toxique. De petites quantités de milieu de culture peuvent être retirées à divers moments après le traitement chimique des cellules pour mesurer la quantité de LDH libérée et déterminer une évolution temporelle de la toxicité. Bien que le test de libération de LDH soit une évaluation très générale de la cytotoxicité, il est utile car il est facile à réaliser et peut être effectué en temps réel.

De nombreuses nouvelles méthodes sont en cours de développement pour détecter les dommages cellulaires. Des méthodes plus sophistiquées utilisent des sondes fluorescentes pour mesurer une variété de paramètres intracellulaires, tels que la libération de calcium et les changements de pH et de potentiel de membrane. En général, ces sondes sont très sensibles et peuvent détecter des changements cellulaires plus subtils, réduisant ainsi la nécessité d'utiliser la mort cellulaire comme point final. De plus, bon nombre de ces tests fluorescents peuvent être automatisés par l'utilisation de plaques à 96 puits et de lecteurs de plaques fluorescentes.

Une fois que des données ont été recueillies sur une série de produits chimiques à l'aide de l'un de ces tests, les toxicités relatives peuvent être déterminées. La toxicité relative d'un produit chimique, telle que déterminée dans un essai in vitro, peut être exprimée comme la concentration qui exerce un effet de 50 % sur la réponse finale des cellules non traitées. Cette détermination est appelée CE₅₀ (Effectif Conconcentration pour 50% des cellules) et peut être utilisé pour comparer les toxicités de différents produits chimiques in vitro. (Un terme similaire utilisé pour évaluer la toxicité relative est IC₅₀, indiquant la concentration d'un produit chimique qui provoque une inhibition de 50% d'un processus cellulaire, par exemple, la capacité d'absorber le rouge neutre.) Il n'est pas facile d'évaluer si la toxicité relative in vitro des produits chimiques est comparable à leur relative dans toxicités in vivo, car il existe de nombreux facteurs de confusion dans le système in vivo, tels que la toxicocinétique, le métabolisme, les mécanismes de réparation et de défense. De plus, étant donné que la plupart de ces tests mesurent les paramètres généraux de cytotoxicité, ils ne sont pas basés sur des mécanismes. Par conséquent, l'accord entre les toxicités relatives in vitro et in vivo est simplement corrélatif. Malgré les nombreuses complexités et difficultés d'extrapolation d'in vitro à in vivo, ces tests in vitro s'avèrent très précieux car ils sont simples et peu coûteux à réaliser et peuvent être utilisés comme écrans pour signaler des médicaments ou des produits chimiques hautement toxiques aux premiers stades de la développement.

Toxicité pour les organes cibles

Des tests in vitro peuvent également être utilisés pour évaluer la toxicité spécifique d'un organe cible. Il existe un certain nombre de difficultés associées à la conception de tels tests, la plus notable étant l'incapacité des systèmes in vitro à conserver de nombreuses caractéristiques de l'organe in vivo. Fréquemment, lorsque des cellules sont prélevées sur des animaux et placées en culture, elles ont tendance soit à dégénérer rapidement et/ou à se dédifférencier, c'est-à-dire à perdre leurs fonctions d'organe et à devenir plus génériques. Cela pose un problème en ce que dans un court laps de temps, généralement quelques jours, les cultures ne sont plus utiles pour évaluer les effets spécifiques d'un organe d'une toxine.

Beaucoup de ces problèmes sont en train d'être surmontés grâce aux progrès récents de la biologie moléculaire et cellulaire. Les informations obtenues sur l'environnement cellulaire in vivo peuvent être utilisées pour moduler les conditions de culture in vitro. Depuis le milieu des années 1980, de nouveaux facteurs de croissance et cytokines ont été découverts, et nombre d'entre eux sont maintenant disponibles dans le commerce. L'ajout de ces facteurs aux cellules en culture aide à préserver leur intégrité et peut également aider à conserver des fonctions plus différenciées pendant de plus longues périodes. D'autres études fondamentales ont permis d'approfondir la connaissance des besoins nutritionnels et hormonaux des cellules en culture, permettant de formuler de nouveaux milieux. Des progrès récents ont également été réalisés dans l'identification de matrices extracellulaires naturelles et artificielles sur lesquelles des cellules peuvent être cultivées. La culture de cellules sur ces différentes matrices peut avoir des effets profonds à la fois sur leur structure et leur fonction. Un avantage majeur dérivé de cette connaissance est la capacité de contrôler de manière complexe l'environnement des cellules en culture et d'examiner individuellement les effets de ces facteurs sur les processus cellulaires de base et sur leurs réponses à différents agents chimiques. En bref, ces systèmes peuvent fournir un excellent aperçu des mécanismes de toxicité spécifiques aux organes.

