La tossicologia svolge un ruolo importante nello sviluppo di regolamenti e altre politiche di salute sul lavoro. Al fine di prevenire gli infortuni sul lavoro e le malattie professionali, le decisioni sono sempre più basate su informazioni ottenibili prima o in assenza dei tipi di esposizione umana che fornirebbero informazioni definitive sul rischio, come gli studi epidemiologici. Inoltre, gli studi tossicologici, descritti in questo capitolo, possono fornire informazioni precise sulla dose e sulla risposta nelle condizioni controllate della ricerca di laboratorio; queste informazioni sono spesso difficili da ottenere nel contesto incontrollato delle esposizioni professionali. Tuttavia, queste informazioni devono essere attentamente valutate al fine di stimare la probabilità di effetti avversi nell'uomo, la natura di questi effetti avversi e la relazione quantitativa tra esposizioni ed effetti.

Particolare attenzione è stata prestata in molti paesi, sin dagli anni '1980, allo sviluppo di metodi oggettivi per l'utilizzo delle informazioni tossicologiche nel processo decisionale normativo. Metodi formali, spesso indicati come valutazione del rischio, sono stati proposti e utilizzati in questi paesi da enti sia governativi che non governativi. La valutazione del rischio è stata variamente definita; fondamentalmente si tratta di un processo di valutazione che incorpora informazioni tossicologiche, epidemiologiche e sull'esposizione per identificare e stimare la probabilità di effetti avversi associati all'esposizione a sostanze o condizioni pericolose. La valutazione del rischio può essere di natura qualitativa, indicando la natura di un effetto avverso e una stima generale della probabilità, oppure può essere quantitativa, con stime del numero di persone interessate a specifici livelli di esposizione. In molti sistemi normativi, la valutazione del rischio si svolge in quattro fasi: identificazione dei pericoli, la descrizione della natura dell'effetto tossico; valutazione dose-risposta, un'analisi semi-quantitativa o quantitativa del rapporto tra esposizione (o dose) e gravità o probabilità di effetto tossico; valutazione dell'esposizione, la valutazione delle informazioni sulla gamma di esposizioni che possono verificarsi per le popolazioni in generale o per sottogruppi all'interno delle popolazioni; caratterizzazione del rischio, la compilazione di tutte le informazioni di cui sopra in un'espressione dell'entità del rischio che si prevede si verificherà in condizioni di esposizione specificate (vedi CNR 1983 per una dichiarazione di questi principi).

In questa sezione, vengono presentati tre approcci alla valutazione del rischio a scopo illustrativo. È impossibile fornire un compendio completo dei metodi di valutazione del rischio utilizzati in tutto il mondo e queste selezioni non devono essere considerate prescrittive. Va notato che ci sono tendenze verso l'armonizzazione dei metodi di valutazione del rischio, in parte in risposta alle disposizioni dei recenti accordi GATT. Sono attualmente in corso due processi di armonizzazione internazionale dei metodi di valutazione del rischio, attraverso il Programma internazionale sulla sicurezza chimica (IPCS) e l'Organizzazione per la cooperazione e lo sviluppo economico (OCSE). Queste organizzazioni mantengono anche informazioni aggiornate sugli approcci nazionali alla valutazione del rischio.

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L'analisi delle relazioni struttura-attività (SAR) è l'utilizzo di informazioni sulla struttura molecolare delle sostanze chimiche per prevedere caratteristiche importanti relative a persistenza, distribuzione, assorbimento e assorbimento e tossicità. Il SAR è un metodo alternativo per identificare potenziali sostanze chimiche pericolose, che promette di assistere le industrie e i governi nella definizione delle priorità delle sostanze per un'ulteriore valutazione o per il processo decisionale in fase iniziale per nuove sostanze chimiche. La tossicologia è un'impresa sempre più costosa e ad alta intensità di risorse. Le crescenti preoccupazioni sulla possibilità che le sostanze chimiche causino effetti avversi nelle popolazioni umane esposte hanno spinto le agenzie di regolamentazione e sanitarie ad ampliare la gamma e la sensibilità dei test per rilevare i rischi tossicologici. Allo stesso tempo, gli oneri reali e percepiti della regolamentazione sull'industria hanno provocato preoccupazioni per la praticità dei metodi di test della tossicità e dell'analisi dei dati. Allo stato attuale, la determinazione della cancerogenicità chimica dipende dai test a vita di almeno due specie, entrambi i sessi, a diverse dosi, con un'attenta analisi istopatologica di più organi, nonché dal rilevamento di alterazioni preneoplastiche nelle cellule e negli organi bersaglio. Negli Stati Uniti, si stima che il test biologico del cancro abbia un costo superiore a 3 milioni di dollari (dollari del 1995).

Anche con risorse finanziarie illimitate, l'onere di testare le circa 70,000 sostanze chimiche esistenti prodotte oggi nel mondo supererebbe le risorse disponibili di tossicologi qualificati. Sarebbero necessari secoli per completare anche una valutazione di primo livello di queste sostanze chimiche (NRC 1984). In molti paesi sono aumentate le preoccupazioni etiche sull'uso di animali nei test di tossicità, portando ulteriori pressioni sull'uso di metodi standard di test di tossicità. Il SAR è stato ampiamente utilizzato nell'industria farmaceutica per identificare molecole potenzialmente utili per il trattamento (Hansch e Zhang 1993). Nella politica di salute ambientale e occupazionale, il SAR viene utilizzato per prevedere la dispersione di composti nell'ambiente chimico-fisico e per selezionare nuove sostanze chimiche per un'ulteriore valutazione della potenziale tossicità. Ai sensi del Toxic Substances Control Act (TSCA) degli Stati Uniti, l'EPA ha utilizzato dal 1979 un approccio SAR come "primo screening" di nuove sostanze chimiche nel processo di notifica prefabbricazione (PMN); L'Australia utilizza un approccio simile come parte della sua nuova procedura di notifica delle sostanze chimiche (NICNAS). Negli Stati Uniti l'analisi SAR è una base importante per determinare che esiste una base ragionevole per concludere che la fabbricazione, la lavorazione, la distribuzione, l'uso o lo smaltimento della sostanza presenteranno un rischio irragionevole di danno per la salute umana o per l'ambiente, come richiesto dalla Sezione 5(f) del TSCA. Sulla base di questa constatazione, l'EPA può quindi richiedere test effettivi della sostanza ai sensi della sezione 6 del TSCA.

Razionale per SAR

Il razionale scientifico per SAR si basa sul presupposto che la struttura molecolare di una sostanza chimica predice aspetti importanti del suo comportamento nei sistemi fisico-chimici e biologici (Hansch e Leo 1979).

Processo SAR

Il processo di revisione SAR include l'identificazione della struttura chimica, comprese le formulazioni empiriche e il composto puro; identificazione di sostanze strutturalmente analoghe; ricerca in banche dati e letteratura per informazioni su analoghi strutturali; e analisi della tossicità e altri dati sugli analoghi strutturali. In alcuni rari casi, le informazioni sulla struttura del composto da sole possono essere sufficienti per supportare alcune analisi SAR, basate su meccanismi di tossicità ben noti. Sono stati compilati diversi database su SAR, nonché metodi basati su computer per la previsione della struttura molecolare.

Con queste informazioni, i seguenti endpoint possono essere stimati con SAR:

• parametri fisico-chimici: punto di ebollizione, tensione di vapore, solubilità in acqua, coefficiente di ripartizione ottanolo/acqua
• parametri del destino biologico/ambientale: biodegradazione, assorbimento del suolo, fotodegradazione, farmacocinetica
• parametri di tossicità: tossicità per gli organismi acquatici, assorbimento, tossicità acuta per i mammiferi (test limite o LD₅₀), irritazione cutanea, polmonare e oculare, sensibilizzazione, tossicità subcronica, mutagenicità.

Va notato che non esistono metodi SAR per endpoint sanitari così importanti come cancerogenicità, tossicità per lo sviluppo, tossicità riproduttiva, neurotossicità, immunotossicità o altri effetti sugli organi bersaglio. Ciò è dovuto a tre fattori: la mancanza di un ampio database su cui testare le ipotesi SAR, la mancanza di conoscenza dei determinanti strutturali dell'azione tossica e la molteplicità delle cellule bersaglio e dei meccanismi coinvolti in questi endpoint (vedere "The United States approccio alla valutazione del rischio di sostanze tossiche per la riproduzione e agenti neurotossici”). Alcuni tentativi limitati di utilizzare il SAR per prevedere la farmacocinetica utilizzando informazioni sui coefficienti di partizione e sulla solubilità (Johanson e Naslund 1988). È stato fatto un SAR quantitativo più ampio per prevedere il metabolismo P450-dipendente di una gamma di composti e il legame di molecole simili a diossina e PCB al recettore citosolico della "diossina" (Hansch e Zhang 1993).

È stato dimostrato che il SAR ha una prevedibilità variabile per alcuni degli endpoint sopra elencati, come mostrato nella tabella 1. Questa tabella presenta i dati di due confronti dell'attività prevista con i risultati effettivi ottenuti mediante misurazione empirica o test di tossicità. Il SAR condotto dagli esperti dell'EPA statunitense ha ottenuto risultati più scarsi nella previsione delle proprietà fisico-chimiche rispetto alla previsione dell'attività biologica, inclusa la biodegradazione. Per gli endpoint di tossicità, SAR ha ottenuto i risultati migliori per prevedere la mutagenicità. Anche Ashby e Tennant (1991) in uno studio più esteso hanno riscontrato una buona prevedibilità della genotossicità a breve termine nella loro analisi delle sostanze chimiche NTP. Questi risultati non sono sorprendenti, data l'attuale comprensione dei meccanismi molecolari della genotossicità (vedi "Tossicologia genetica") e il ruolo dell'elettrofilia nel legame del DNA. Al contrario, il SAR tendeva a sottostimare la tossicità sistemica e subcronica nei mammiferi ea sovrastimare la tossicità acuta per gli organismi acquatici.

Tabella 1. Confronto dei dati SAR e dei test: analisi OCSE/NTP

Fonte: dati OCSE, comunicazione personale C. Auer, US EPA. In questa analisi sono stati utilizzati solo gli endpoint per i quali erano disponibili previsioni SAR comparabili e dati di test effettivi. I dati NTP provengono da Ashby e Tennant 1991.

¹ Desta preoccupazione è stata l'incapacità del SAR di prevedere la tossicità acuta nel 12% delle sostanze chimiche testate.

² Dati OCSE, basati sulla concordanza del test di Ames con SAR

³ Dati NTP, basati su test genetox rispetto alle previsioni SAR per diverse classi di "sostanze chimiche strutturalmente allerta".

⁴ La concordanza varia con la classe; la maggiore concordanza era con i composti aromatici ammino/nitro; più basso con strutture “varie”.

Per altri endpoint tossici, come notato sopra, SAR ha un'utilità meno dimostrabile. Le previsioni sulla tossicità nei mammiferi sono complicate dalla mancanza di SAR per la tossicocinetica di molecole complesse. Tuttavia, sono stati fatti alcuni tentativi per proporre principi SAR per endpoint complessi di tossicità sui mammiferi (per esempio, vedere Bernstein (1984) per un'analisi SAR di potenziali sostanze tossiche per la riproduzione maschile). Nella maggior parte dei casi, il database è troppo piccolo per consentire test rigorosi delle previsioni basate sulla struttura.

A questo punto si può concludere che il SAR può essere utile principalmente per dare la priorità all'investimento di risorse per i test di tossicità o per sollevare preoccupazioni in merito a potenziali pericoli. Solo nel caso della mutagenicità è probabile che l'analisi SAR da sola possa essere utilizzata con affidabilità per informare altre decisioni. Per nessun endpoint è probabile che SAR possa fornire il tipo di informazioni quantitative richieste ai fini della valutazione del rischio come discusso altrove in questo capitolo e Enciclopedia.

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L'emergere di sofisticate tecnologie nella biologia molecolare e cellulare ha stimolato un'evoluzione relativamente rapida nelle scienze della vita, compresa la tossicologia. In effetti, l'attenzione della tossicologia si sta spostando da interi animali e popolazioni di interi animali alle cellule e alle molecole di singoli animali e umani. Dalla metà degli anni '1980, i tossicologi hanno iniziato a impiegare queste nuove metodologie per valutare gli effetti delle sostanze chimiche sui sistemi viventi. Come logica progressione, tali metodi vengono adattati ai fini dei test di tossicità. Questi progressi scientifici hanno collaborato con fattori sociali ed economici per modificare la valutazione della sicurezza del prodotto e del rischio potenziale.

I fattori economici sono specificamente legati al volume dei materiali che devono essere testati. Ogni anno viene introdotta sul mercato una miriade di nuovi cosmetici, prodotti farmaceutici, pesticidi, prodotti chimici e prodotti per la casa. Tutti questi prodotti devono essere valutati per la loro potenziale tossicità. Inoltre, vi è un arretrato di prodotti chimici già in uso che non sono stati adeguatamente testati. L'enorme compito di ottenere informazioni dettagliate sulla sicurezza di tutte queste sostanze chimiche utilizzando i tradizionali metodi di sperimentazione su animali interi sarebbe costoso in termini sia di denaro che di tempo, se potesse essere portato a termine.

Esistono anche questioni sociali che riguardano la salute e la sicurezza pubblica, nonché una crescente preoccupazione del pubblico sull'uso di animali per i test sulla sicurezza dei prodotti. Per quanto riguarda la sicurezza umana, l'interesse pubblico e i gruppi di difesa dell'ambiente hanno esercitato pressioni significative sulle agenzie governative affinché applicassero normative più rigorose sulle sostanze chimiche. Un recente esempio di ciò è stato un movimento di alcuni gruppi ambientalisti per vietare il cloro e i composti contenenti cloro negli Stati Uniti. Una delle motivazioni di un'azione così estrema risiede nel fatto che la maggior parte di questi composti non è mai stata adeguatamente testata. Dal punto di vista tossicologico, il concetto di vietare un'intera classe di sostanze chimiche diverse basato semplicemente sulla presenza di cloro è sia scientificamente infondato che irresponsabile. Tuttavia, è comprensibile che, dal punto di vista del pubblico, ci debba essere una certa garanzia che le sostanze chimiche rilasciate nell'ambiente non comportino un rischio significativo per la salute. Tale situazione sottolinea la necessità di metodi più efficienti e rapidi per valutare la tossicità.

L'altra preoccupazione della società che ha avuto un impatto sull'area dei test di tossicità è il benessere degli animali. Il numero crescente di gruppi per la protezione degli animali in tutto il mondo ha espresso una notevole opposizione all'uso di animali interi per i test sulla sicurezza dei prodotti. Sono state condotte campagne attive contro i produttori di cosmetici, prodotti per la cura della casa e della persona e prodotti farmaceutici nel tentativo di fermare i test sugli animali. Tali sforzi in Europa hanno portato all'approvazione del sesto emendamento alla direttiva 76/768/CEE (la direttiva sui cosmetici). La conseguenza di questa direttiva è che i prodotti cosmetici o gli ingredienti cosmetici che sono stati testati sugli animali dopo il 1° gennaio 1998 non possono essere commercializzati nell'Unione Europea, a meno che metodi alternativi non siano sufficientemente convalidati. Sebbene questa direttiva non abbia giurisdizione sulla vendita di tali prodotti negli Stati Uniti o in altri paesi, influirà in modo significativo sulle società che hanno mercati internazionali che includono l'Europa.

Il concetto di alternative, che costituisce la base per lo sviluppo di test diversi da quelli su animali interi, è definito dai tre Rs: riduzione nel numero di animali utilizzati; raffinatezza di protocolli in modo che gli animali provino meno stress o disagio; e sostituzione degli attuali test sugli animali con test in vitro (cioè test eseguiti al di fuori dell'animale vivente), modelli computerizzati o test su specie di vertebrati o invertebrati inferiori. I tre Rs sono stati introdotti in un libro pubblicato nel 1959 da due scienziati britannici, WMS Russell e Rex Burch, I principi della tecnica sperimentale umana. Russell e Burch sostenevano che l'unico modo per ottenere risultati scientifici validi fosse attraverso il trattamento umano degli animali e ritenevano che si dovessero sviluppare metodi per ridurre l'uso di animali e alla fine sostituirlo. È interessante notare che i principi delineati da Russell e Burch hanno ricevuto poca attenzione fino alla rinascita del movimento per il benessere degli animali a metà degli anni '1970. Oggi il concetto dei tre Rs è all'avanguardia per quanto riguarda la ricerca, i test e l'istruzione.

In sintesi, lo sviluppo delle metodologie di test in vitro è stato influenzato da una varietà di fattori che sono confluiti negli ultimi dieci o vent'anni. È difficile accertare se qualcuno di questi fattori da solo avrebbe avuto un effetto così profondo sulle strategie dei test di tossicità.

Concetto di test di tossicità in vitro

Questa sezione si concentrerà esclusivamente sui metodi in vitro per valutare la tossicità, come una delle alternative alla sperimentazione su animali interi. Ulteriori alternative non animali come la modellazione al computer e le relazioni quantitative struttura-attività sono discusse in altri articoli di questo capitolo.