De nombreuses études de toxicité pour les organes cibles sont menées dans des cellules primaires, qui par définition sont fraîchement isolées d'un organe et présentent généralement une durée de vie finie en culture. Il y a de nombreux avantages à avoir des cultures primaires d'un seul type de cellule à partir d'un organe pour l'évaluation de la toxicité. D'un point de vue mécaniste, de telles cultures sont utiles pour étudier des cibles cellulaires spécifiques d'un produit chimique. Dans certains cas, deux ou plusieurs types de cellules d'un organe peuvent être cultivés ensemble, ce qui offre un avantage supplémentaire de pouvoir examiner les interactions cellule-cellule en réponse à une toxine. Certains systèmes de co-culture pour la peau ont été conçus de sorte qu'ils forment une structure tridimensionnelle ressemblant à la peau in vivo. Il est également possible de co-culturer des cellules de différents organes, par exemple le foie et les reins. Ce type de culture serait utile pour évaluer les effets propres aux cellules rénales d'une substance chimique qui doit être bioactivée dans le foie.

Les outils de biologie moléculaire ont également joué un rôle important dans le développement de lignées cellulaires continues qui peuvent être utiles pour les tests de toxicité sur les organes cibles. Ces lignées cellulaires sont générées en transfectant de l'ADN dans des cellules primaires. Dans la procédure de transfection, les cellules et l'ADN sont traités de sorte que l'ADN puisse être absorbé par les cellules. L'ADN provient généralement d'un virus et contient un gène ou des gènes qui, lorsqu'ils sont exprimés, permettent aux cellules de s'immortaliser (c'est-à-dire capables de vivre et de croître pendant de longues périodes de temps en culture). L'ADN peut également être modifié de manière à ce que le gène immortalisant soit contrôlé par un promoteur inductible. L'avantage de ce type de construction est que les cellules ne se diviseront que lorsqu'elles recevront le stimulus chimique approprié pour permettre l'expression du gène immortalisant. Un exemple d'une telle construction est le grand gène de l'antigène T du virus simien 40 (SV40) (le gène immortalisant), précédé de la région promotrice du gène de la métallothionéine, qui est induite par la présence d'un métal dans le milieu de culture. Ainsi, après que le gène est transfecté dans les cellules, les cellules peuvent être traitées avec de faibles concentrations de zinc pour stimuler le promoteur MT et activer l'expression du gène de l'antigène T. Dans ces conditions, les cellules prolifèrent. Lorsque le zinc est éliminé du milieu, les cellules arrêtent de se diviser et, dans des conditions idéales, reviennent à un état où elles expriment leurs fonctions spécifiques aux tissus.

La capacité de générer des cellules immortalisées combinée aux progrès de la technologie de la culture cellulaire a grandement contribué à la création de lignées cellulaires à partir de nombreux organes différents, notamment le cerveau, les reins et le foie. Cependant, avant que ces lignées cellulaires puissent être utilisées comme substitut des types de cellules authentiques, elles doivent être soigneusement caractérisées pour déterminer à quel point elles sont vraiment « normales ».

D'autres systèmes in vitro pour étudier la toxicité d'un organe cible impliquent une complexité croissante. Au fur et à mesure que les systèmes in vitro progressent en complexité, de la cellule unique à la culture d'organes entiers, ils deviennent plus comparables au milieu in vivo, mais en même temps, ils deviennent beaucoup plus difficiles à contrôler compte tenu du nombre accru de variables. Par conséquent, ce qui peut être gagné en passant à un niveau supérieur d'organisation peut être perdu dans l'incapacité du chercheur à contrôler l'environnement expérimental. Le tableau 1 compare certaines des caractéristiques de divers systèmes in vitro qui ont été utilisés pour étudier l'hépatotoxicité.