Gli studi in vitro sono generalmente condotti su cellule o tessuti animali o umani al di fuori del corpo. In vitro significa letteralmente "in vetro" e si riferisce a procedure eseguite su materiale vivo o componenti di materiale vivo coltivate in capsule di Petri o in provette in condizioni definite. Questi possono essere messi a confronto con gli studi in vivo, o con quelli effettuati “nell'animale vivente”. Sebbene sia difficile, se non impossibile, proiettare gli effetti di una sostanza chimica su un organismo complesso quando le osservazioni sono limitate a un singolo tipo di cellule in una piastra, gli studi in vitro forniscono anche una quantità significativa di informazioni sulla tossicità intrinseca. come meccanismi cellulari e molecolari di tossicità. Inoltre, offrono molti vantaggi rispetto agli studi in vivo in quanto sono generalmente meno costosi e possono essere condotti in condizioni più controllate. Inoltre, nonostante il fatto che sia ancora necessario un piccolo numero di animali per ottenere cellule per colture in vitro, questi metodi possono essere considerati alternative di riduzione (poiché vengono utilizzati molti meno animali rispetto agli studi in vivo) e alternative di raffinamento (perché eliminano la necessità sottoporre gli animali alle conseguenze tossiche avverse imposte dagli esperimenti in vivo).

Per interpretare i risultati dei test di tossicità in vitro, determinarne la potenziale utilità nella valutazione della tossicità e metterli in relazione con il processo tossicologico complessivo in vivo, è necessario comprendere quale parte del processo tossicologico si sta esaminando. L'intero processo tossicologico è costituito da eventi che iniziano con l'esposizione dell'organismo a un agente fisico o chimico, progrediscono attraverso interazioni cellulari e molecolari e si manifestano infine nella risposta dell'intero organismo. I test in vitro sono generalmente limitati alla parte del processo tossicologico che avviene a livello cellulare e molecolare. I tipi di informazioni che possono essere ottenuti dagli studi in vitro includono le vie del metabolismo, l'interazione dei metaboliti attivi con i bersagli cellulari e molecolari e gli endpoint tossici potenzialmente misurabili che possono fungere da biomarcatori molecolari per l'esposizione. In una situazione ideale, sarebbe noto il meccanismo di tossicità di ciascuna sostanza chimica dall'esposizione alla manifestazione dell'organismo, in modo tale che le informazioni ottenute dai test in vitro possano essere completamente interpretate e correlate alla risposta dell'intero organismo. Tuttavia, questo è praticamente impossibile, poiché sono stati chiariti relativamente pochi meccanismi tossicologici completi. Pertanto, i tossicologi si trovano di fronte a una situazione in cui i risultati di un test in vitro non possono essere utilizzati come previsione del tutto accurata della tossicità in vivo perché il meccanismo è sconosciuto. Tuttavia, spesso durante il processo di sviluppo di un test in vitro, vengono chiariti i componenti dei meccanismi cellulari e molecolari della tossicità.

Una delle principali questioni irrisolte che circondano lo sviluppo e l'implementazione dei test in vitro è legata alla seguente considerazione: dovrebbero essere basati meccanicamente o è sufficiente che siano descrittivi? È indiscutibilmente meglio da un punto di vista scientifico utilizzare solo test meccanicistici come sostituti dei test in vivo. Tuttavia, in assenza di una conoscenza meccanicistica completa, la prospettiva di sviluppare test in vitro per sostituire completamente i test su animali interi nel prossimo futuro è quasi nulla. Ciò, tuttavia, non esclude l'uso di tipi di test più descrittivi come strumenti di screening precoce, come avviene attualmente. Questi schermi hanno portato a una significativa riduzione dell'uso di animali. Pertanto, fino a quando non verranno generate più informazioni meccanicistiche, potrebbe essere necessario impiegare in misura più limitata test i cui risultati si correlano semplicemente bene con quelli ottenuti in vivo.

Test in vitro per la citotossicità

In questa sezione verranno descritti diversi test in vitro che sono stati sviluppati per valutare il potenziale citotossico di una sostanza chimica. Per la maggior parte, questi test sono facili da eseguire e l'analisi può essere automatizzata. Un test in vitro comunemente usato per la citotossicità è il test del rosso neutro. Questo test viene eseguito su cellule in coltura e, per la maggior parte delle applicazioni, le cellule possono essere mantenute in piastre di coltura che contengono 96 piccoli pozzetti, ciascuno di 6.4 mm di diametro. Poiché ciascun pozzetto può essere utilizzato per una singola determinazione, questa disposizione può contenere più concentrazioni della sostanza chimica in esame nonché controlli positivi e negativi con un numero sufficiente di repliche per ciascuno. Dopo il trattamento delle cellule con varie concentrazioni della sostanza chimica in esame comprese in almeno due ordini di grandezza (ad esempio, da 0.01 mM a 1 mM), nonché sostanze chimiche di controllo positive e negative, le cellule vengono risciacquate e trattate con rosso neutro, un colorante che può essere assorbito e trattenuto solo dalle cellule vive. Il colorante può essere aggiunto alla rimozione della sostanza chimica in esame per determinare gli effetti immediati, oppure può essere aggiunto in momenti diversi dopo la rimozione della sostanza chimica in esame per determinare effetti cumulativi o ritardati. L'intensità del colore in ogni pozzetto corrisponde al numero di cellule vive in quel pozzetto. L'intensità del colore è misurata da uno spettrofotometro che può essere dotato di un lettore di lastre. Il lettore di piastre è programmato per fornire misurazioni individuali per ciascuno dei 96 pozzetti della piastra di coltura. Questa metodologia automatizzata consente allo sperimentatore di eseguire rapidamente un esperimento concentrazione-risposta e di ottenere dati statisticamente utili.

Un altro test relativamente semplice per la citotossicità è il test MTT. MTT (3[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio bromuro) è un colorante tetrazolio che viene ridotto dagli enzimi mitocondriali a un colore blu. Solo le cellule con mitocondri vitali manterranno la capacità di eseguire questa reazione; pertanto l'intensità del colore è direttamente correlata al grado di integrità mitocondriale. Questo è un test utile per rilevare composti citotossici generali così come quegli agenti che prendono di mira specificamente i mitocondri.

La misurazione dell'attività della lattato deidrogenasi (LDH) viene utilizzata anche come test ad ampio raggio per la citotossicità. Questo enzima è normalmente presente nel citoplasma delle cellule viventi e viene rilasciato nel mezzo di coltura cellulare attraverso membrane cellulari che perdono di cellule morte o morenti che sono state influenzate negativamente da un agente tossico. Piccole quantità di terreno di coltura possono essere rimosse in vari momenti dopo il trattamento chimico delle cellule per misurare la quantità di LDH rilasciata e determinare un andamento temporale della tossicità. Sebbene il test di rilascio di LDH sia una valutazione molto generale della citotossicità, è utile perché è facile da eseguire e può essere eseguito in tempo reale.

Ci sono molti nuovi metodi in fase di sviluppo per rilevare il danno cellulare. Metodi più sofisticati impiegano sonde fluorescenti per misurare una varietà di parametri intracellulari, come il rilascio di calcio e le variazioni del pH e del potenziale di membrana. In generale, queste sonde sono molto sensibili e possono rilevare cambiamenti cellulari più sottili, riducendo così la necessità di utilizzare la morte cellulare come endpoint. Inoltre, molti di questi saggi fluorescenti possono essere automatizzati mediante l'uso di piastre a 96 pozzetti e lettori di piastre fluorescenti.

Una volta raccolti i dati su una serie di sostanze chimiche utilizzando uno di questi test, è possibile determinare le relative tossicità. La tossicità relativa di una sostanza chimica, determinata in un test in vitro, può essere espressa come la concentrazione che esercita un effetto del 50% sulla risposta finale delle cellule non trattate. Questa determinazione è indicata come CE₅₀ (Effective Cconcentrazione per 50% delle cellule) e può essere utilizzato per confrontare le tossicità di diverse sostanze chimiche in vitro. (Un termine simile utilizzato per valutare la tossicità relativa è IC₅₀, che indica la concentrazione di una sostanza chimica che provoca un'inibizione del 50% di un processo cellulare, ad esempio la capacità di assorbire il rosso neutro.) Non è facile valutare se la relativa tossicità in vitro delle sostanze chimiche sia paragonabile alla loro relativa tossicità in vivo, poiché ci sono così tanti fattori di confusione nel sistema in vivo, come la tossicocinetica, il metabolismo, i meccanismi di riparazione e difesa. Inoltre, poiché la maggior parte di questi test misura gli endpoint generali di citotossicità, non sono basati meccanicamente. Pertanto, l'accordo tra tossicità relative in vitro e in vivo è semplicemente correlativo. Nonostante le numerose complessità e difficoltà di estrapolazione da in vitro a in vivo, questi test in vitro si stanno rivelando molto preziosi perché sono semplici e poco costosi da eseguire e possono essere utilizzati come screening per segnalare farmaci o sostanze chimiche altamente tossiche nelle prime fasi di sviluppo.

Tossicità per gli organi bersaglio

I test in vitro possono anche essere utilizzati per valutare la tossicità specifica per organi bersaglio. Ci sono una serie di difficoltà associate alla progettazione di tali test, la più notevole è l'incapacità dei sistemi in vitro di mantenere molte delle caratteristiche dell'organo in vivo. Spesso, quando le cellule vengono prelevate da animali e poste in coltura, tendono a degenerare rapidamente e/oa dedifferenziarsi, cioè a perdere le loro funzioni organiche ea diventare più generiche. Ciò presenta un problema in quanto entro un breve periodo di tempo, di solito pochi giorni, le colture non sono più utili per valutare gli effetti organo-specifici di una tossina.

Molti di questi problemi vengono superati grazie ai recenti progressi nella biologia molecolare e cellulare. Le informazioni ottenute sull'ambiente cellulare in vivo possono essere utilizzate nella modulazione delle condizioni di coltura in vitro. Dalla metà degli anni '1980 sono stati scoperti nuovi fattori di crescita e citochine, e molti di questi sono ora disponibili in commercio. L'aggiunta di questi fattori alle cellule in coltura aiuta a preservarne l'integrità e può anche aiutare a mantenere funzioni più differenziate per periodi di tempo più lunghi. Altri studi di base hanno accresciuto la conoscenza dei fabbisogni nutrizionali e ormonali delle cellule in coltura, così da poter formulare nuovi terreni. Sono stati compiuti recenti progressi anche nell'identificazione di matrici extracellulari sia naturali che artificiali su cui le cellule possono essere coltivate. La coltura di cellule su queste diverse matrici può avere effetti profondi sia sulla loro struttura che sulla loro funzione. Un grande vantaggio derivato da questa conoscenza è la capacità di controllare in modo complesso l'ambiente delle cellule in coltura ed esaminare individualmente gli effetti di questi fattori sui processi cellulari di base e sulle loro risposte a diversi agenti chimici. In breve, questi sistemi possono fornire una visione approfondita dei meccanismi di tossicità specifici degli organi.

Molti studi sulla tossicità degli organi bersaglio sono condotti su cellule primarie, che per definizione sono appena isolate da un organo e di solito mostrano una durata limitata in coltura. Ci sono molti vantaggi nell'avere colture primarie di un singolo tipo cellulare da un organo per la valutazione della tossicità. Da una prospettiva meccanicistica, tali colture sono utili per studiare specifici bersagli cellulari di una sostanza chimica. In alcuni casi, due o più tipi di cellule di un organo possono essere coltivati ​​insieme, e questo fornisce un ulteriore vantaggio di poter osservare le interazioni cellula-cellula in risposta a una tossina. Alcuni sistemi di co-coltura per la pelle sono stati progettati in modo da formare una struttura tridimensionale simile alla pelle in vivo. È anche possibile co-coltivare cellule di organi diversi, ad esempio fegato e reni. Questo tipo di coltura sarebbe utile per valutare gli effetti specifici sulle cellule renali, di una sostanza chimica che deve essere bioattivata nel fegato.

Anche gli strumenti biologici molecolari hanno svolto un ruolo importante nello sviluppo di linee cellulari continue che possono essere utili per i test di tossicità degli organi bersaglio. Queste linee cellulari sono generate trasfettando il DNA in cellule primarie. Nella procedura di trasfezione, le cellule e il DNA vengono trattati in modo tale che il DNA possa essere assorbito dalle cellule. Il DNA di solito proviene da un virus e contiene uno o più geni che, quando espressi, consentono alle cellule di diventare immortali (cioè in grado di vivere e crescere per lunghi periodi di tempo in coltura). Il DNA può anche essere ingegnerizzato in modo che il gene immortalizzante sia controllato da un promotore inducibile. Il vantaggio di questo tipo di costrutto è che le cellule si dividono solo quando ricevono lo stimolo chimico appropriato per consentire l'espressione del gene immortalizzante. Un esempio di tale costrutto è il grande gene dell'antigene T del Simian Virus 40 (SV40) (il gene immortalizzante), preceduto dalla regione del promotore del gene della metallotioneina, che è indotto dalla presenza di un metallo nel mezzo di coltura. Pertanto, dopo che il gene è stato trasfettato nelle cellule, le cellule possono essere trattate con basse concentrazioni di zinco per stimolare il promotore MT e attivare l'espressione del gene dell'antigene T. In queste condizioni, le cellule proliferano. Quando lo zinco viene rimosso dal mezzo, le cellule smettono di dividersi e in condizioni ideali ritornano a uno stato in cui esprimono le loro funzioni tessuto-specifiche.

La capacità di generare cellule immortalizzate combinata con i progressi nella tecnologia delle colture cellulari ha contribuito notevolmente alla creazione di linee cellulari da molti organi diversi, tra cui cervello, reni e fegato. Tuttavia, prima che queste linee cellulari possano essere utilizzate come surrogato per i tipi di cellule in buona fede, devono essere caratterizzate attentamente per determinare quanto siano realmente "normali".

Altri sistemi in vitro per lo studio della tossicità degli organi bersaglio comportano una crescente complessità. Man mano che i sistemi in vitro progrediscono in complessità dalla singola cellula alla coltura dell'intero organo, diventano più paragonabili all'ambiente in vivo, ma allo stesso tempo diventano molto più difficili da controllare dato l'aumento del numero di variabili. Pertanto, ciò che può essere guadagnato nel passaggio a un livello superiore di organizzazione può essere perso nell'incapacità del ricercatore di controllare l'ambiente sperimentale. La tabella 1 confronta alcune delle caratteristiche di vari sistemi in vitro che sono stati utilizzati per studiare l'epatotossicità.

Tabella 1. Confronto dei sistemi in vitro per gli studi di epatotossicità

Le fette di tessuto tagliate con precisione vengono utilizzate più ampiamente per gli studi tossicologici. Sono disponibili nuovi strumenti che consentono al ricercatore di tagliare fette di tessuto uniforme in un ambiente sterile. Le fette di tessuto offrono qualche vantaggio rispetto ai sistemi di coltura cellulare in quanto sono presenti tutti i tipi di cellule dell'organo e mantengono la loro architettura in vivo e la comunicazione intercellulare. Pertanto, possono essere condotti studi in vitro per determinare il tipo di cellula bersaglio all'interno di un organo nonché per studiare la tossicità specifica dell'organo bersaglio. Uno svantaggio delle fettine è che degenerano rapidamente dopo le prime 24 ore di coltura, principalmente a causa della scarsa diffusione dell'ossigeno alle cellule all'interno delle fettine. Tuttavia, studi recenti hanno indicato che è possibile ottenere un'aerazione più efficiente mediante una leggera rotazione. Questo, insieme all'uso di un mezzo più complesso, consente alle fette di sopravvivere fino a 96 ore.

Gli espianti di tessuto sono simili nel concetto alle fette di tessuto e possono anche essere utilizzati per determinare la tossicità delle sostanze chimiche in specifici organi bersaglio. Gli espianti di tessuto vengono stabiliti rimuovendo un piccolo frammento di tessuto (per gli studi di teratogenicità, un embrione intatto) e ponendolo in coltura per ulteriori studi. Le colture di espianti sono state utili per studi di tossicità a breve termine, tra cui irritazione e corrosività nella pelle, studi sull'amianto nella trachea e studi di neurotossicità nel tessuto cerebrale.

Gli organi perfusi isolati possono anche essere utilizzati per valutare la tossicità dell'organo bersaglio. Questi sistemi offrono un vantaggio simile a quello delle fette di tessuto e degli espianti in quanto sono presenti tutti i tipi di cellule, ma senza lo stress al tessuto introdotto dalle manipolazioni coinvolte nella preparazione delle fette. Inoltre, consentono il mantenimento delle interazioni intra-organo. Uno dei principali svantaggi è la loro fattibilità a breve termine, che ne limita l'uso per i test di tossicità in vitro. In termini di servizio come alternativa, queste colture possono essere considerate un perfezionamento poiché gli animali non subiscono le conseguenze negative del trattamento in vivo con sostanze tossiche. Tuttavia, il loro uso non riduce significativamente il numero di animali richiesti.

In sintesi, sono disponibili diversi tipi di sistemi in vitro per valutare la tossicità degli organi bersaglio. È possibile acquisire molte informazioni sui meccanismi di tossicità utilizzando una o più di queste tecniche. La difficoltà rimane nel saper estrapolare da un sistema in vitro, che rappresenta una parte relativamente piccola del processo tossicologico, all'intero processo che avviene in vivo.

Test in vitro per l'irritazione oculare

Forse il test di tossicità su animali interi più controverso dal punto di vista del benessere degli animali è il test di Draize per l'irritazione oculare, condotto sui conigli. In questo test, una piccola dose fissa di una sostanza chimica viene posta in uno degli occhi del coniglio mentre l'altro occhio viene utilizzato come controllo. Il grado di irritazione e infiammazione viene misurato in vari momenti dopo l'esposizione. Si sta facendo un grande sforzo per sviluppare metodologie per sostituire questo test, che è stato criticato non solo per ragioni umane, ma anche per la soggettività delle osservazioni e la variabilità dei risultati. È interessante notare che, nonostante le dure critiche che il test di Draize ha ricevuto, ha dimostrato di avere un notevole successo nel predire gli irritanti per l'occhio umano, in particolare le sostanze leggermente o moderatamente irritanti, che sono difficili da identificare con altri metodi. Pertanto, le richieste di alternative in vitro sono elevate.

La ricerca di alternative al test di Draize è complicata, anche se si prevede che avrà successo. Sono state sviluppate numerose alternative in vitro e di altro tipo e in alcuni casi sono state implementate. Le alternative di raffinamento al test di Draize, che per definizione sono meno dolorose o angoscianti per gli animali, includono il Low Volume Eye Test, in cui piccole quantità di materiali di prova vengono poste negli occhi dei conigli, non solo per ragioni umane, ma per imitare più da vicino le quantità a cui le persone possono essere effettivamente esposte accidentalmente. Un altro perfezionamento è che le sostanze che hanno un pH inferiore a 2 o superiore a 11.5 non vengono più testate sugli animali poiché sono note per essere gravemente irritanti per gli occhi.

Tra il 1980 e il 1989, è stato stimato un calo dell'87% nel numero di conigli utilizzati per i test di irritazione oculare dei cosmetici. I test in vitro sono stati incorporati come parte di un approccio di test di livello per realizzare questa vasta riduzione dei test su animali interi. Questo approccio è un processo in più fasi che inizia con un esame approfondito dei dati storici sull'irritazione oculare e l'analisi fisica e chimica della sostanza chimica da valutare. Se questi due processi non forniscono informazioni sufficienti, viene eseguita una batteria di test in vitro. I dati aggiuntivi ottenuti dai test in vitro potrebbero quindi essere sufficienti per valutare la sicurezza della sostanza. In caso contrario, il passaggio finale consisterebbe nell'eseguire test in vivo limitati. È facile vedere come questo approccio possa eliminare o almeno ridurre drasticamente il numero di animali necessari per prevedere la sicurezza di una sostanza sperimentale.

La batteria di test in vitro utilizzata come parte di questa strategia di test di livello dipende dalle esigenze del settore specifico. I test di irritazione oculare vengono eseguiti da un'ampia varietà di industrie, dai cosmetici ai prodotti farmaceutici ai prodotti chimici industriali. Il tipo di informazioni richieste da ciascun settore varia e pertanto non è possibile definire un'unica batteria di test in vitro. Una batteria di test è generalmente progettata per valutare cinque parametri: citotossicità, cambiamenti nella fisiologia e biochimica dei tessuti, relazioni quantitative struttura-attività, mediatori dell'infiammazione e recupero e riparazione. Un esempio di test per la citotossicità, che è una possibile causa di irritazione, è il test del rosso neutro che utilizza cellule in coltura (vedi sopra). I cambiamenti nella fisiologia cellulare e nella biochimica risultanti dall'esposizione a una sostanza chimica possono essere analizzati in colture di cellule epiteliali corneali umane. In alternativa, gli investigatori hanno utilizzato anche bulbi oculari di bovini o di pollo intatti o sezionati ottenuti dai macelli. Molti degli endpoint misurati in queste colture di organi interi sono gli stessi di quelli misurati in vivo, come l'opacità corneale e il gonfiore corneale.

L'infiammazione è spesso una componente della lesione oculare indotta da sostanze chimiche e sono disponibili numerosi test per esaminare questo parametro. Vari saggi biochimici rilevano la presenza di mediatori rilasciati durante il processo infiammatorio come l'acido arachidonico e le citochine. Anche la membrana corioallantoidea (CAM) dell'uovo di gallina può essere utilizzata come indicatore di infiammazione. Nel saggio CAM, un piccolo pezzo del guscio di un embrione di pulcino da dieci a 14 giorni viene rimosso per esporre il CAM. La sostanza chimica viene quindi applicata alla CAM e i segni di infiammazione, come l'emorragia vascolare, vengono segnati in vari momenti successivi.

Uno dei processi in vivo più difficili da valutare in vitro è il recupero e la riparazione del danno oculare. Uno strumento di nuova concezione, il microfisiometro al silicio, misura piccoli cambiamenti nel pH extracellulare e può essere utilizzato per monitorare le cellule in coltura in tempo reale. Questa analisi ha dimostrato di correlare abbastanza bene con il recupero in vivo ed è stata utilizzata come test in vitro per questo processo. Questa è stata una breve panoramica dei tipi di test utilizzati come alternative al test di Draize per l'irritazione oculare. È probabile che nei prossimi anni venga definita una serie completa di batterie di test in vitro e ciascuna sarà convalidata per il suo scopo specifico.

Convalida

La chiave per l'accettazione normativa e l'implementazione delle metodologie di test in vitro è la convalida, il processo mediante il quale viene stabilita la credibilità di un test candidato per uno scopo specifico. Gli sforzi per definire e coordinare il processo di convalida sono stati compiuti sia negli Stati Uniti che in Europa. L'Unione Europea ha istituito il Centro europeo per la convalida dei metodi alternativi (ECVAM) nel 1993 per coordinare gli sforzi e per interagire con organizzazioni americane come il Johns Hopkins Center for Alternatives to Animal Testing (CAAT), un centro accademico negli Stati Uniti e il Comitato di coordinamento interagenzia per la convalida di metodi alternativi (ICCVAM), composto da rappresentanti del National Institutes of Health, dell'Agenzia statunitense per la protezione dell'ambiente, della Food and Drug Administration statunitense e della Commissione per la sicurezza dei prodotti di consumo.

La convalida dei test in vitro richiede un'organizzazione e una pianificazione sostanziali. Deve esserci consenso tra le autorità di regolamentazione del governo e gli scienziati industriali e accademici su procedure accettabili e una supervisione sufficiente da parte di un comitato consultivo scientifico per garantire che i protocolli soddisfino gli standard stabiliti. Gli studi di convalida dovrebbero essere eseguiti in una serie di laboratori di riferimento utilizzando serie calibrate di sostanze chimiche provenienti da una banca chimica e cellule o tessuti provenienti da un'unica fonte. Sia la ripetibilità intralaboratorio che la riproducibilità interlaboratorio di una prova candidata devono essere dimostrate ei risultati devono essere sottoposti ad un'analisi statistica appropriata. Una volta raccolti i risultati delle diverse componenti degli studi di convalida, il comitato consultivo scientifico può formulare raccomandazioni sulla validità del/i test candidato/i per uno scopo specifico. Inoltre, i risultati degli studi dovrebbero essere pubblicati su riviste peer-reviewed e inseriti in un database.

La definizione del processo di validazione è attualmente un work in progress. Ogni nuovo studio di validazione fornirà informazioni utili alla progettazione dello studio successivo. La comunicazione e la cooperazione internazionale sono essenziali per il rapido sviluppo di una serie di protocolli ampiamente accettabili, in particolare data la maggiore urgenza imposta dall'approvazione della direttiva CE sui cosmetici. Questa legislazione può effettivamente fornire lo slancio necessario per intraprendere un serio sforzo di convalida. È solo attraverso il completamento di questo processo che può iniziare l'accettazione dei metodi in vitro da parte delle varie comunità di regolamentazione.

Conclusione

Questo articolo ha fornito un'ampia panoramica dello stato attuale dei test di tossicità in vitro. La scienza della tossicologia in vitro è relativamente giovane, ma sta crescendo in modo esponenziale. La sfida per gli anni a venire è incorporare la conoscenza meccanicistica generata dagli studi cellulari e molecolari nel vasto inventario di dati in vivo per fornire una descrizione più completa dei meccanismi tossicologici e stabilire un paradigma con cui i dati in vitro possono essere utilizzati prevedere la tossicità in vivo. Sarà solo attraverso gli sforzi concertati dei tossicologi e dei rappresentanti del governo che si potrà realizzare il valore intrinseco di questi metodi in vitro.

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La valutazione della tossicità genetica è la valutazione degli agenti per la loro capacità di indurre uno dei tre tipi generali di cambiamenti (mutazioni) nel materiale genetico (DNA): genico, cromosomico e genomico. In organismi come gli esseri umani, i geni sono composti da DNA, che consiste di singole unità chiamate basi nucleotidiche. I geni sono disposti in strutture fisiche discrete chiamate cromosomi. La genotossicità può provocare effetti significativi e irreversibili sulla salute umana. Il danno genotossico è un passaggio critico nell'induzione del cancro e può anche essere coinvolto nell'induzione di difetti alla nascita e morte fetale. Le tre classi di mutazioni sopra menzionate possono verificarsi all'interno di uno dei due tipi di tessuti posseduti da organismi come gli esseri umani: spermatozoi o uova (cellule germinali) e il tessuto rimanente (cellule somatiche).

I test che misurano la mutazione genica sono quelli che rilevano la sostituzione, l'aggiunta o la delezione di nucleotidi all'interno di un gene. I test che misurano la mutazione cromosomica sono quelli che rilevano rotture o riarrangiamenti cromosomici che coinvolgono uno o più cromosomi. I test che misurano la mutazione genomica sono quelli che rilevano i cambiamenti nel numero di cromosomi, una condizione chiamata aneuploidia. La valutazione della tossicità genetica è cambiata notevolmente dallo sviluppo da parte di Herman Muller nel 1927 del primo test per rilevare agenti genotossici (mutageni). Da allora sono stati sviluppati più di 200 test che misurano le mutazioni nel DNA; tuttavia, oggi vengono utilizzati comunemente meno di dieci test per la valutazione della tossicità genetica. Questo articolo esamina questi test, descrive ciò che misurano ed esplora il ruolo di questi test nella valutazione della tossicità.

Identificazione dei rischi di cancroPrima dello sviluppo del Campo di tossicologia genetica

La tossicologia genetica è diventata parte integrante del processo complessivo di valutazione del rischio e negli ultimi tempi ha guadagnato importanza come predittore affidabile dell'attività cancerogena. Tuttavia, prima dello sviluppo della tossicologia genetica (prima del 1970), altri metodi erano e sono tuttora utilizzati per identificare potenziali rischi di cancro per l'uomo. Esistono sei principali categorie di metodi attualmente utilizzati per identificare i rischi di cancro nell'uomo: studi epidemiologici, saggi biologici in vivo a lungo termine, saggi biologici in vivo a medio termine, saggi biologici in vivo e in vitro a breve termine, intelligenza artificiale (struttura-attività), e inferenza basata sui meccanismi.

La tabella 1 fornisce vantaggi e svantaggi per questi metodi.

Tabella 1. Vantaggi e svantaggi dei metodi attuali per l'identificazione dei rischi di cancro nell'uomo

Basi razionali e concettuali per saggi di tossicologia genetica

Sebbene i tipi e i numeri esatti dei test utilizzati per la valutazione della tossicità genetica siano in continua evoluzione e varino da paese a paese, i più comuni includono test per (1) mutazione genica in batteri e/o cellule di mammifero in coltura e (2) mutazione cromosomica in cellule di mammifero in coltura e/o midollo osseo all'interno di topi viventi. Alcuni dei test all'interno di questa seconda categoria possono anche rilevare l'aneuploidia. Sebbene questi test non rilevino mutazioni nelle cellule germinali, vengono utilizzati principalmente a causa del costo aggiuntivo e della complessità dell'esecuzione dei test delle cellule germinali. Tuttavia, i test delle cellule germinali nei topi vengono utilizzati quando si desiderano informazioni sugli effetti delle cellule germinali.

Studi sistematici su un periodo di 25 anni (1970-1995), in particolare presso il National Toxicology Program degli Stati Uniti nella Carolina del Nord, hanno portato all'uso di un numero discreto di test per rilevare l'attività mutagena degli agenti. Il fondamento logico per valutare l'utilità dei saggi si basava sulla loro capacità di rilevare agenti che causano il cancro nei roditori e che si sospetta causino il cancro nell'uomo (cioè agenti cancerogeni). Questo perché gli studi degli ultimi decenni hanno indicato che le cellule tumorali contengono mutazioni in alcuni geni e che molti agenti cancerogeni sono anche mutageni. Pertanto, le cellule tumorali sono viste come contenenti mutazioni delle cellule somatiche e la cancerogenesi è vista come un tipo di mutagenesi delle cellule somatiche.

I test di tossicità genetica utilizzati più comunemente oggi sono stati selezionati non solo per il loro ampio database, il costo relativamente basso e la facilità di esecuzione, ma perché hanno dimostrato di rilevare molti roditori e, presumibilmente, agenti cancerogeni per l'uomo. Di conseguenza, i test di tossicità genetica vengono utilizzati per prevedere la potenziale cancerogenicità degli agenti.

Un importante sviluppo concettuale e pratico nel campo della tossicologia genetica è stato il riconoscimento che molti cancerogeni sono stati modificati dagli enzimi all'interno del corpo, creando forme alterate (metaboliti) che erano spesso la forma cancerogena e mutagena definitiva della sostanza chimica madre. Per duplicare questo metabolismo in una capsula di Petri, Heinrich Malling ha dimostrato che l'inclusione di un preparato di fegato di roditore conteneva molti degli enzimi necessari per eseguire questa conversione o attivazione metabolica. Pertanto, molti test di tossicità genetica eseguiti in piastre o provette (in vitro) impiegano l'aggiunta di preparazioni enzimatiche simili. Le preparazioni semplici sono chiamate mix S9 e le preparazioni purificate sono chiamate microsomi. Alcune cellule batteriche e di mammifero sono state ora geneticamente modificate per contenere alcuni dei geni di roditori o umani che producono questi enzimi, riducendo la necessità di aggiungere mix S9 o microsomi.

Saggi e tecniche di tossicologia genetica

I principali sistemi batterici utilizzati per lo screening della tossicità genetica sono il saggio di mutagenicità Salmonella (Ames) e, in misura molto minore, il ceppo WP2 di Escherichia coli. Gli studi della metà degli anni '1980 hanno indicato che l'uso di soli due ceppi del sistema Salmonella (TA98 e TA100) era sufficiente per rilevare circa il 90% dei mutageni conosciuti di Salmonella. Pertanto, questi due ceppi vengono utilizzati per la maggior parte degli scopi di screening; tuttavia, sono disponibili vari altri ceppi per test più approfonditi.

Questi saggi vengono eseguiti in vari modi, ma due procedure generali sono i saggi di incorporazione su piastra e di sospensione liquida. Nel saggio di incorporazione su piastra, le cellule, la sostanza chimica in esame e (se desiderato) l'S9 vengono aggiunti insieme in un agar liquefatto e versati sulla superficie di una piastra di agar petri. L'agar superiore si indurisce in pochi minuti e le piastre vengono incubate per due o tre giorni, dopodiché le cellule mutanti sono cresciute per formare gruppi di cellule visivamente rilevabili chiamate colonie, che vengono poi contate. Il terreno di agar contiene agenti selettivi o è composto da ingredienti tali che cresceranno solo le cellule appena mutate. Il test di incubazione con liquido è simile, tranne per il fatto che le cellule, l'agente del test e l'S9 vengono incubati insieme in un liquido che non contiene agar liquefatto, quindi le cellule vengono lavate via dall'agente del test e dall'S9 e seminate sull'agar.

Le mutazioni nelle cellule di mammifero in coltura vengono rilevate principalmente in uno dei due geni: hprt ed tk. Analogamente ai saggi batterici, le linee cellulari di mammifero (sviluppate da roditori o cellule umane) vengono esposte all'agente di prova in piastre o provette di coltura di plastica e quindi vengono seminate in piastre di coltura che contengono terreno con un agente selettivo che consente solo alle cellule mutanti di crescere . I saggi utilizzati a questo scopo includono il CHO/HPRT, il TK6 e il linfoma di topo L5178Y/TK^+/- saggi. Vengono utilizzate anche altre linee cellulari contenenti varie mutazioni di riparazione del DNA e contenenti alcuni geni umani coinvolti nel metabolismo. Questi sistemi consentono il recupero di mutazioni all'interno del gene (mutazione genica) così come mutazioni che coinvolgono regioni del cromosoma che fiancheggiano il gene (mutazione cromosomica). Tuttavia, quest'ultimo tipo di mutazione viene recuperato in misura molto maggiore dal tk sistemi genici che dal hprt sistemi genici a causa della posizione del tk scomodo.

Analogamente al saggio di incubazione in liquido per la mutagenicità batterica, i saggi di mutagenicità su cellule di mammifero comportano generalmente l'esposizione delle cellule in piastre o provette di coltura in presenza dell'agente in esame e S9 per diverse ore. Le cellule vengono quindi lavate, coltivate per diversi giorni per consentire la degradazione dei prodotti genici normali (wild-type) e l'espressione e l'accumulo dei nuovi prodotti genici mutanti, quindi vengono seminate in un terreno contenente un agente selettivo che consente solo le cellule mutanti a crescere. Come i test batterici, le cellule mutanti crescono in colonie visivamente rilevabili che vengono poi contate.

La mutazione cromosomica è identificata principalmente mediante analisi citogenetiche, che comportano l'esposizione di roditori e/o cellule di roditori o umane in piastre di coltura a una sostanza chimica in esame, consentendo il verificarsi di una o più divisioni cellulari, la colorazione dei cromosomi e quindi l'esame visivo dei cromosomi attraverso un microscopio per rilevare alterazioni nella struttura o nel numero di cromosomi. Sebbene sia possibile esaminare una varietà di endpoint, i due attualmente accettati dalle agenzie di regolamentazione come i più significativi sono le aberrazioni cromosomiche e una sottocategoria chiamata micronuclei.

Sono necessarie una notevole formazione ed esperienza per valutare le cellule per la presenza di aberrazioni cromosomiche, rendendo questa procedura costosa in termini di tempo e denaro. Al contrario, i micronuclei richiedono poco addestramento e il loro rilevamento può essere automatizzato. I micronuclei appaiono come piccoli punti all'interno della cellula che sono distinti dal nucleo, che contiene i cromosomi. I micronuclei derivano dalla rottura del cromosoma o dall'aneuploidia. A causa della facilità di scoring dei micronuclei rispetto alle aberrazioni cromosomiche, e poiché studi recenti indicano che gli agenti che inducono aberrazioni cromosomiche nel midollo osseo di topi viventi generalmente inducono micronuclei in questo tessuto, i micronuclei sono ora comunemente misurati come un'indicazione della capacità di un agente per indurre la mutazione cromosomica.