Tableau 1. Comparaison des systèmes in vitro pour les études d'hépatotoxicité

Les tranches de tissu coupées avec précision sont utilisées plus largement pour les études toxicologiques. Il existe de nouveaux instruments disponibles qui permettent au chercheur de couper des tranches de tissu uniformes dans un environnement stérile. Les tranches de tissu offrent un certain avantage par rapport aux systèmes de culture cellulaire en ce que tous les types de cellules de l'organe sont présents et qu'ils conservent leur architecture in vivo et leur communication intercellulaire. Ainsi, des études in vitro peuvent être menées pour déterminer le type de cellule cible dans un organe ainsi que pour étudier la toxicité spécifique d'un organe cible. Un inconvénient des tranches est qu'elles dégénèrent rapidement après les premières 24 heures de culture, principalement en raison d'une mauvaise diffusion de l'oxygène vers les cellules à l'intérieur des tranches. Cependant, des études récentes ont indiqué qu'une aération plus efficace peut être obtenue par une rotation douce. Ceci, associé à l'utilisation d'un milieu plus complexe, permet aux tranches de survivre jusqu'à 96 heures.

Les explants de tissus sont similaires dans leur concept aux tranches de tissus et peuvent également être utilisés pour déterminer la toxicité de produits chimiques dans des organes cibles spécifiques. Les explants de tissus sont établis en prélevant un petit morceau de tissu (pour les études de tératogénicité, un embryon intact) et en le plaçant en culture pour une étude plus approfondie. Les cultures d'explants ont été utiles pour les études de toxicité à court terme, y compris l'irritation et la corrosivité de la peau, les études sur l'amiante dans la trachée et les études de neurotoxicité dans les tissus cérébraux.

Des organes perfusés isolés peuvent également être utilisés pour évaluer la toxicité des organes cibles. Ces systèmes offrent un avantage similaire à celui des tranches de tissu et des explants en ce que tous les types de cellules sont présents, mais sans le stress sur le tissu introduit par les manipulations impliquées dans la préparation des tranches. De plus, ils permettent le maintien des interactions intra-organes. Un inconvénient majeur est leur viabilité à court terme, ce qui limite leur utilisation pour les tests de toxicité in vitro. En termes de service d'alternative, ces cultures peuvent être considérées comme un raffinement puisque les animaux ne subissent pas les conséquences néfastes d'un traitement in vivo avec des substances toxiques. Cependant, leur utilisation ne diminue pas de manière significative le nombre d'animaux nécessaires.

En résumé, il existe plusieurs types de systèmes in vitro disponibles pour évaluer la toxicité des organes cibles. Il est possible d'acquérir de nombreuses informations sur les mécanismes de toxicité en utilisant une ou plusieurs de ces techniques. La difficulté reste de savoir extrapoler d'un système in vitro, qui représente une part relativement faible du processus toxicologique, à l'ensemble du processus se déroulant in vivo.

Tests in vitro pour l'irritation oculaire

Le test de toxicité sur l'animal entier le plus controversé du point de vue du bien-être animal est peut-être le test de Draize pour l'irritation des yeux, qui est effectué sur des lapins. Dans ce test, une petite dose fixe d'un produit chimique est placée dans l'un des yeux du lapin tandis que l'autre œil est utilisé comme témoin. Le degré d'irritation et d'inflammation est évalué à différents moments après l'exposition. Un effort important est fait pour développer des méthodologies pour remplacer ce test, qui a été critiqué non seulement pour des raisons humanitaires, mais aussi en raison de la subjectivité des observations et de la variabilité des résultats. Il est intéressant de noter que malgré les sévères critiques que le test de Draize a reçues, il s'est avéré remarquablement efficace pour prédire les irritants oculaires humains, en particulier les substances légèrement à modérément irritantes, qui sont difficiles à identifier par d'autres méthodes. Ainsi, les demandes sur les alternatives in vitro sont grandes.