Sebbene i test sulle cellule germinali siano utilizzati molto meno frequentemente rispetto agli altri test sopra descritti, sono indispensabili per determinare se un agente rappresenta un rischio per le cellule germinali, le cui mutazioni possono portare a effetti sulla salute nelle generazioni successive. I test delle cellule germinali più comunemente usati sono nei topi e coinvolgono sistemi che rilevano (1) traslocazioni ereditabili (scambi) tra i cromosomi (test di traslocazione ereditaria), (2) mutazioni geniche o cromosomiche che coinvolgono geni specifici (specifico visibile o biochimico-locus saggi) e (3) mutazioni che influenzano la vitalità (dosaggio letale dominante). Come per i saggi sulle cellule somatiche, il presupposto di lavoro con i saggi sulle cellule germinali è che si presume che gli agenti positivi in ​​questi saggi siano potenziali mutageni delle cellule germinali umane.

Stato attuale e prospettive future

Studi recenti hanno indicato che erano necessarie solo tre informazioni per rilevare circa il 90% di un insieme di 41 cancerogeni per roditori (cioè presunti cancerogeni per l'uomo e mutageni delle cellule somatiche). Questi includevano (1) la conoscenza della struttura chimica dell'agente, specialmente se contiene frazioni elettrofile (vedere la sezione sulle relazioni struttura-attività); (2) dati sulla mutagenicità della Salmonella; e (3) dati da un test di tossicità cronica di 90 giorni nei roditori (topi e ratti). In effetti, essenzialmente tutti gli agenti cancerogeni per l'uomo dichiarati dalla IARC sono rilevabili come mutageni utilizzando solo il test Salmonella e il test del micronucleo del midollo osseo di topo. L'uso di questi test di mutagenicità per rilevare potenziali agenti cancerogeni per l'uomo è ulteriormente supportato dalla scoperta che la maggior parte degli agenti cancerogeni per l'uomo è cancerogena sia nei ratti che nei topi (cancerogeni transspecie) e che la maggior parte degli agenti cancerogeni transspecie è mutagena nella Salmonella e/o induce micronuclei nel midollo osseo del topo.

Con i progressi nella tecnologia del DNA, il progetto sul genoma umano e una migliore comprensione del ruolo della mutazione nel cancro, si stanno sviluppando nuovi test di genotossicità che saranno probabilmente incorporati nelle procedure di screening standard. Tra questi c'è l'uso di cellule transgeniche e di roditori. I sistemi transgenici sono quelli in cui un gene di un'altra specie è stato introdotto in una cellula o in un organismo. Ad esempio, i topi transgenici sono ora in uso sperimentale che consentono il rilevamento della mutazione in qualsiasi organo o tessuto dell'animale, sulla base dell'introduzione di un gene batterico nel topo. Sono ora disponibili cellule batteriche, come Salmonella, e cellule di mammifero (comprese linee cellulari umane) che contengono geni coinvolti nel metabolismo di agenti cancerogeni/mutageni, come i geni P450. Analisi molecolare delle effettive mutazioni indotte nel transgene all'interno di roditori transgenici o all'interno di geni nativi come hprt, oppure è ora possibile analizzare i geni bersaglio all'interno della Salmonella, in modo da poter determinare l'esatta natura delle mutazioni indotte dalle sostanze chimiche, fornendo informazioni sul meccanismo d'azione della sostanza chimica e consentendo confronti con le mutazioni negli esseri umani presumibilmente esposti all'agente .

I progressi molecolari nella citogenetica ora consentono una valutazione più dettagliata delle mutazioni cromosomiche. Questi includono l'uso di sonde (piccoli pezzi di DNA) che si attaccano (ibridano) a geni specifici. I riarrangiamenti dei geni sul cromosoma possono quindi essere rivelati dalla posizione alterata delle sonde, che sono fluorescenti e facilmente visualizzabili come settori colorati sui cromosomi. Il test di elettroforesi su gel a singola cellula per la rottura del DNA (comunemente chiamato test "cometa") consente il rilevamento di rotture del DNA all'interno di singole cellule e può diventare uno strumento estremamente utile in combinazione con tecniche citogenetiche per rilevare il danno cromosomico.

Dopo molti anni di utilizzo e la generazione di un database ampio e sviluppato in modo sistematico, la valutazione della tossicità genetica può ora essere eseguita con pochi test a costi relativamente ridotti in un breve periodo di tempo (poche settimane). I dati prodotti possono essere utilizzati per prevedere la capacità di un agente di essere un roditore e, presumibilmente, cancerogeno per l'uomo/mutageno di cellule somatiche. Tale capacità consente di limitare l'introduzione nell'ambiente di agenti mutageni e cancerogeni e di sviluppare agenti alternativi non mutageni. Gli studi futuri dovrebbero portare a metodi ancora migliori con una maggiore predittività rispetto ai test attuali.

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La parola biomarcatore è l'abbreviazione di marcatore biologico, un termine che si riferisce a un evento misurabile che si verifica in un sistema biologico, come il corpo umano. Questo evento viene quindi interpretato come riflesso, o marcatore, di uno stato più generale dell'organismo o dell'aspettativa di vita. Nella medicina del lavoro, un biomarcatore viene generalmente utilizzato come indicatore dello stato di salute o del rischio di malattia.

I biomarcatori sono utilizzati per studi in vitro e in vivo che possono includere esseri umani. Di solito vengono identificati tre tipi specifici di marcatori biologici. Sebbene alcuni biomarcatori possano essere difficili da classificare, di solito sono separati in biomarcatori di esposizione, biomarcatori di effetto o biomarcatori di suscettibilità (vedi tabella 1).

Tabella 1. Esempi di biomarcatori di esposizione o biomarcatori di effetto utilizzati negli studi tossicologici nella salute sul lavoro

Dato un grado accettabile di validità, i biomarcatori possono essere impiegati per diversi scopi. Su base individuale, un biomarcatore può essere utilizzato per supportare o confutare una diagnosi di un particolare tipo di avvelenamento o altri effetti avversi indotti chimicamente. In un soggetto sano, un biomarcatore può anche riflettere l'ipersensibilità individuale a specifiche esposizioni chimiche e può quindi servire come base per la previsione del rischio e la consulenza. In gruppi di lavoratori esposti, è possibile applicare alcuni biomarcatori di esposizione per valutare il grado di conformità alle normative sull'abbattimento dell'inquinamento o l'efficacia degli sforzi preventivi in ​​generale.

Biomarcatori di esposizione

Un biomarcatore di esposizione può essere un composto esogeno (o un metabolita) all'interno del corpo, un prodotto interattivo tra il composto (o il metabolita) e un componente endogeno o un altro evento correlato all'esposizione. Più comunemente, i biomarcatori di esposizioni a composti stabili, come i metalli, comprendono misurazioni delle concentrazioni di metalli in campioni appropriati, come sangue, siero o urina. Con le sostanze chimiche volatili, può essere valutata la loro concentrazione nell'aria espirata (dopo l'inalazione di aria priva di contaminazioni). Se il composto viene metabolizzato nel corpo, uno o più metaboliti possono essere scelti come biomarcatore dell'esposizione; i metaboliti sono spesso determinati nei campioni di urina.

I moderni metodi di analisi possono consentire la separazione di isomeri o congeneri di composti organici e la determinazione della speciazione di composti metallici o dei rapporti isotopici di alcuni elementi. Analisi sofisticate consentono di determinare i cambiamenti nella struttura del DNA o di altre macromolecole causati dal legame con sostanze chimiche reattive. Tali tecniche avanzate acquisiranno senza dubbio un'importanza considerevole per le applicazioni negli studi sui biomarcatori, ed è probabile che limiti di rilevamento più bassi e una migliore validità analitica renderanno questi biomarcatori ancora più utili.

Sviluppi particolarmente promettenti si sono verificati con biomarcatori di esposizione a sostanze chimiche mutagene. Questi composti sono reattivi e possono formare addotti con macromolecole, come proteine ​​o DNA. Gli addotti del DNA possono essere rilevati nei globuli bianchi o nelle biopsie tissutali e specifici frammenti di DNA possono essere escreti nelle urine. Ad esempio, l'esposizione all'ossido di etilene provoca reazioni con le basi del DNA e, dopo l'escissione della base danneggiata, l'N-7-(2-idrossietil)guanina verrà eliminata nelle urine. Alcuni addotti potrebbero non riferirsi direttamente a una particolare esposizione. Ad esempio, l'8-idrossi-2'-deossiguanosina riflette il danno ossidativo al DNA e questa reazione può essere innescata da diversi composti chimici, la maggior parte dei quali induce anche la perossidazione lipidica.

Altre macromolecole possono anche essere modificate dalla formazione di addotti o dall'ossidazione. Di particolare interesse, tali composti reattivi possono generare addotti di emoglobina che possono essere determinati come biomarcatori di esposizione ai composti. Il vantaggio è che si possono ottenere ampie quantità di emoglobina da un campione di sangue e, data la durata di quattro mesi dei globuli rossi, gli addotti formati con gli amminoacidi della proteina indicheranno l'esposizione totale durante questo periodo.

Gli addotti possono essere determinati mediante tecniche sensibili come la cromatografia lipidica ad alte prestazioni e sono disponibili anche alcuni metodi immunologici. In generale, i metodi analitici sono nuovi, costosi e necessitano di ulteriore sviluppo e validazione. Una migliore sensibilità può essere ottenuta utilizzando il ³²P test di etichettatura post, che è un'indicazione non specifica che si è verificato un danno al DNA. Tutte queste tecniche sono potenzialmente utili per il monitoraggio biologico e sono state applicate in un numero crescente di studi. Tuttavia, sono necessari metodi analitici più semplici e più sensibili. Data la specificità limitata di alcuni metodi a bassi livelli di esposizione, il fumo di tabacco o altri fattori possono avere un impatto significativo sui risultati della misurazione, causando difficoltà di interpretazione.

L'esposizione a composti mutageni, oa composti che vengono metabolizzati in mutageni, può anche essere determinata valutando la mutagenicità dell'urina di un individuo esposto. Il campione di urina viene incubato con un ceppo batterico in cui una specifica mutazione puntiforme è espressa in modo facilmente misurabile. Se nel campione di urina sono presenti sostanze chimiche mutagene, si verificherà un aumento del tasso di mutazioni nei batteri.

I biomarcatori dell'esposizione devono essere valutati in relazione alla variazione temporale dell'esposizione e alla relazione con i diversi compartimenti. Pertanto, l'intervallo di tempo rappresentato dal biomarcatore, ovvero la misura in cui la misurazione del biomarcatore riflette l'esposizione o le esposizioni passate e/o il carico corporeo accumulato, deve essere determinato dai dati tossicocinetici per interpretare il risultato. In particolare, dovrebbe essere considerato il grado in cui il biomarcatore indica la ritenzione in specifici organi bersaglio. Sebbene i campioni di sangue siano spesso utilizzati per gli studi sui biomarcatori, il sangue periferico generalmente non è considerato un compartimento in quanto tale, sebbene funga da mezzo di trasporto tra i compartimenti. Il grado in cui la concentrazione nel sangue riflette i livelli nei diversi organi varia ampiamente tra le diverse sostanze chimiche e di solito dipende anche dalla durata dell'esposizione e dal tempo trascorso dall'esposizione.

A volte questo tipo di evidenza viene utilizzato per classificare un biomarcatore come un indicatore della dose (totale) assorbita o un indicatore della dose efficace (cioè la quantità che ha raggiunto il tessuto bersaglio). Ad esempio, l'esposizione a un particolare solvente può essere valutata dai dati sulla concentrazione effettiva del solvente nel sangue in un particolare momento dopo l'esposizione. Questa misurazione rifletterà la quantità di solvente che è stata assorbita nel corpo. Parte della quantità assorbita verrà espirata a causa della tensione di vapore del solvente. Mentre circola nel sangue, il solvente interagirà con vari componenti del corpo e alla fine sarà soggetto a degradazione da parte degli enzimi. L'esito dei processi metabolici può essere valutato determinando specifici acidi mercapturici prodotti per coniugazione con il glutatione. L'escrezione cumulativa degli acidi mercapturici può riflettere meglio la dose efficace rispetto alla concentrazione ematica.

Gli eventi della vita, come la riproduzione e la senescenza, possono influenzare la distribuzione di una sostanza chimica. La distribuzione delle sostanze chimiche all'interno del corpo è significativamente influenzata dalla gravidanza e molte sostanze chimiche possono attraversare la barriera placentare, causando così l'esposizione del feto. L'allattamento può comportare l'escrezione di sostanze chimiche liposolubili, portando così a una ridotta ritenzione nella madre insieme a un aumento dell'assorbimento da parte del bambino. Durante la perdita di peso o lo sviluppo dell'osteoporosi, possono essere rilasciate sostanze chimiche immagazzinate, che possono quindi provocare una rinnovata e prolungata esposizione "endogena" degli organi bersaglio. Altri fattori possono influenzare l'assorbimento individuale, il metabolismo, la ritenzione e la distribuzione di composti chimici e sono disponibili alcuni biomarcatori di suscettibilità (vedi sotto).

Biomarcatori di effetto

Un indicatore di effetto può essere un componente endogeno, o una misura della capacità funzionale, o qualche altro indicatore dello stato o dell'equilibrio del corpo o del sistema di organi, come influenzato dall'esposizione. Tali marcatori di effetto sono generalmente indicatori preclinici di anomalie.

Questi biomarcatori possono essere specifici o non specifici. I biomarcatori specifici sono utili perché indicano un effetto biologico di una particolare esposizione, fornendo quindi evidenze potenzialmente utilizzabili a scopo preventivo. I biomarcatori non specifici non indicano una singola causa dell'effetto, ma possono riflettere l'effetto totale e integrato dovuto a un'esposizione mista. Entrambi i tipi di biomarcatori possono quindi essere di notevole utilità nella salute sul lavoro.

Non esiste una chiara distinzione tra biomarcatori di esposizione e biomarcatori di effetto. Ad esempio, si potrebbe dire che la formazione di addotti riflette un effetto piuttosto che l'esposizione. Tuttavia, i biomarcatori dell'effetto di solito indicano cambiamenti nelle funzioni delle cellule, dei tessuti o di tutto il corpo. Alcuni ricercatori includono cambiamenti grossolani, come un aumento del peso del fegato degli animali da laboratorio esposti o una diminuzione della crescita nei bambini, come biomarcatori dell'effetto. Ai fini della salute sul lavoro, i biomarcatori degli effetti dovrebbero essere limitati a quelli che indicano cambiamenti biochimici subclinici o reversibili, come l'inibizione degli enzimi. L'effetto biomarcatore più frequentemente utilizzato è probabilmente l'inibizione della colinesterasi causata da alcuni insetticidi, cioè organofosfati e carbammati. Nella maggior parte dei casi, questo effetto è del tutto reversibile e l'inibizione enzimatica riflette l'esposizione totale a questo particolare gruppo di insetticidi.

Alcune esposizioni non provocano l'inibizione enzimatica ma piuttosto un aumento dell'attività di un enzima. Questo è il caso di diversi enzimi che appartengono alla famiglia P450 (vedi “Determinanti genetici della risposta tossica”). Possono essere indotti dall'esposizione a determinati solventi e idrocarburi poliaromatici (IPA). Poiché questi enzimi sono espressi principalmente in tessuti dai quali può essere difficile ottenere una biopsia, l'attività enzimatica viene determinata indirettamente in vivo somministrando un composto che viene metabolizzato da quel particolare enzima, e quindi il prodotto di degradazione viene misurato nelle urine o nel plasma.

Altre esposizioni possono indurre la sintesi di una proteina protettiva nel corpo. L'esempio migliore è probabilmente la metallotioneina, che lega il cadmio e favorisce l'escrezione di questo metallo; l'esposizione al cadmio è uno dei fattori che determinano un aumento dell'espressione del gene della metallotioneina. Potrebbero esistere proteine ​​protettive simili, ma non sono state ancora esplorate a sufficienza per essere accettate come biomarcatori. Tra i candidati per un possibile utilizzo come biomarcatori ci sono le cosiddette proteine ​​dello stress, originariamente chiamate proteine ​​da shock termico. Queste proteine ​​sono generate da una gamma di organismi diversi in risposta a una varietà di esposizioni avverse.

Il danno ossidativo può essere valutato determinando la concentrazione di malondialdeide nel siero o l'esalazione di etano. Allo stesso modo, l'escrezione urinaria di proteine ​​con un piccolo peso molecolare, come l'albumina, può essere utilizzata come biomarcatore di danno renale precoce. Diversi parametri abitualmente utilizzati nella pratica clinica (ad esempio, ormoni sierici o livelli di enzimi) possono anche essere utili come biomarcatori. Tuttavia, molti di questi parametri potrebbero non essere sufficientemente sensibili per rilevare una compromissione precoce.

Un altro gruppo di parametri di effetto riguarda gli effetti genotossici (cambiamenti nella struttura dei cromosomi). Tali effetti possono essere rilevati mediante microscopia dei globuli bianchi che subiscono la divisione cellulare. Al microscopio si possono vedere gravi danni ai cromosomi - aberrazioni cromosomiche o formazione di micronuclei. Il danno può anche essere rivelato aggiungendo un colorante alle cellule durante la divisione cellulare. L'esposizione a un agente genotossico può quindi essere visualizzata come un aumento dello scambio del colorante tra i due cromatidi di ciascun cromosoma (scambio di cromatidi fratelli). Le aberrazioni cromosomiche sono correlate a un aumentato rischio di sviluppare il cancro, ma il significato di un aumento del tasso di scambio di cromatidi fratelli è meno chiaro.

Una valutazione più sofisticata della genotossicità si basa su particolari mutazioni puntiformi nelle cellule somatiche, cioè globuli bianchi o cellule epiteliali ottenute dalla mucosa orale. Una mutazione in un locus specifico può rendere le cellule capaci di crescere in una coltura che contiene una sostanza chimica altrimenti tossica (come la 6-tioguanina). In alternativa, può essere valutato uno specifico prodotto genico (p. es., concentrazioni sieriche o tissutali di oncoproteine ​​codificate da particolari oncogeni). Ovviamente, queste mutazioni riflettono il danno genotossico totale subito e non indicano necessariamente nulla sull'esposizione causale. Questi metodi non sono ancora pronti per l'uso pratico nella medicina del lavoro, ma i rapidi progressi in questa linea di ricerca suggeriscono che tali metodi saranno disponibili entro pochi anni.

Biomarcatori di suscettibilità

Un marcatore di suscettibilità, ereditaria o indotta, è un indicatore che l'individuo è particolarmente sensibile all'effetto di uno xenobiotico o agli effetti di un gruppo di tali composti. La maggior parte dell'attenzione è stata focalizzata sulla suscettibilità genetica, sebbene altri fattori possano essere almeno altrettanto importanti. L'ipersensibilità può essere dovuta a un tratto ereditario, alla costituzione dell'individuo oa fattori ambientali.

La capacità di metabolizzare alcune sostanze chimiche è variabile ed è geneticamente determinata (vedi “Determinanti genetici della risposta tossica”). Diversi enzimi rilevanti sembrano essere controllati da un singolo gene. Ad esempio, l'ossidazione di sostanze chimiche estranee viene effettuata principalmente da una famiglia di enzimi appartenenti alla famiglia P450. Altri enzimi rendono i metaboliti più solubili in acqua per coniugazione (p. es., N-acetiltransferasi e μ-glutatione-S-transferasi). L'attività di questi enzimi è geneticamente controllata e varia considerevolmente. Come accennato in precedenza, l'attività può essere determinata somministrando una piccola dose di un farmaco e quindi determinando la quantità del metabolita nelle urine. Alcuni dei geni sono stati ora caratterizzati e sono disponibili tecniche per determinare il genotipo. Importanti studi suggeriscono che il rischio di sviluppare determinate forme tumorali è correlato alla capacità di metabolizzare composti estranei. Molte domande rimangono ancora senza risposta, limitando così in questo momento l'uso di questi potenziali biomarcatori di suscettibilità nella salute sul lavoro.

Altri tratti ereditari, come l'alfa₁-la carenza di antitripsina o la carenza di glucosio-6-fosfato deidrogenasi, provocano anch'esse meccanismi di difesa carenti nell'organismo, causando in tal modo ipersuscettibilità a determinate esposizioni.

La maggior parte delle ricerche relative alla suscettibilità si è occupata della predisposizione genetica. Anche altri fattori giocano un ruolo e sono stati in parte trascurati. Ad esempio, gli individui con una malattia cronica possono essere più sensibili a un'esposizione professionale. Inoltre, se un processo patologico o una precedente esposizione a sostanze chimiche tossiche ha causato danni subclinici agli organi, è probabile che la capacità di resistere a una nuova esposizione tossica sia inferiore. Gli indicatori biochimici della funzione dell'organo possono in questo caso essere usati come biomarcatori di suscettibilità. Forse il miglior esempio di ipersuscettibilità riguarda le risposte allergiche. Se un individuo è diventato sensibilizzato a una particolare esposizione, nel siero possono essere rilevati anticorpi specifici. Anche se l'individuo non è diventato sensibilizzato, altre esposizioni attuali o passate possono aumentare il rischio di sviluppare un effetto avverso correlato a un'esposizione professionale.

Uno dei problemi principali è determinare l'effetto congiunto delle esposizioni miste sul lavoro. Inoltre, le abitudini personali e l'uso di droghe possono determinare un aumento della suscettibilità. Ad esempio, il fumo di tabacco di solito contiene una notevole quantità di cadmio. Pertanto, con l'esposizione professionale al cadmio, un forte fumatore che ha accumulato quantità sostanziali di questo metallo nel corpo sarà a maggior rischio di sviluppare malattie renali correlate al cadmio.

Applicazione in medicina del lavoro

I biomarcatori sono estremamente utili nella ricerca tossicologica e molti possono essere applicabili nel monitoraggio biologico. Tuttavia, anche i limiti devono essere riconosciuti. Molti biomarcatori sono stati finora studiati solo su animali da laboratorio. I modelli tossicocinetici in altre specie potrebbero non riflettere necessariamente la situazione negli esseri umani e l'estrapolazione potrebbe richiedere studi di conferma su volontari umani. Inoltre, si deve tener conto delle variazioni individuali dovute a fattori genetici o costituzionali.

In alcuni casi, i biomarcatori di esposizione potrebbero non essere affatto fattibili (ad esempio, per sostanze chimiche che hanno vita breve in vivo). Altre sostanze chimiche possono essere immagazzinate o influenzare organi a cui non è possibile accedere con procedure di routine, come il sistema nervoso. La via di esposizione può anche influenzare il modello di distribuzione e quindi anche la misurazione del biomarcatore e la sua interpretazione. Ad esempio, è probabile che l'esposizione diretta del cervello attraverso il nervo olfattivo sfugga al rilevamento mediante la misurazione dei biomarcatori dell'esposizione. Per quanto riguarda l'effetto sui biomarcatori, molti di essi non sono affatto specifici e il cambiamento può essere dovuto a una varietà di cause, inclusi i fattori dello stile di vita. Forse in particolare con i biomarcatori di suscettibilità, l'interpretazione deve essere molto cauta al momento, poiché rimangono molte incertezze sul significato generale per la salute dei singoli genotipi.

Nella medicina del lavoro, il biomarcatore ideale dovrebbe soddisfare diversi requisiti. Prima di tutto, la raccolta e l'analisi dei campioni devono essere semplici e affidabili. Per una qualità analitica ottimale è necessaria la standardizzazione, ma i requisiti specifici variano considerevolmente. Le principali aree di interesse includono: la preparazione dell'individuo, la procedura di campionamento e la manipolazione del campione e la procedura di misurazione; quest'ultimo comprende fattori tecnici, come le procedure di calibrazione e garanzia della qualità, e fattori individuali, come l'istruzione e la formazione degli operatori.

Per la documentazione della validità analitica e della tracciabilità, i materiali di riferimento dovrebbero essere basati su matrici pertinenti e con concentrazioni adeguate di sostanze tossiche o metaboliti rilevanti a livelli appropriati. Affinché i biomarcatori vengano utilizzati per il monitoraggio biologico o per scopi diagnostici, i laboratori responsabili devono disporre di procedure analitiche ben documentate con caratteristiche prestazionali definite e registrazioni accessibili per consentire la verifica dei risultati. Allo stesso tempo, tuttavia, devono essere considerati gli aspetti economici della caratterizzazione e dell'utilizzo di materiali di riferimento per integrare le procedure di garanzia della qualità in generale. Pertanto, la qualità ottenibile dei risultati e gli usi a cui sono destinati devono essere bilanciati con i costi aggiuntivi della garanzia della qualità, compresi i materiali di riferimento, la manodopera e la strumentazione.

Un altro requisito è che il biomarcatore sia specifico, almeno nelle circostanze dello studio, per un particolare tipo di esposizione, con una chiara relazione con il grado di esposizione. In caso contrario, il risultato della misurazione del biomarcatore potrebbe essere troppo difficile da interpretare. Per una corretta interpretazione del risultato della misurazione di un biomarcatore di esposizione, deve essere nota la validità diagnostica (ovvero, la traduzione del valore del biomarcatore nell'entità dei possibili rischi per la salute). In quest'area, i metalli fungono da paradigma per la ricerca sui biomarcatori. Recenti ricerche hanno dimostrato la complessità e la sottigliezza delle relazioni dose-risposta, con notevoli difficoltà nell'identificare i livelli senza effetto e quindi anche nel definire le esposizioni tollerabili. Tuttavia, questo tipo di ricerca ha anche illustrato i tipi di indagine e il perfezionamento necessari per scoprire le informazioni rilevanti. Per la maggior parte dei composti organici non sono ancora disponibili associazioni quantitative tra le esposizioni ei corrispondenti effetti avversi sulla salute; in molti casi, anche gli organi bersaglio primari non sono noti con certezza. Inoltre, la valutazione dei dati sulla tossicità e delle concentrazioni di biomarcatori è spesso complicata dall'esposizione a miscele di sostanze, piuttosto che dall'esposizione a un singolo composto in quel momento.

Prima che il biomarcatore venga applicato a fini di salute sul lavoro, sono necessarie alcune considerazioni aggiuntive. In primo luogo, il biomarcatore deve riflettere solo un cambiamento subclinico e reversibile. In secondo luogo, dato che i risultati del biomarcatore possono essere interpretati in relazione ai rischi per la salute, dovrebbero essere disponibili sforzi preventivi e dovrebbero essere considerati realistici nel caso in cui i dati del biomarcatore suggeriscano la necessità di ridurre l'esposizione. In terzo luogo, l'uso pratico del biomarcatore deve essere generalmente considerato eticamente accettabile.

Le misure di igiene industriale possono essere confrontate con i limiti di esposizione applicabili. Allo stesso modo, i risultati sui biomarcatori di esposizione o sui biomarcatori di effetto possono essere confrontati con i limiti di azione biologica, a volte indicati come indici di esposizione biologica. Tali limiti dovrebbero essere basati sui migliori consigli di clinici e scienziati di discipline appropriate, e gli amministratori responsabili come "gestori del rischio" dovrebbero quindi tenere conto di fattori etici, sociali, culturali ed economici rilevanti. La base scientifica dovrebbe, se possibile, includere rapporti dose-risposta integrati da informazioni sulle variazioni di suscettibilità all'interno della popolazione a rischio. In alcuni paesi, i lavoratori ei membri del pubblico in generale sono coinvolti nel processo di definizione degli standard e forniscono un contributo importante, in particolare quando l'incertezza scientifica è considerevole. Una delle maggiori incertezze è come definire un effetto avverso sulla salute che dovrebbe essere prevenuto, ad esempio se la formazione di addotti come biomarcatore di esposizione rappresenti di per sé un effetto avverso (cioè un biomarcatore di effetto) che dovrebbe essere prevenuto. È probabile che sorgano questioni difficili quando si decide se sia eticamente difendibile, per lo stesso composto, avere limiti diversi per l'esposizione avventizia, da un lato, e l'esposizione professionale, dall'altro.

Le informazioni generate dall'uso dei biomarcatori dovrebbero generalmente essere trasmesse agli individui esaminati all'interno del rapporto medico-paziente. Le preoccupazioni etiche devono essere considerate in particolare in relazione alle analisi di biomarcatori altamente sperimentali che attualmente non possono essere interpretate in dettaglio in termini di effettivi rischi per la salute. Per la popolazione generale, ad esempio, attualmente esistono orientamenti limitati per quanto riguarda l'interpretazione di biomarcatori di esposizione diversi dalla concentrazione di piombo nel sangue. Altrettanto importante è la fiducia nei dati generati (vale a dire, se è stato effettuato un campionamento appropriato e se nel laboratorio coinvolto sono state utilizzate valide procedure di garanzia della qualità). Un'ulteriore area di particolare preoccupazione riguarda l'ipersensibilità individuale. Questi problemi devono essere presi in considerazione quando si fornisce il feedback dallo studio.

Tutti i settori della società interessati o interessati alla realizzazione di uno studio sui biomarcatori devono essere coinvolti nel processo decisionale su come gestire le informazioni generate dallo studio. Procedure specifiche per prevenire o superare inevitabili conflitti etici dovrebbero essere sviluppate all'interno dei quadri legali e sociali della regione o del paese. Tuttavia, ogni situazione rappresenta una serie diversa di domande e insidie ​​e non è possibile sviluppare un'unica procedura per il coinvolgimento del pubblico per coprire tutte le applicazioni dei biomarcatori di esposizione.

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Lo studio e la caratterizzazione di sostanze chimiche e altri agenti per le proprietà tossiche viene spesso intrapreso sulla base di organi e sistemi di organi specifici. In questo capitolo, sono stati selezionati due bersagli per una discussione approfondita: il sistema immunitario e il gene. Questi esempi sono stati scelti per rappresentare un complesso sistema di organi bersaglio e un bersaglio molecolare all'interno delle cellule. Per una discussione più completa sulla tossicologia degli organi bersaglio, il lettore può fare riferimento a testi di tossicologia standard come Casarett e Doull e Hayes. Anche il Programma internazionale sulla sicurezza chimica (IPCS) ha pubblicato diversi documenti sui criteri sulla tossicologia degli organi bersaglio, per sistema di organi.

Gli studi di tossicologia sugli organi bersaglio sono di solito intrapresi sulla base di informazioni che indicano il potenziale di effetti tossici specifici di una sostanza, o da dati epidemiologici o da studi generali di tossicità acuta o cronica, o sulla base di preoccupazioni particolari per proteggere determinate funzioni di organi, come come riproduzione o sviluppo fetale. In alcuni casi, test specifici di tossicità per organi bersaglio sono espressamente richiesti dalle autorità statutarie, come i test di neurotossicità ai sensi della legge statunitense sui pesticidi (vedere "L'approccio degli Stati Uniti alla valutazione del rischio di sostanze tossiche per la riproduzione e agenti neurotossici" e i test di mutagenicità ai sensi del Japanese Chemical Chemical Legge sul controllo delle sostanze (vedi “Principi di identificazione dei pericoli: l'approccio giapponese”).

Come discusso in "Organo bersaglio ed effetti critici", l'identificazione di un organo critico si basa sul rilevamento dell'organo o del sistema di organi che per primo risponde negativamente o alle dosi o esposizioni più basse. Queste informazioni vengono quindi utilizzate per progettare indagini tossicologiche specifiche o test di tossicità più definiti progettati per suscitare indicazioni più sensibili di intossicazione nell'organo bersaglio. Gli studi di tossicologia degli organi bersaglio possono anche essere utilizzati per determinare i meccanismi di azione, di utilizzo nella valutazione del rischio (vedere "L'approccio degli Stati Uniti alla valutazione del rischio di sostanze tossiche per la riproduzione e agenti neurotossici").

Metodi di studi sulla tossicità dell'organo bersaglio

Gli organi bersaglio possono essere studiati mediante l'esposizione di organismi intatti e un'analisi dettagliata della funzione e dell'istopatologia nell'organo bersaglio, o mediante l'esposizione in vitro di cellule, sezioni di tessuto o organi interi mantenuti per periodi di breve o lungo termine in coltura (vedere "Meccanismi di tossicologia: introduzione e concetti”). In alcuni casi, i tessuti di soggetti umani possono anche essere disponibili per studi di tossicità sugli organi bersaglio, e questi possono fornire l'opportunità di convalidare ipotesi di estrapolazione tra specie. Tuttavia, va tenuto presente che tali studi non forniscono informazioni sulla tossicocinetica relativa.

In generale, gli studi sulla tossicità dell'organo bersaglio condividono le seguenti caratteristiche comuni: esame istopatologico dettagliato dell'organo bersaglio, compreso l'esame post mortem, il peso del tessuto e l'esame dei tessuti fissati; studi biochimici di percorsi critici nell'organo bersaglio, come importanti sistemi enzimatici; studi funzionali della capacità dell'organo e dei costituenti cellulari di svolgere le funzioni metaboliche e di altro tipo previste; e analisi dei biomarcatori dell'esposizione e degli effetti precoci nelle cellule degli organi bersaglio.

La conoscenza dettagliata della fisiologia degli organi bersaglio, della biochimica e della biologia molecolare può essere incorporata negli studi sugli organi bersaglio. Ad esempio, poiché la sintesi e la secrezione di proteine ​​di piccolo peso molecolare è un aspetto importante della funzione renale, gli studi di nefrotossicità spesso prestano particolare attenzione a questi parametri (IPCS 1991). Poiché la comunicazione cellula-cellula è un processo fondamentale della funzione del sistema nervoso, gli studi sugli organi bersaglio nella neurotossicità possono includere misurazioni neurochimiche e biofisiche dettagliate della sintesi, dell'assorbimento, dell'immagazzinamento, del rilascio e del legame dei neurotrasmettitori, nonché misurazioni elettrofisiologiche dei cambiamenti nella membrana potenziale associato a questi eventi.

Viene posto un alto grado di enfasi sullo sviluppo di metodi in vitro per la tossicità degli organi bersaglio, per sostituire o ridurre l'uso di animali interi. Progressi sostanziali in questi metodi sono stati ottenuti per le sostanze tossiche per la riproduzione (Heindel e Chapin 1993).

In sintesi, gli studi di tossicità sugli organi bersaglio sono generalmente intrapresi come test di ordine superiore per determinare la tossicità. La selezione di specifici organi bersaglio per un'ulteriore valutazione dipende dai risultati dei test a livello di screening, come i test acuti o subcronici utilizzati dall'OCSE e dall'Unione Europea; alcuni organi bersaglio e sistemi di organi possono essere candidati a priori per indagini speciali a causa delle preoccupazioni per prevenire alcuni tipi di effetti avversi sulla salute.