La recherche d'alternatives au test de Draize est compliquée, même si elle devrait être couronnée de succès. De nombreuses alternatives in vitro et autres ont été développées et, dans certains cas, elles ont été mises en œuvre. Les alternatives de raffinement au test de Draize, qui, par définition, sont moins douloureuses ou stressantes pour les animaux, comprennent le test oculaire à faible volume, dans lequel de plus petites quantités de matériel de test sont placées dans les yeux des lapins, non seulement pour des raisons humanitaires, mais pour imiter plus fidèlement les quantités auxquelles les personnes peuvent être accidentellement exposées. Un autre raffinement est que les substances qui ont un pH inférieur à 2 ou supérieur à 11.5 ne sont plus testées sur les animaux car elles sont connues pour être sévèrement irritantes pour les yeux.

Entre 1980 et 1989, il y a eu une baisse estimée à 87 % du nombre de lapins utilisés pour les tests d'irritation oculaire des cosmétiques. Des tests in vitro ont été incorporés dans le cadre d'une approche de test à plusieurs niveaux pour provoquer cette vaste réduction des tests sur des animaux entiers. Cette approche est un processus en plusieurs étapes qui commence par un examen approfondi des données historiques sur l'irritation oculaire et une analyse physique et chimique du produit chimique à évaluer. Si ces deux processus ne fournissent pas suffisamment d'informations, une batterie de tests in vitro est réalisée. Les données supplémentaires obtenues à partir des tests in vitro pourraient alors être suffisantes pour évaluer la sécurité de la substance. Si ce n'est pas le cas, la dernière étape consisterait à effectuer des tests in vivo limités. Il est facile de voir comment cette approche peut éliminer ou au moins réduire considérablement le nombre d'animaux nécessaires pour prédire l'innocuité d'une substance d'essai.

La batterie de tests in vitro utilisée dans le cadre de cette stratégie de tests à plusieurs niveaux dépend des besoins de l'industrie en question. Les tests d'irritation oculaire sont effectués par une grande variété d'industries, des cosmétiques aux produits pharmaceutiques en passant par les produits chimiques industriels. Le type d'informations requises par chaque industrie varie et il n'est donc pas possible de définir une seule batterie de tests in vitro. Une batterie de tests est généralement conçue pour évaluer cinq paramètres : la cytotoxicité, les modifications de la physiologie et de la biochimie des tissus, les relations quantitatives structure-activité, les médiateurs de l'inflammation, ainsi que la récupération et la réparation. Un exemple de test de cytotoxicité, qui est une cause possible d'irritation, est le test au rouge neutre utilisant des cellules en culture (voir ci-dessus). Les modifications de la physiologie cellulaire et de la biochimie résultant de l'exposition à un produit chimique peuvent être dosées dans des cultures de cellules épithéliales cornéennes humaines. Alternativement, les enquêteurs ont également utilisé des globes oculaires de bovin ou de poulet intacts ou disséqués provenant d'abattoirs. De nombreux paramètres mesurés dans ces cultures d'organes entiers sont les mêmes que ceux mesurés in vivo, tels que l'opacité cornéenne et le gonflement cornéen.

L'inflammation est souvent une composante des lésions oculaires induites par des produits chimiques, et il existe un certain nombre de tests disponibles pour examiner ce paramètre. Divers dosages biochimiques détectent la présence de médiateurs libérés au cours du processus inflammatoire tels que l'acide arachidonique et les cytokines. La membrane chorioallantoïque (CAM) de l'œuf de poule peut également être utilisée comme indicateur d'inflammation. Dans le test CAM, un petit morceau de la coquille d'un embryon de poulet de dix à 14 jours est retiré pour exposer le CAM. Le produit chimique est ensuite appliqué sur la CAM et les signes d'inflammation, tels qu'une hémorragie vasculaire, sont notés à divers moments par la suite.

L'un des processus in vivo les plus difficiles à évaluer in vitro est la récupération et la réparation des lésions oculaires. Un instrument nouvellement développé, le microphysiomètre au silicium, mesure de petits changements dans le pH extracellulaire et peut être utilisé pour surveiller les cellules cultivées en temps réel. Cette analyse s'est avérée assez bien corrélée avec la récupération in vivo et a été utilisée comme test in vitro pour ce processus. Ceci a été un bref aperçu des types de tests utilisés comme alternatives au test de Draize pour l'irritation oculaire. Il est probable qu'au cours des prochaines années, une série complète de batteries de tests in vitro sera définie et chacune sera validée pour son objectif spécifique.