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Le funzioni del sistema immunitario sono di proteggere il corpo dagli agenti infettivi invasori e di fornire una sorveglianza immunitaria contro le cellule tumorali insorgenti. Ha una prima linea di difesa aspecifica, che può avviare esso stesso reazioni effettrici, e un ramo specifico acquisito, in cui i linfociti e gli anticorpi portano la specificità del riconoscimento e la successiva reattività verso l'antigene.

L'immunotossicologia è stata definita come “la disciplina che si occupa dello studio degli eventi che possono determinare effetti indesiderati a seguito dell'interazione degli xenobiotici con il sistema immunitario. Questi eventi indesiderati possono derivare da (1) un effetto diretto e/o indiretto dello xenobiotico (e/o del suo prodotto di biotrasformazione) sul sistema immunitario, o (2) una risposta dell'ospite su base immunologica al composto e/o i suoi metaboliti o antigeni ospiti modificati dal composto o dai suoi metaboliti” (Berlin et al. 1987).

Quando il sistema immunitario agisce come un bersaglio passivo di insulti chimici, il risultato può essere una ridotta resistenza alle infezioni e alcune forme di neoplasia, o una disregolazione/stimolazione immunitaria che può esacerbare l'allergia o l'autoimmunità. Nel caso in cui il sistema immunitario risponda alla specificità antigenica dello xenobiotico o dell'antigene dell'ospite modificato dal composto, la tossicità può manifestarsi come allergie o malattie autoimmuni.

Sono stati sviluppati modelli animali per indagare sulla soppressione immunitaria indotta da sostanze chimiche e un certo numero di questi metodi è stato convalidato (Burleson, Munson e Dean 1995; IPCS 1996). A scopo di test, viene seguito un approccio a più livelli per effettuare una selezione adeguata dal numero schiacciante di test disponibili. In generale, l'obiettivo del primo livello è identificare potenziali immunotossici. Se viene identificata una potenziale immunotossicità, viene eseguito un secondo livello di test per confermare e caratterizzare ulteriormente i cambiamenti osservati. Le indagini di terzo livello includono studi speciali sul meccanismo d'azione del composto. Diversi xenobiotici sono stati identificati come immunotossici che causano immunosoppressione in tali studi con animali da laboratorio.

Il database sui disturbi della funzione immunitaria negli esseri umani da sostanze chimiche ambientali è limitato (Descotes 1986; NRC Subcommittee on Immunotoxicology 1992). L'uso di marcatori di immunotossicità ha ricevuto poca attenzione negli studi clinici ed epidemiologici per studiare l'effetto di queste sostanze chimiche sulla salute umana. Tali studi non sono stati eseguiti frequentemente e la loro interpretazione spesso non consente di trarre conclusioni univoche, ad esempio a causa della natura incontrollata dell'esposizione. Pertanto, allo stato attuale, la valutazione dell'immunotossicità nei roditori, con successiva estrapolazione all'uomo, costituisce la base delle decisioni in merito al pericolo e al rischio.

Le reazioni di ipersensibilità, in particolare l'asma allergico e la dermatite da contatto, sono importanti problemi di salute sul lavoro nei paesi industrializzati (Vos, Younes e Smith 1995). Il fenomeno della sensibilizzazione da contatto è stato studiato per primo nella cavia (Andersen e Maibach 1985). Fino a poco tempo fa questa era la specie scelta per i test predittivi. Sono disponibili molti metodi di test sui porcellini d'India, i più frequentemente impiegati sono il test di massimizzazione dei porcellini d'India e il patch test occluso di Buehler. I test sui porcellini d'India e gli approcci più recenti sviluppati nei topi, come i test di gonfiore dell'orecchio e il test dei linfonodi locali, forniscono al tossicologo gli strumenti per valutare il rischio di sensibilizzazione cutanea. La situazione rispetto alla sensibilizzazione delle vie respiratorie è molto diversa. Non sono ancora disponibili metodi ben convalidati o ampiamente accettati per l'identificazione di allergeni respiratori chimici, sebbene nella cavia e nel topo siano stati compiuti progressi nello sviluppo di modelli animali per lo studio dell'allergia respiratoria chimica.

I dati sull'uomo mostrano che gli agenti chimici, in particolare i farmaci, possono causare malattie autoimmuni (Kammüller, Bloksma e Seinen 1989). Esistono numerosi modelli animali sperimentali di malattie autoimmuni umane. Tali comprendono sia la patologia spontanea (ad esempio il lupus eritematoso sistemico nei topi neri della Nuova Zelanda) sia i fenomeni autoimmuni indotti dall'immunizzazione sperimentale con un autoantigene cross-reattivo (ad esempio l'artrite indotta dall'adiuvante H37Ra nei ratti del ceppo Lewis). Questi modelli sono applicati nella valutazione preclinica dei farmaci immunosoppressori. Pochissimi studi hanno affrontato il potenziale di questi modelli per valutare se uno xenobiotico aggrava l'autoimmunità indotta o congenita. Mancano praticamente modelli animali adatti a studiare la capacità delle sostanze chimiche di indurre malattie autoimmuni. Un modello utilizzato in misura limitata è il test del linfonodo popliteo nei topi. Come la situazione negli esseri umani, i fattori genetici svolgono un ruolo cruciale nello sviluppo della malattia autoimmune (AD) negli animali da laboratorio, il che limiterà il valore predittivo di tali test.

Il sistema immunitario

La principale funzione del sistema immunitario è la difesa contro batteri, virus, parassiti, funghi e cellule neoplastiche. Ciò è ottenuto dalle azioni di vari tipi di cellule e dei loro mediatori solubili in un concerto finemente sintonizzato. La difesa dell'ospite può essere approssimativamente suddivisa in resistenza non specifica o innata e immunità specifica o acquisita mediata dai linfociti (Roitt, Brostoff e Male 1989).

Componenti del sistema immunitario sono presenti in tutto il corpo (Jones et al. 1990). Il compartimento dei linfociti si trova all'interno degli organi linfoidi (figura 1). Il midollo osseo e il timo sono classificati come organi linfoidi primari o centrali; gli organi linfoidi secondari o periferici comprendono i linfonodi, la milza e il tessuto linfoide lungo le superfici secretorie come il tratto gastrointestinale e respiratorio, il cosiddetto tessuto linfoide associato alla mucosa (MALT). Circa la metà dei linfociti del corpo si trova in qualsiasi momento nel MALT. Inoltre la pelle è un organo importante per l'induzione di risposte immunitarie agli antigeni presenti sulla pelle. Importanti in questo processo sono le cellule di Langerhans epidermiche che hanno una funzione di presentazione dell'antigene.

Figura 1. Organi e tessuti linfoidi primari e secondari

Le cellule fagocitiche del lignaggio monocitico/macrofagico, chiamate sistema fagocitario mononucleare (MPS), si trovano negli organi linfoidi e anche nei siti extranodali; i fagociti extranodali includono le cellule di Kupffer nel fegato, i macrofagi alveolari nel polmone, i macrofagi mesangiali nel rene e le cellule gliali nel cervello. I leucociti polimorfonucleati (PMN) sono presenti principalmente nel sangue e nel midollo osseo, ma si accumulano nei siti di infiammazione.

Difesa non specifica

Una prima linea di difesa contro i microrganismi viene eseguita da una barriera fisica e chimica, come quella della pelle, delle vie respiratorie e del tubo digerente. Questa barriera è aiutata da meccanismi protettivi non specifici tra cui cellule fagocitiche, come macrofagi e leucociti polimorfonucleati, che sono in grado di uccidere i patogeni, e cellule natural killer, che possono lisare cellule tumorali e cellule infettate da virus. Anche il sistema del complemento e alcuni inibitori microbici (p. es., il lisozima) prendono parte alla risposta aspecifica.

Immunità specifica

Dopo il contatto iniziale dell'ospite con l'agente patogeno, vengono indotte risposte immunitarie specifiche. Il segno distintivo di questa seconda linea di difesa è il riconoscimento specifico dei determinanti, i cosiddetti antigeni o epitopi, dei patogeni da parte dei recettori sulla superficie cellulare dei linfociti B e T. In seguito all'interazione con l'antigene specifico, la cellula portatrice del recettore viene stimolata a subire proliferazione e differenziazione, producendo un clone di cellule progenie specifiche per l'antigene stimolante. Le risposte immunitarie specifiche aiutano la difesa aspecifica presentata ai patogeni stimolando l'efficacia delle risposte aspecifiche. Una caratteristica fondamentale dell'immunità specifica è lo sviluppo della memoria. Il contatto secondario con lo stesso antigene provoca una risposta più rapida e vigorosa ma ben regolata.

Il genoma non ha la capacità di trasportare i codici di una matrice di recettori per l'antigene sufficiente a riconoscere il numero di antigeni che possono essere incontrati. Il repertorio di specificità si sviluppa attraverso un processo di riarrangiamenti genici. Si tratta di un processo casuale, durante il quale si determinano varie specificità. Ciò include specificità per componenti self, che sono indesiderabili. Un processo di selezione che avviene nel timo (cellule T) o nel midollo osseo (cellule B) opera per eliminare queste specificità indesiderate.

La normale funzione immunitaria effettrice e la regolazione omeostatica della risposta immunitaria dipendono da una varietà di prodotti solubili, noti collettivamente come citochine, che sono sintetizzati e secreti dai linfociti e da altri tipi di cellule. Le citochine hanno effetti pleiotropici sulle risposte immunitarie e infiammatorie. La cooperazione tra diverse popolazioni cellulari è necessaria per la risposta immunitaria: la regolazione delle risposte anticorpali, l'accumulo di cellule e molecole immunitarie nei siti infiammatori, l'inizio delle risposte della fase acuta, il controllo della funzione citotossica dei macrofagi e molti altri processi centrali per la resistenza dell'ospite . Questi sono influenzati da, e in molti casi dipendono da, citochine che agiscono singolarmente o in concerto.

Vengono riconosciuti due bracci di immunità specifica: immunità umorale e immunità cellulo-mediata o cellulare:

Immunità umorale. Nel braccio umorale i linfociti B vengono stimolati in seguito al riconoscimento dell'antigene da parte dei recettori della superficie cellulare. I recettori dell'antigene sui linfociti B sono immunoglobuline (Ig). Le cellule B mature (plasmacellule) iniziano la produzione di immunoglobuline antigene-specifiche che agiscono come anticorpi nel siero o lungo le superfici della mucosa. Esistono cinque classi principali di immunoglobuline: (1) IgM, pentamerica Ig con capacità agglutinante ottimale, che viene prodotta per la prima volta dopo la stimolazione antigenica; (2) IgG, le principali Ig in circolazione, che possono attraversare la placenta; (3) IgA, Ig secretoria per la protezione delle superfici mucose; (4) IgE, Ig che si fissano ai mastociti o ai granulociti basofili coinvolti nelle reazioni di ipersensibilità immediata e (5) IgD, la cui funzione principale è quella di recettore sui linfociti B.

Immunità cellulo-mediata. Il braccio cellulare del sistema immunitario specifico è mediato dai linfociti T. Queste cellule hanno anche recettori per l'antigene sulle loro membrane. Riconoscono l'antigene se presentato da cellule presentanti l'antigene nel contesto degli antigeni di istocompatibilità. Quindi, queste cellule hanno una restrizione oltre alla specificità dell'antigene. Le cellule T funzionano come cellule helper per varie risposte immunitarie (incluse quelle umorali), mediano il reclutamento di cellule infiammatorie e possono, come cellule T citotossiche, uccidere le cellule bersaglio dopo il riconoscimento specifico dell'antigene.

Meccanismi di immunotossicità

Immunosoppressione

L'effettiva resistenza dell'ospite dipende dall'integrità funzionale del sistema immunitario, che a sua volta richiede che le cellule e le molecole componenti che orchestrano le risposte immunitarie siano disponibili in numero sufficiente e in una forma operativa. Le immunodeficienze congenite nell'uomo sono spesso caratterizzate da difetti in alcune linee di cellule staminali, con conseguente produzione ridotta o assente di cellule immunitarie. Per analogia con le malattie da immunodeficienza umana congenita e acquisita, l'immunosoppressione chimica indotta può derivare semplicemente da un numero ridotto di cellule funzionali (IPCS 1996). L'assenza o il numero ridotto di linfociti può avere effetti più o meno profondi sullo stato immunitario. Alcuni stati di immunodeficienza e grave immunosoppressione, come possono verificarsi nel trapianto o nella terapia citostatica, sono stati associati in particolare ad un aumento dell'incidenza di infezioni opportunistiche e di alcune malattie neoplastiche. Le infezioni possono essere batteriche, virali, fungine o protozoarie e il tipo predominante di infezione dipende dall'immunodeficienza associata. Ci si può aspettare che l'esposizione a sostanze chimiche ambientali immunosoppressive provochi forme più sottili di immunosoppressione, che possono essere difficili da rilevare. Questi possono portare, ad esempio, a un aumento dell'incidenza di infezioni come l'influenza o il comune raffreddore.

Data la complessità del sistema immunitario, con l'ampia varietà di cellule, mediatori e funzioni che formano una rete complicata e interattiva, i composti immunotossici hanno numerose possibilità di esercitare un effetto. Sebbene la natura delle lesioni iniziali indotte da molte sostanze chimiche immunotossiche non sia stata ancora chiarita, sono disponibili informazioni crescenti, per lo più derivate da studi su animali da laboratorio, riguardanti i cambiamenti immunobiologici che provocano la depressione della funzione immunitaria (Dean et al. 1994). . Gli effetti tossici potrebbero verificarsi nelle seguenti funzioni critiche (e vengono forniti alcuni esempi di composti immunotossici che influenzano queste funzioni):

•  sviluppo ed espansione di diverse popolazioni di cellule staminali (il benzene esercita effetti immunotossici a livello delle cellule staminali, causando linfocitopenia)
•  proliferazione di varie cellule linfoidi e mieloidi, nonché dei tessuti di supporto in cui queste cellule maturano e funzionano (i composti organostannici immunotossici sopprimono l'attività proliferativa dei linfociti nella corteccia timica attraverso la citotossicità diretta; l'azione timotossica del 2,3,7,8-tetracloro -dibenzo-p-diossina (TCDD) e composti correlati è probabilmente dovuto a una funzione compromessa delle cellule epiteliali del timo, piuttosto che alla tossicità diretta per i timociti)
•  captazione, elaborazione e presentazione dell'antigene da parte dei macrofagi e di altre cellule presentanti l'antigene (uno dei bersagli del 7,12-dimetilbenz(a)antracene (DMBA) e del piombo è la presentazione dell'antigene da parte dei macrofagi; un bersaglio della radiazione ultravioletta è l'antigene- presenta cellule di Langerhans)
•  funzione regolatrice delle cellule T-helper e T-soppressore (la funzione delle cellule T-helper è compromessa da organostans, aldicarb, policlorobifenili (PCB), TCDD e DMBA; la funzione delle cellule T-soppressore è ridotta dal trattamento con ciclofosfamide a basso dosaggio)
•  produzione di varie citochine o interleuchine (il benzo(a)pirene (BP) sopprime la produzione di interleuchina-1; la radiazione ultravioletta altera la produzione di citochine da parte dei cheratinociti)
•  sintesi di varie classi di immunoglobuline IgM e IgG viene soppressa dopo il trattamento con PCB e ossido di tributilstagno (TBT) e aumenta dopo l'esposizione all'esaclorobenzene (HCB).
•  regolazione e attivazione del complemento (influenzate da TCDD)
•  funzione delle cellule T citotossiche (3-metilcolantrene (3-MC), DMBA e TCDD sopprimono l'attività delle cellule T citotossiche)
•  funzione delle cellule natural killer (NK) (l'attività NK polmonare è soppressa dall'ozono; l'attività NK splenica è compromessa dal nichel)
•  chemiotassi dei macrofagi e dei leucociti polimorfonucleati e funzioni citotossiche (ozono e biossido di azoto compromettono l'attività fagocitaria dei macrofagi alveolari).

Allergia

Allergia possono essere definiti come gli effetti avversi sulla salute che derivano dall'induzione e dall'attivazione di specifiche risposte immunitarie. Quando le reazioni di ipersensibilità si verificano senza il coinvolgimento del sistema immunitario il termine pseudo-allergia viene usato. Nel contesto dell'immunotossicologia, l'allergia deriva da una specifica risposta immunitaria a sostanze chimiche e farmaci di interesse. La capacità di una sostanza chimica di sensibilizzare gli individui è generalmente correlata alla sua capacità di legarsi in modo covalente alle proteine ​​del corpo. Le reazioni allergiche possono assumere una varietà di forme e queste differiscono rispetto sia ai meccanismi immunologici sottostanti che alla velocità della reazione. Sono stati riconosciuti quattro tipi principali di reazioni allergiche: Reazioni di ipersensibilità di tipo I, che sono effettuate dall'anticorpo IgE e dove i sintomi si manifestano entro pochi minuti dall'esposizione dell'individuo sensibilizzato. Le reazioni di ipersensibilità di tipo II derivano dal danno o dalla distruzione delle cellule ospiti da parte dell'anticorpo. In questo caso i sintomi diventano evidenti entro poche ore. Anche le reazioni di ipersensibilità di tipo III, o di Arthus, sono mediate da anticorpi, ma contro antigeni solubili, e derivano dall'azione locale o sistemica di complessi immunitari. Le reazioni di tipo IV, o di ipersensibilità di tipo ritardato, sono effettuate dai linfociti T e normalmente i sintomi si sviluppano da 24 a 48 ore dopo l'esposizione dell'individuo sensibilizzato.

I due tipi di allergia chimica di maggiore rilevanza per la salute sul lavoro sono la sensibilità da contatto o allergia cutanea e l'allergia delle vie respiratorie.

Ipersensibilità da contatto. Un gran numero di sostanze chimiche è in grado di provocare sensibilizzazione cutanea. In seguito all'esposizione topica di un individuo suscettibile a un allergene chimico, viene indotta una risposta dei linfociti T nei linfonodi drenanti. Nella pelle l'allergene interagisce direttamente o indirettamente con le cellule di Langerhans epidermiche, che trasportano la sostanza chimica ai linfonodi e la presentano in forma immunogenica ai linfociti T reattivi. I linfociti T attivati ​​dagli allergeni proliferano, con conseguente espansione clonale. L'individuo è ora sensibilizzato e risponderà a una seconda esposizione cutanea alla stessa sostanza chimica con una risposta immunitaria più aggressiva, con conseguente dermatite allergica da contatto. La reazione infiammatoria cutanea che caratterizza la dermatite allergica da contatto è secondaria al riconoscimento dell'allergene nella cute da parte di specifici linfociti T. Questi linfociti si attivano, rilasciano citochine e causano l'accumulo locale di altri leucociti mononucleati. I sintomi si sviluppano da 24 a 48 ore dopo l'esposizione dell'individuo sensibilizzato e la dermatite allergica da contatto rappresenta quindi una forma di ipersensibilità di tipo ritardato. Le cause comuni di dermatite allergica da contatto includono sostanze chimiche organiche (come il 2,4-dinitroclorobenzene), metalli (come nichel e cromo) e prodotti vegetali (come l'urushiolo dell'edera velenosa).

Ipersensibilità respiratoria. L'ipersensibilità respiratoria è generalmente considerata una reazione di ipersensibilità di tipo I. Tuttavia, le reazioni di fase tardiva ei sintomi più cronici associati all'asma possono coinvolgere processi immunitari cellulo-mediati (Tipo IV). I sintomi acuti associati all'allergia respiratoria sono influenzati dall'anticorpo IgE, la cui produzione è provocata a seguito dell'esposizione dell'individuo suscettibile all'allergene chimico inducente. L'anticorpo IgE si distribuisce a livello sistemico e si lega, tramite i recettori di membrana, ai mastociti che si trovano nei tessuti vascolarizzati, compreso il tratto respiratorio. In seguito all'inalazione della stessa sostanza chimica, verrà provocata una reazione di ipersensibilità respiratoria. L'allergene si associa alle proteine ​​e si lega e crea legami incrociati con l'anticorpo IgE legato ai mastociti. Questo a sua volta provoca la degranulazione dei mastociti e il rilascio di mediatori dell'infiammazione come istamina e leucotrieni. Tali mediatori causano broncocostrizione e vasodilatazione, con conseguenti sintomi di allergia respiratoria; asma e/o rinite. Le sostanze chimiche note per causare ipersensibilità respiratoria nell'uomo includono le anidridi acide (come l'anidride trimellitica), alcuni diisocianati (come il toluene diisocianato), i sali di platino e alcuni coloranti reattivi. Inoltre, l'esposizione cronica al berillio è nota per causare malattie polmonari da ipersensibilità.

autoimmunità

autoimmunità può essere definita come la stimolazione di specifiche risposte immunitarie dirette contro antigeni “self” endogeni. L'autoimmunità indotta può derivare sia da alterazioni dell'equilibrio dei linfociti T regolatori sia dall'associazione di uno xenobiotico con componenti tissutali normali tale da renderli immunogenici (“sé alterato”). I farmaci e le sostanze chimiche note per indurre o esacerbare accidentalmente effetti come quelli della malattia autoimmune (AD) in individui suscettibili sono composti a basso peso molecolare (peso molecolare da 100 a 500) che sono generalmente considerati di per sé non immunogenici. Il meccanismo dell'AD per esposizione chimica è per lo più sconosciuto. La malattia può essere prodotta direttamente per mezzo di anticorpi circolanti, indirettamente attraverso la formazione di immunocomplessi o come conseguenza dell'immunità cellulo-mediata, ma probabilmente si verifica attraverso una combinazione di meccanismi. La patogenesi è meglio conosciuta nei disturbi emolitici immunitari indotti da farmaci:

•  Il farmaco può attaccarsi alla membrana dei globuli rossi e interagire con un anticorpo specifico del farmaco.
•  Il farmaco può alterare la membrana dei globuli rossi in modo che il sistema immunitario consideri la cellula estranea.
•  Il farmaco e il suo anticorpo specifico formano immunocomplessi che aderiscono alla membrana dei globuli rossi producendo lesioni.
•  La sensibilizzazione dei globuli rossi si verifica a causa della produzione di autoanticorpi contro i globuli rossi.

È stato scoperto che una varietà di sostanze chimiche e farmaci, in particolare questi ultimi, inducono risposte di tipo autoimmune (Kamüller, Bloksma e Seinen 1989). L'esposizione professionale a sostanze chimiche può incidentalmente portare a sindromi simili all'AD. L'esposizione a cloruro di vinile monomerico, tricloroetilene, percloroetilene, resine epossidiche e polvere di silice può indurre sindromi simili alla sclerodermia. Una sindrome simile al lupus eritematoso sistemico (LES) è stata descritta dopo l'esposizione all'idrazina. L'esposizione al toluene diisocianato è stata associata all'induzione della porpora trombocitopenica. Metalli pesanti come il mercurio sono stati implicati in alcuni casi di glomerulonefrite da immunocomplessi.

Valutazione del rischio umano

La valutazione dello stato immunitario umano viene eseguita principalmente utilizzando il sangue periferico per l'analisi di sostanze umorali come immunoglobuline e complemento e dei leucociti del sangue per la composizione di sottoinsiemi e la funzionalità delle sottopopolazioni. Questi metodi sono generalmente gli stessi utilizzati per studiare l'immunità umorale e cellulo-mediata, nonché la resistenza aspecifica dei pazienti con sospetta malattia da immunodeficienza congenita. Per gli studi epidemiologici (ad es. su popolazioni professionalmente esposte) i parametri dovrebbero essere selezionati sulla base del loro valore predittivo nelle popolazioni umane, modelli animali convalidati e la sottostante biologia dei marcatori (vedi tabella 1). La strategia di screening per gli effetti immunotossici dopo l'esposizione (accidentale) a inquinanti ambientali o altre sostanze tossiche dipende molto dalle circostanze, come il tipo di immunodeficienza prevedibile, il tempo che intercorre tra l'esposizione e la valutazione dello stato immunitario, il grado di esposizione e il numero di individui esposti. Il processo di valutazione del rischio immunotossico di un particolare xenobiotico nell'uomo è estremamente difficile e spesso impossibile, in gran parte a causa della presenza di vari fattori confondenti di origine endogena o esogena che influenzano la risposta degli individui al danno tossico. Ciò è particolarmente vero per gli studi che indagano il ruolo dell'esposizione chimica nelle malattie autoimmuni, in cui i fattori genetici giocano un ruolo cruciale.

Tabella 1. Classificazione dei test per i marcatori immunitari

Poiché raramente sono disponibili dati sull'uomo adeguati, la valutazione del rischio di immunosoppressione indotta da sostanze chimiche nell'uomo si basa nella maggior parte dei casi su studi sugli animali. L'identificazione di potenziali xenobiotici immunotossici viene effettuata principalmente in studi controllati sui roditori. Gli studi di esposizione in vivo presentano, a questo proposito, l'approccio ottimale per stimare il potenziale immunotossico di un composto. Ciò è dovuto alla natura multifattoriale e complessa del sistema immunitario e delle risposte immunitarie. Gli studi in vitro hanno un valore crescente nella delucidazione dei meccanismi di immunotossicità. Inoltre, studiando gli effetti del composto utilizzando cellule di origine animale e umana, è possibile generare dati per il confronto delle specie, che possono essere utilizzati nell'approccio del "parallelogramma" per migliorare il processo di valutazione del rischio. Se i dati sono disponibili per tre pietre angolari del parallelogramma (animale in vivo e animale e uomo in vitro) potrebbe essere più facile prevedere l'esito della pietra angolare rimanente, ovvero il rischio nell'uomo.

Quando la valutazione del rischio di immunosoppressione indotta da sostanze chimiche deve basarsi esclusivamente su dati provenienti da studi su animali, nell'estrapolazione all'uomo può essere seguito un approccio mediante l'applicazione di fattori di incertezza al livello senza effetti avversi osservati (NOAEL). Questo livello può essere basato su parametri determinati in modelli pertinenti, come i test di resistenza dell'ospite e la valutazione in vivo delle reazioni di ipersensibilità e della produzione di anticorpi. Idealmente, la rilevanza di questo approccio alla valutazione del rischio richiede una conferma da parte di studi sull'uomo. Tali studi dovrebbero combinare l'identificazione e la misurazione della sostanza tossica, i dati epidemiologici e le valutazioni dello stato immunitario.

Per prevedere l'ipersensibilità da contatto, sono disponibili modelli di cavia che sono stati utilizzati nella valutazione del rischio sin dagli anni '1970. Sebbene sensibili e riproducibili, questi test hanno dei limiti in quanto dipendono dalla valutazione soggettiva; questo può essere superato con metodi più nuovi e più quantitativi sviluppati nel topo. Per quanto riguarda l'ipersensibilità chimica indotta dall'inalazione o dall'ingestione di allergeni, i test dovrebbero essere sviluppati e valutati in termini di valore predittivo nell'uomo. Quando si tratta di stabilire livelli di esposizione professionale sicuri di potenziali allergeni, è necessario considerare la natura bifasica dell'allergia: la fase di sensibilizzazione e la fase di elicitazione. La concentrazione richiesta per provocare una reazione allergica in un individuo precedentemente sensibilizzato è considerevolmente inferiore alla concentrazione necessaria per indurre la sensibilizzazione nell'individuo immunologicamente naïve ma suscettibile.

Poiché i modelli animali per prevedere l'autoimmunità indotta da sostanze chimiche sono praticamente assenti, si dovrebbe dare enfasi allo sviluppo di tali modelli. Per lo sviluppo di tali modelli, la nostra conoscenza dell'autoimmunità indotta da sostanze chimiche negli esseri umani dovrebbe essere avanzata, compreso lo studio dei marcatori genetici e del sistema immunitario per identificare gli individui suscettibili. Gli esseri umani che sono esposti a farmaci che inducono l'autoimmunità offrono tale opportunità.

Di ritorno

La tossicologia genetica, per definizione, è lo studio di come gli agenti chimici o fisici influenzano l'intricato processo dell'ereditarietà. Le sostanze chimiche genotossiche sono definite come composti in grado di modificare il materiale ereditario delle cellule viventi. La probabilità che una particolare sostanza chimica causi un danno genetico dipende inevitabilmente da diverse variabili, tra cui il livello di esposizione dell'organismo alla sostanza chimica, la distribuzione e la ritenzione della sostanza chimica una volta entrata nell'organismo, l'efficienza dell'attivazione metabolica e/o dei sistemi di disintossicazione in tessuti bersaglio e la reattività della sostanza chimica o dei suoi metaboliti con le macromolecole critiche all'interno delle cellule. La probabilità che il danno genetico causi la malattia dipende in ultima analisi dalla natura del danno, dalla capacità della cellula di riparare o amplificare il danno genetico, dall'opportunità di esprimere qualunque alterazione sia stata indotta e dalla capacità del corpo di riconoscere e sopprimere la moltiplicazione di cellule aberranti.

Negli organismi superiori, le informazioni ereditarie sono organizzate nei cromosomi. I cromosomi sono costituiti da filamenti strettamente condensati di DNA associato a proteine. All'interno di un singolo cromosoma, ogni molecola di DNA esiste come una coppia di lunghe catene non ramificate di subunità nucleotidiche collegate tra loro da legami fosfodiestere che uniscono il carbonio 5 di una porzione di desossiribosio al carbonio 3 della successiva (figura 1). Inoltre, una delle quattro diverse basi nucleotidiche (adenina, citosina, guanina o timina) è attaccata a ciascuna subunità di desossiribosio come perline su un filo. Tridimensionalmente, ogni coppia di filamenti di DNA forma una doppia elica con tutte le basi orientate verso l'interno della spirale. All'interno dell'elica, ogni base è associata alla sua base complementare sul filamento di DNA opposto; il legame idrogeno determina un accoppiamento forte e non covalente di adenina con timina e guanina con citosina (figura 1). Poiché la sequenza delle basi nucleotidiche è complementare per l'intera lunghezza della molecola di DNA duplex, entrambi i filamenti portano essenzialmente la stessa informazione genetica. Infatti, durante la replicazione del DNA ogni filamento funge da stampo per la produzione di un nuovo filamento partner.

Figura 1. L'organizzazione (a) primaria, (b) secondaria e (c) terziaria delle informazioni ereditarie umane

Utilizzando l'RNA e una serie di diverse proteine, la cellula alla fine decifra le informazioni codificate dalla sequenza lineare di basi all'interno di regioni specifiche del DNA (geni) e produce proteine ​​essenziali per la sopravvivenza cellulare di base, nonché per la normale crescita e differenziazione. In sostanza, i nucleotidi funzionano come un alfabeto biologico utilizzato per codificare gli amminoacidi, i mattoni delle proteine.

Quando vengono inseriti nucleotidi errati o i nucleotidi vengono persi, o quando vengono aggiunti nucleotidi non necessari durante la sintesi del DNA, l'errore viene chiamato mutazione. È stato stimato che si verifica meno di una mutazione ogni 10⁹ nucleotidi incorporati durante la normale replicazione delle cellule. Sebbene le mutazioni non siano necessariamente dannose, le alterazioni che causano l'inattivazione o la sovraespressione di geni importanti possono provocare una varietà di disturbi, tra cui cancro, malattie ereditarie, anomalie dello sviluppo, infertilità e morte embrionale o perinatale. Molto raramente, una mutazione può portare a una maggiore sopravvivenza; tali occorrenze sono la base della selezione naturale.

Sebbene alcune sostanze chimiche reagiscano direttamente con il DNA, la maggior parte richiede l'attivazione metabolica. In quest'ultimo caso, gli intermedi elettrofili come gli epossidi o gli ioni di carbonio sono in ultima analisi responsabili dell'induzione di lesioni in una varietà di siti nucleofili all'interno del materiale genetico (figura 2). In altri casi, la genotossicità è mediata da sottoprodotti dell'interazione dei composti con lipidi intracellulari, proteine ​​o ossigeno.

Figura 2. Bioattivazione di: a) benzo(a)pirene; e b) N-nitrosodimetilammina

A causa della loro relativa abbondanza nelle cellule, le proteine ​​sono il bersaglio più frequente dell'interazione tossica. Tuttavia, la modifica del DNA è di maggiore preoccupazione a causa del ruolo centrale di questa molecola nella regolazione della crescita e della differenziazione attraverso più generazioni di cellule.

A livello molecolare, i composti elettrofili tendono ad attaccare l'ossigeno e l'azoto nel DNA. I siti che sono più inclini alla modifica sono illustrati nella figura 3. Sebbene gli ossigeni all'interno dei gruppi fosfato nella spina dorsale del DNA siano anche bersagli per la modificazione chimica, si ritiene che il danno alle basi sia biologicamente più rilevante poiché questi gruppi sono considerati i principali elementi nella molecola del DNA.

Figura 3. Siti primari di danno al DNA indotto chimicamente

I composti che contengono una porzione elettrofila tipicamente esercitano genotossicità producendo mono-addotti nel DNA. Allo stesso modo, i composti che contengono due o più frazioni reattive possono reagire con due diversi centri nucleofili e quindi produrre legami incrociati intra o intermolecolari nel materiale genetico (figura 4). I legami incrociati tra DNA-DNA e DNA-proteina possono essere particolarmente citotossici poiché possono formare blocchi completi alla replicazione del DNA. Per ovvie ragioni, la morte di una cellula elimina la possibilità che venga mutata o trasformata neoplasticamente. Gli agenti genotossici possono anche agire inducendo rotture nello scheletro del fosfodiestere o tra basi e zuccheri (producendo siti abasici) nel DNA. Tali rotture possono essere un risultato diretto della reattività chimica nel sito del danno o possono verificarsi durante la riparazione di uno dei suddetti tipi di lesione del DNA.

Figura 4. Vari tipi di danno al complesso proteina-DNA

Negli ultimi trenta o quarant'anni sono state sviluppate diverse tecniche per monitorare il tipo di danno genetico indotto da varie sostanze chimiche. Tali saggi sono descritti in dettaglio altrove in questo capitolo e Enciclopedia.

L'errata replicazione di "microlesioni" come mono-addotti, siti abasici o rotture a singolo filamento può in ultima analisi provocare sostituzioni di coppie di basi nucleotidiche o l'inserimento o la delezione di brevi frammenti polinucleotidici nel DNA cromosomico. Al contrario, le "macrolesioni", come addotti voluminosi, collegamenti incrociati o rotture a doppio filamento possono innescare l'acquisizione, la perdita o il riarrangiamento di pezzi relativamente grandi di cromosomi. In ogni caso, le conseguenze possono essere devastanti per l'organismo poiché ognuno di questi eventi può portare alla morte cellulare, alla perdita di funzione o alla trasformazione maligna delle cellule. Il modo esatto in cui il danno al DNA provoca il cancro è in gran parte sconosciuto. Attualmente si ritiene che il processo possa comportare un'attivazione inappropriata di proto-oncogeni come il mio c ed ras, e/o inattivazione di geni soppressori tumorali recentemente identificati come p53. L'espressione anormale di entrambi i tipi di geni abroga i normali meccanismi cellulari per controllare la proliferazione e/o la differenziazione cellulare.