Validation

La clé de l'acceptation réglementaire et de la mise en œuvre des méthodologies de test in vitro est la validation, le processus par lequel la crédibilité d'un test candidat est établie dans un but spécifique. Des efforts pour définir et coordonner le processus de validation ont été faits tant aux États-Unis qu'en Europe. L'Union européenne a créé le Centre européen pour la validation des méthodes alternatives (ECVAM) en 1993 pour y coordonner les efforts et interagir avec des organisations américaines telles que le Johns Hopkins Center for Alternatives to Animal Testing (CAAT), un centre universitaire aux États-Unis. , et l'Interagency Coordinating Committee for the Validation of Alternative Methods (ICCVAM), composé de représentants des National Institutes of Health, de l'Environmental Protection Agency des États-Unis, de la Food and Drug Administration des États-Unis et de la Consumer Products Safety Commission.

La validation des tests in vitro nécessite une organisation et une planification importantes. Il doit y avoir un consensus entre les régulateurs gouvernementaux et les scientifiques industriels et universitaires sur les procédures acceptables, et une surveillance suffisante par un conseil consultatif scientifique pour s'assurer que les protocoles respectent les normes établies. Les études de validation doivent être réalisées dans une série de laboratoires de référence à l'aide d'ensembles étalonnés de produits chimiques provenant d'une banque de produits chimiques et de cellules ou de tissus provenant d'une source unique. La répétabilité intralaboratoire et la reproductibilité interlaboratoire d'un test candidat doivent être démontrées et les résultats soumis à une analyse statistique appropriée. Une fois les résultats des différentes composantes des études de validation compilés, le comité consultatif scientifique peut faire des recommandations sur la validité du ou des tests candidats dans un but précis. De plus, les résultats des études devraient être publiés dans des revues à comité de lecture et placés dans une base de données.

La définition du processus de validation est actuellement un travail en cours. Chaque nouvelle étude de validation apportera des informations utiles à la conception de l'étude suivante. La communication et la coopération internationales sont essentielles pour le développement rapide d'une série de protocoles largement acceptables, en particulier compte tenu de l'urgence accrue imposée par l'adoption de la directive CE sur les cosmétiques. Cette législation peut en effet donner l'impulsion nécessaire pour qu'un sérieux effort de validation soit entrepris. Ce n'est qu'après l'achèvement de ce processus que l'acceptation des méthodes in vitro par les diverses communautés réglementaires peut commencer.

Conclusion

Cet article a fourni un large aperçu de l'état actuel des tests de toxicité in vitro. La science de la toxicologie in vitro est relativement jeune, mais elle connaît une croissance exponentielle. Le défi pour les années à venir est d'intégrer les connaissances mécanistes générées par les études cellulaires et moléculaires dans le vaste inventaire des données in vivo pour fournir une description plus complète des mécanismes toxicologiques ainsi que pour établir un paradigme par lequel les données in vitro peuvent être utilisées. prédire la toxicité in vivo. Ce ne sera que grâce aux efforts concertés des toxicologues et des représentants gouvernementaux que la valeur intrinsèque de ces méthodes in vitro pourra être réalisée.

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L'analyse des relations structure-activité (SAR) consiste à utiliser des informations sur la structure moléculaire des produits chimiques pour prédire des caractéristiques importantes liées à la persistance, à la distribution, à l'absorption et à l'absorption et à la toxicité. Le SAR est une méthode alternative d'identification des produits chimiques potentiellement dangereux, qui promet d'aider les industries et les gouvernements à hiérarchiser les substances pour une évaluation plus approfondie ou pour la prise de décision à un stade précoce pour de nouveaux produits chimiques. La toxicologie est une entreprise de plus en plus coûteuse et gourmande en ressources. Les préoccupations croissantes concernant le potentiel des produits chimiques à causer des effets néfastes sur les populations humaines exposées ont incité les organismes de réglementation et de santé à élargir la gamme et la sensibilité des tests pour détecter les risques toxicologiques. Dans le même temps, les charges réelles et perçues de la réglementation sur l'industrie ont suscité des inquiétudes quant à l'aspect pratique des méthodes d'essais de toxicité et de l'analyse des données. À l'heure actuelle, la détermination de la cancérogénicité chimique dépend de tests sur la durée de vie d'au moins deux espèces, des deux sexes, à plusieurs doses, avec une analyse histopathologique minutieuse de plusieurs organes, ainsi que la détection de changements prénéoplasiques dans les cellules et les organes cibles. Aux États-Unis, on estime que le test biologique du cancer coûte plus de 3 millions de dollars (dollars de 1995).

Même avec des ressources financières illimitées, la charge de tester les quelque 70,000 1984 produits chimiques existants produits dans le monde aujourd'hui dépasserait les ressources disponibles des toxicologues qualifiés. Des siècles seraient nécessaires pour réaliser ne serait-ce qu'une évaluation de premier niveau de ces produits chimiques (NRC 1993). Dans de nombreux pays, les préoccupations éthiques concernant l'utilisation d'animaux dans les tests de toxicité ont augmenté, ce qui exerce des pressions supplémentaires sur l'utilisation des méthodes standard de test de toxicité. Le SAR a été largement utilisé dans l'industrie pharmaceutique pour identifier les molécules ayant un potentiel d'utilisation bénéfique dans le traitement (Hansch et Zhang 1979). Dans la politique de santé environnementale et professionnelle, le SAR est utilisé pour prédire la dispersion des composés dans l'environnement physico-chimique et pour sélectionner de nouveaux produits chimiques pour une évaluation plus approfondie de la toxicité potentielle. En vertu de la Toxic Substances Control Act (TSCA) des États-Unis, l'EPA utilise depuis 5 une approche SAR comme « premier crible » des nouveaux produits chimiques dans le processus de notification avant fabrication (PMN) ; L'Australie utilise une approche similaire dans le cadre de sa procédure de notification des nouveaux produits chimiques (NICNAS). Aux États-Unis, l'analyse SAR est une base importante pour déterminer qu'il existe une base raisonnable pour conclure que la fabrication, le traitement, la distribution, l'utilisation ou l'élimination de la substance présentera un risque déraisonnable de préjudice pour la santé humaine ou l'environnement, comme l'exige la section 6(f) de la TSCA. Sur la base de cette découverte, l'EPA peut alors exiger des tests réels de la substance en vertu de la section XNUMX de la TSCA.

Justification du SAR

La justification scientifique du SAR est basée sur l'hypothèse que la structure moléculaire d'un produit chimique prédira des aspects importants de son comportement dans les systèmes physico-chimiques et biologiques (Hansch et Leo 1979).

Processus SAR

Le processus d'examen SAR comprend l'identification de la structure chimique, y compris les formulations empiriques ainsi que le composé pur ; identification de substances structurellement analogues ; rechercher des bases de données et de la littérature pour obtenir des informations sur les analogues structuraux ; et l'analyse de la toxicité et d'autres données sur les analogues structuraux. Dans de rares cas, les informations sur la structure du composé à elles seules peuvent être suffisantes pour étayer certaines analyses SAR, basées sur des mécanismes de toxicité bien compris. Plusieurs bases de données sur le SAR ont été compilées, ainsi que des méthodes informatiques pour la prédiction de la structure moléculaire.

Avec ces informations, les paramètres suivants peuvent être estimés avec SAR :

• paramètres physico-chimiques : point d'ébullition, pression de vapeur, solubilité dans l'eau, coefficient de partage octanol/eau
• paramètres du devenir biologique/environnemental : biodégradation, sorption dans le sol, photodégradation, pharmacocinétique
• paramètres de toxicité : toxicité pour les organismes aquatiques, absorption, toxicité aiguë pour les mammifères (test limite ou LD₅₀), irritation cutanée, pulmonaire et oculaire, sensibilisation, toxicité subchronique, mutagénicité.

Il convient de noter qu'il n'existe pas de méthodes SAR pour des paramètres de santé aussi importants que la cancérogénicité, la toxicité pour le développement, la toxicité pour la reproduction, la neurotoxicité, l'immunotoxicité ou d'autres effets sur les organes cibles. Cela est dû à trois facteurs : l'absence d'une grande base de données sur laquelle tester les hypothèses SAR, le manque de connaissances sur les déterminants structurels de l'action toxique et la multiplicité des cellules cibles et des mécanismes impliqués dans ces paramètres (voir "The United States approche d'évaluation des risques des substances toxiques pour la reproduction et des agents neurotoxiques »). Quelques tentatives limitées d'utilisation du SAR pour prédire la pharmacocinétique en utilisant des informations sur les coefficients de partage et la solubilité (Johanson et Naslund 1988). Un SAR quantitatif plus étendu a été réalisé pour prédire le métabolisme dépendant du P450 d'une gamme de composés et la liaison des molécules de type dioxine et PCB au récepteur cytosolique de la « dioxine » (Hansch et Zhang 1993).

Il a été démontré que le DAS a une prévisibilité variable pour certains des paramètres énumérés ci-dessus, comme indiqué dans le tableau 1. Ce tableau présente les données de deux comparaisons de l'activité prévue avec les résultats réels obtenus par des mesures empiriques ou des tests de toxicité. Le SAR, tel qu'il a été mené par des experts de l'US EPA, a obtenu de moins bons résultats pour prédire les propriétés physico-chimiques que pour prédire l'activité biologique, y compris la biodégradation. Pour les paramètres de toxicité, le SAR a obtenu les meilleurs résultats pour prédire la mutagénicité. Ashby et Tennant (1991) dans une étude plus approfondie ont également trouvé une bonne prévisibilité de la génotoxicité à court terme dans leur analyse des produits chimiques NTP. Ces résultats ne sont pas surprenants, compte tenu des connaissances actuelles sur les mécanismes moléculaires de la génotoxicité (voir « Toxicologie génétique ») et le rôle de l'électrophilie dans la liaison à l'ADN. En revanche, le SAR avait tendance à sous-estimer la toxicité systémique et subchronique chez les mammifères et à surestimer la toxicité aiguë pour les organismes aquatiques.

Tableau 1. Comparaison des données SAR et des tests : analyses OCDE/NTP

Source : Données de l'OCDE, communication personnelle C. Auer, US EPA. Seuls les paramètres pour lesquels des prédictions de DAS comparables et des données de test réelles étaient disponibles ont été utilisés dans cette analyse. Les données du NTP proviennent d'Ashby et Tennant 1991.

¹ L'incapacité du SAR à prédire la toxicité aiguë de 12 % des produits chimiques testés était préoccupante.

² Données OCDE, basées sur la concordance du test d'Ames avec le DAS

³ Données du NTP, basées sur des analyses de genetox comparées aux prévisions de DAS pour plusieurs classes de « produits chimiques structurellement alertants ».

⁴ La concordance varie selon la classe; la concordance la plus élevée était avec les composés amino/nitro aromatiques; le plus bas avec des structures « diverses ».

Pour d'autres paramètres toxiques, comme indiqué ci-dessus, le DAS a une utilité moins démontrable. Les prévisions de toxicité pour les mammifères sont compliquées par le manque de SAR pour la toxicocinétique des molécules complexes. Néanmoins, certaines tentatives ont été faites pour proposer des principes SAR pour des critères complexes de toxicité pour les mammifères (par exemple, voir Bernstein (1984) pour une analyse SAR des substances potentiellement toxiques pour la reproduction mâle). Dans la plupart des cas, la base de données est trop petite pour permettre des tests rigoureux des prédictions basées sur la structure.

À ce stade, on peut conclure que le SAR peut être utile principalement pour hiérarchiser l'investissement dans les ressources d'essais de toxicité ou pour soulever rapidement des préoccupations concernant un danger potentiel. Ce n'est qu'en cas de mutagénicité qu'il est probable que l'analyse SAR en elle-même puisse être utilisée avec fiabilité pour éclairer d'autres décisions. Pour aucun effet, il est probable que le DAS puisse fournir le type d'informations quantitatives requises à des fins d'évaluation des risques, comme indiqué ailleurs dans ce chapitre et Encyclopédie.

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