La preponderanza di prove sperimentali indica che lo sviluppo del cancro in seguito all'esposizione a composti elettrofili è un evento relativamente raro. Ciò può essere spiegato, in parte, dalla capacità intrinseca della cellula di riconoscere e riparare il DNA danneggiato o dall'incapacità delle cellule con DNA danneggiato di sopravvivere. Durante la riparazione, la base danneggiata, il nucleotide o il breve tratto di nucleotidi che circonda il sito del danno viene rimosso e (usando il filamento opposto come modello) viene sintetizzato e inserito in posizione un nuovo pezzo di DNA. Per essere efficace, la riparazione del DNA deve avvenire con grande accuratezza prima della divisione cellulare, prima delle opportunità di propagazione della mutazione.

Studi clinici hanno dimostrato che le persone con difetti ereditari nella capacità di riparare il DNA danneggiato spesso sviluppano tumori e/o anomalie dello sviluppo in tenera età (tabella 1). Tali esempi forniscono una forte evidenza che collega l'accumulo di danni al DNA alla malattia umana. Allo stesso modo, gli agenti che promuovono la proliferazione cellulare (come il tetradecanoilforbolo acetato) spesso aumentano la carcinogenesi. Per questi composti, l'aumentata probabilità di trasformazione neoplastica può essere una diretta conseguenza di una diminuzione del tempo a disposizione della cellula per effettuare un'adeguata riparazione del DNA.

Tabella 1. Malattie ereditarie a rischio di cancro che sembrano comportare difetti nella riparazione del DNA

Le prime teorie su come le sostanze chimiche interagiscono con il DNA possono essere fatte risalire a studi condotti durante lo sviluppo del gas mostarda per l'uso in guerra. Un'ulteriore comprensione è nata dagli sforzi per identificare agenti antitumorali che arrestassero selettivamente la replicazione delle cellule tumorali in rapida divisione. La crescente preoccupazione del pubblico per i pericoli nel nostro ambiente ha stimolato ulteriori ricerche sui meccanismi e le conseguenze dell'interazione chimica con il materiale genetico. Esempi di vari tipi di sostanze chimiche che esercitano genotossicità sono presentati nella tabella 2.

Tabella 2. Esempi di sostanze chimiche che presentano genotossicità nelle cellule umane

Di ritorno

Praticamente tutta la medicina è dedicata a prevenire la morte cellulare, in malattie come l'infarto miocardico, l'ictus, il trauma e lo shock, oa provocarla, come nel caso delle malattie infettive e del cancro. È quindi essenziale comprenderne la natura ei meccanismi coinvolti. La morte cellulare è stata classificata come “accidentale”, cioè causata da agenti tossici, ischemia e così via, oppure “programmata”, come avviene durante lo sviluppo embriologico, compresa la formazione delle dita, e il riassorbimento della coda del girino.

Il danno cellulare e la morte cellulare sono, quindi, importanti sia in fisiologia che in fisiopatologia. La morte cellulare fisiologica è estremamente importante durante l'embriogenesi e lo sviluppo embrionale. Lo studio della morte cellulare durante lo sviluppo ha portato a importanti e nuove informazioni sulla genetica molecolare coinvolta, in particolare attraverso lo studio dello sviluppo negli animali invertebrati. In questi animali è stata attentamente studiata la localizzazione precisa e il significato delle cellule destinate a subire la morte cellulare e, con l'utilizzo delle classiche tecniche di mutagenesi, sono stati ora individuati diversi geni coinvolti. Negli organi adulti, l'equilibrio tra morte cellulare e proliferazione cellulare controlla le dimensioni dell'organo. In alcuni organi, come la pelle e l'intestino, c'è un ricambio continuo di cellule. Nella pelle, ad esempio, le cellule si differenziano quando raggiungono la superficie e infine subiscono la differenziazione terminale e la morte cellulare man mano che la cheratinizzazione procede con la formazione di involucri reticolati.

Molte classi di sostanze chimiche tossiche sono in grado di indurre un danno cellulare acuto seguito dalla morte. Questi includono anossia e ischemia e loro analoghi chimici come il cianuro di potassio; agenti cancerogeni chimici, che formano elettrofili che si legano covalentemente alle proteine ​​negli acidi nucleici; sostanze chimiche ossidanti, con conseguente formazione di radicali liberi e danno ossidante; attivazione del complemento; e una varietà di ionofori di calcio. La morte cellulare è anche una componente importante della carcinogenesi chimica; molti cancerogeni chimici completi, a dosi cancerogene, producono necrosi acuta e infiammazione seguite da rigenerazione e preneoplasia.

Definizioni

Danno cellulare

Il danno cellulare è definito come un evento o uno stimolo, come una sostanza chimica tossica, che perturba la normale omeostasi della cellula, causando così il verificarsi di una serie di eventi (figura 1). I principali bersagli della lesione letale illustrati sono l'inibizione della sintesi di ATP, l'interruzione dell'integrità della membrana plasmatica o il ritiro di fattori di crescita essenziali.

Figura 1. Danno cellulare

Le lesioni letali provocano la morte di una cellula dopo un periodo di tempo variabile, a seconda della temperatura, del tipo di cellula e dello stimolo; oppure possono essere subletali o cronici, cioè la lesione risulta in uno stato omeostatico alterato che, sebbene anormale, non provoca morte cellulare (Trump e Arstila 1971; Trump e Berezesky 1992; Trump e Berezesky 1995; Trump, Berezesky e Osornio-Vargas 1981). Nel caso di una lesione letale, c'è una fase precedente al momento della morte cellulare

durante questo periodo, la cellula si riprenderà; tuttavia, dopo un determinato momento (il “punto di non ritorno” o punto di morte cellulare), la rimozione della lesione non comporta la guarigione ma la cellula subisce degradazione e idrolisi, raggiungendo infine l'equilibrio fisico-chimico con il ambiente. Questa è la fase nota come necrosi. Durante la fase preletale si verificano diversi tipi principali di cambiamento, a seconda della cellula e del tipo di lesione. Questi sono noti come apoptosi e oncosi.

Apoptosis

L'apoptosi deriva dalle parole greche apo, che significa lontano da, e ptosi, che significa cadere. Il termine allontanarsi da deriva dal fatto che, durante questo tipo di cambiamento preletale, le cellule si restringono e subiscono un marcato blebbing alla periferia. Le macchie poi si staccano e volano via. L'apoptosi si verifica in una varietà di tipi cellulari in seguito a vari tipi di danno tossico (Wyllie, Kerr e Currie 1980). È particolarmente importante nei linfociti, dove è il meccanismo predominante per il turnover dei cloni linfocitari. I frammenti risultanti risultano nei corpi basofili visti all'interno dei macrofagi nei linfonodi. In altri organi, l'apoptosi si verifica tipicamente in singole cellule che vengono rapidamente eliminate prima e dopo la morte per fagocitosi dei frammenti da parte delle cellule parenchimali adiacenti o dei macrofagi. L'apoptosi che si verifica in singole cellule con successiva fagocitosi in genere non provoca infiammazione. Prima della morte, le cellule apoptotiche mostrano un citosol molto denso con mitocondri normali o condensati. Il reticolo endoplasmatico (ER) è normale o solo leggermente dilatato. La cromatina nucleare è marcatamente raggruppata lungo l'involucro nucleare e attorno al nucleolo. Anche il contorno nucleare è irregolare e si verifica la frammentazione nucleare. La condensazione della cromatina è associata alla frammentazione del DNA che, in molti casi, si verifica tra i nucleosomi, conferendo all'elettroforesi un caratteristico aspetto a scala.

Nell'apoptosi, l'aumento di [Ca²⁺]_i può stimolare K⁺ efflusso con conseguente restringimento cellulare, che probabilmente richiede ATP. Le lesioni che inibiscono totalmente la sintesi di ATP, quindi, hanno maggiori probabilità di provocare l'apoptosi. Un aumento sostenuto di [Ca²⁺]_i ha una serie di effetti deleteri tra cui l'attivazione di proteasi, endonucleasi e fosfolipasi. L'attivazione dell'endonucleasi si traduce in rotture del singolo e doppio filamento di DNA che, a loro volta, stimolano livelli aumentati di p53 e nella ribosilazione di poli-ADP e di proteine ​​nucleari che sono essenziali nella riparazione del DNA. L'attivazione delle proteasi modifica una serie di substrati tra cui l'actina e le proteine ​​correlate che portano alla formazione di bleb. Un altro substrato importante è la poli(ADP-ribosio) polimerasi (PARP), che inibisce la riparazione del DNA. Aumentato [Ca²⁺]_i è anche associato all'attivazione di una serie di protein chinasi, come MAP chinasi, calmodulina chinasi e altre. Tali chinasi sono coinvolte nell'attivazione di fattori di trascrizione che avviano la trascrizione di geni immediatamente precoci, ad esempio c-fos, c-jun e c-myc, e nell'attivazione della fosfolipasi A₂ che si traduce in permeabilizzazione della membrana plasmatica e delle membrane intracellulari come la membrana interna dei mitocondri.

Oncosi

Oncosi, derivato dalla parola greca È s, gonfiarsi, è così chiamato perché in questo tipo di mutamento preletale la cellula inizia a gonfiarsi quasi immediatamente dopo la lesione (Majno e Joris 1995). La ragione del gonfiore è un aumento dei cationi nell'acqua all'interno della cellula. Il principale catione responsabile è il sodio, che normalmente è regolato per mantenere il volume cellulare. Tuttavia, in assenza di ATP o se la Na-ATPasi del plasmalemma è inibita, il controllo del volume viene perso a causa delle proteine ​​intracellulari e il sodio nell'acqua continua ad aumentare. Tra gli eventi precoci in oncosi sono, quindi, aumentati [Na⁺]_i che porta al rigonfiamento cellulare e all'aumento di [Ca²⁺]_i derivanti dall'afflusso dallo spazio extracellulare o dal rilascio dai depositi intracellulari. Ciò si traduce in gonfiore del citosol, gonfiore del reticolo endoplasmatico e dell'apparato di Golgi e formazione di bolle acquose attorno alla superficie cellulare. I mitocondri inizialmente subiscono la condensazione, ma in seguito anch'essi mostrano un rigonfiamento ad alta ampiezza a causa del danno alla membrana mitocondriale interna. In questo tipo di mutamento preletale, la cromatina subisce condensazione e infine degradazione; tuttavia, non si vede il caratteristico schema a scala dell'apoptosi.

Necrosi

La necrosi si riferisce alla serie di cambiamenti che si verificano dopo la morte cellulare quando la cellula viene convertita in detriti che vengono tipicamente rimossi dalla risposta infiammatoria. Si possono distinguere due tipi: necrosi oncotica e necrosi apoptotica. La necrosi oncotica si verifica tipicamente in ampie zone, ad esempio, in un infarto del miocardio o a livello regionale in un organo dopo tossicità chimica, come il tubulo prossimale renale in seguito alla somministrazione di HgCl₂. Sono interessate ampie zone di un organo e le cellule necrotiche inducono rapidamente una reazione infiammatoria, prima acuta e poi cronica. Nel caso in cui l'organismo sopravviva, in molti organi la necrosi è seguita dall'eliminazione delle cellule morte e dalla rigenerazione, ad esempio, nel fegato o nel rene a seguito di tossicità chimica. Al contrario, la necrosi apoptotica si verifica tipicamente su una singola cellula ei detriti necrotici si formano all'interno dei fagociti dei macrofagi o delle cellule parenchimali adiacenti. Le prime caratteristiche delle cellule necrotiche includono interruzioni nella continuità della membrana plasmatica e la comparsa di densità flocculanti, che rappresentano proteine ​​denaturate all'interno della matrice mitocondriale. In alcune forme di lesione che inizialmente non interferiscono con l'accumulo di calcio mitocondriale, si possono osservare depositi di fosfato di calcio all'interno dei mitocondri. Altri sistemi di membrana si stanno frammentando in modo simile, come l'ER, i lisosomi e l'apparato di Golgi. Infine, la cromatina nucleare subisce la lisi, risultante dall'attacco delle idrolasi lisosomiali. Dopo la morte cellulare, le idrolasi lisosomiali svolgono un ruolo importante nell'eliminazione dei detriti con catepsine, nucleolasi e lipasi poiché queste hanno un pH acido ottimale e possono sopravvivere al basso pH delle cellule necrotiche mentre altri enzimi cellulari sono denaturati e inattivati.

meccanismi

Stimolo iniziale

Nel caso di lesioni letali, le interazioni iniziali più comuni che provocano lesioni che portano alla morte cellulare sono l'interferenza con il metabolismo energetico, come anossia, ischemia o inibitori della respirazione, e la glicolisi come cianuro di potassio, monossido di carbonio, iodo-acetato e presto. Come accennato in precedenza, alte dosi di composti che inibiscono il metabolismo energetico provocano tipicamente oncosi. L'altro tipo comune di lesione iniziale con conseguente morte cellulare acuta è la modifica della funzione della membrana plasmatica (Trump e Arstila 1971; Trump, Berezesky e Osornio-Vargas 1981). Questo può essere danno diretto e permeabilizzazione, come nel caso di trauma o attivazione del complesso C5b-C9 del complemento, danno meccanico alla membrana cellulare o inibizione del sodio-potassio (Na⁺-K⁺) pompa con glicosidi come ouabain. Ionofori di calcio come ionomicina o A23187, che trasportano rapidamente [Ca²⁺] lungo il gradiente nella cellula, causano anche lesioni letali acute. In alcuni casi, lo schema del cambiamento preletale è l'apoptosi; in altri, è oncosi.

Vie di segnalazione

Con molti tipi di lesioni, la respirazione mitocondriale e la fosforilazione ossidativa vengono rapidamente colpite. In alcune cellule, questo stimola la glicolisi anaerobica, che è in grado di mantenere l'ATP, ma con molte lesioni questa viene inibita. La mancanza di ATP si traduce nella mancata attivazione di una serie di importanti processi omeostatici, in particolare il controllo dell'omeostasi ionica intracellulare (Trump e Berezesky 1992; Trump, Berezesky e Osornio-Vargas 1981). Ciò si traduce in un rapido aumento di [Ca²⁺]_i, e aumentato [Na⁺] e [cl^-] si traduce in gonfiore delle cellule. Aumenti di [Ca²⁺]_i comportano l'attivazione di una serie di altri meccanismi di segnalazione discussi di seguito, inclusa una serie di chinasi, che possono provocare un aumento immediato della trascrizione genica precoce. Aumentato [Ca²⁺]_i modifica anche la funzione citoscheletrica, determinando in parte la formazione di bolle e l'attivazione di endonucleasi, proteasi e fosfolipasi. Questi sembrano innescare molti degli effetti importanti discussi sopra, come il danno alla membrana attraverso l'attivazione di proteasi e lipasi, la degradazione diretta del DNA dall'attivazione dell'endonucleasi e l'attivazione di chinasi come MAP chinasi e calmodulina chinasi, che agiscono come fattori di trascrizione.

Attraverso un ampio lavoro sullo sviluppo negli invertebrati C. elegans ed Drosophila, oltre alle cellule umane e animali, sono stati identificati una serie di geni pro-morte. È stato scoperto che alcuni di questi geni degli invertebrati hanno controparti nei mammiferi. Ad esempio, il gene ced-3, che è essenziale per la morte cellulare programmata in C. elegans, ha attività proteasica e una forte omologia con l'enzima di conversione dell'interleuchina dei mammiferi (ICE). Un gene strettamente correlato chiamato apopain o prICE è stato recentemente identificato con un'omologia ancora più stretta (Nicholson et al. 1995). In Drosophila, il gene reaper sembra essere coinvolto in un segnale che porta alla morte cellulare programmata. Altri geni pro-morte includono la proteina di membrana Fas e l'importante gene soppressore del tumore, p53, che è ampiamente conservato. p53 è indotto a livello proteico in seguito a danno al DNA e quando fosforilato agisce come fattore di trascrizione per altri geni come gadd45 e waf-1, che sono coinvolti nella segnalazione di morte cellulare. Anche altri geni precoci immediati come c-fos, c-jun e c-myc sembrano essere coinvolti in alcuni sistemi.

Allo stesso tempo, ci sono geni anti-morte che sembrano contrastare i geni pro-morte. Il primo di questi ad essere identificato è stato ced-9 from C. elegans, che è omologa a bcl-2 negli esseri umani. Questi geni agiscono in un modo ancora sconosciuto per prevenire l'uccisione cellulare da parte di tossine genetiche o chimiche. Alcune prove recenti indicano che bcl-2 può agire come antiossidante. Attualmente, sono in corso molti sforzi per sviluppare una comprensione dei geni coinvolti e per sviluppare modi per attivare o inibire questi geni, a seconda della situazione.

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La tossicologia meccanicistica è lo studio di come gli agenti chimici o fisici interagiscono con gli organismi viventi per causare tossicità. La conoscenza del meccanismo di tossicità di una sostanza migliora la capacità di prevenire la tossicità e progettare sostanze chimiche più desiderabili; costituisce la base per la terapia in caso di sovraesposizione e spesso consente un'ulteriore comprensione dei processi biologici fondamentali. Ai fini di questo Enciclopedia l'accento sarà posto sugli animali per prevedere la tossicità umana. Diverse aree della tossicologia includono la tossicologia meccanicistica, descrittiva, normativa, forense e ambientale (Klaassen, Amdur e Doull 1991). Tutti questi traggono vantaggio dalla comprensione dei meccanismi fondamentali della tossicità.

Perché comprendere i meccanismi di tossicità?

Comprendere il meccanismo mediante il quale una sostanza provoca tossicità migliora diverse aree della tossicologia in modi diversi. La comprensione meccanicistica aiuta il regolatore governativo a stabilire limiti di sicurezza legalmente vincolanti per l'esposizione umana. Aiuta i tossicologi a raccomandare linee d'azione riguardanti la bonifica o la bonifica di siti contaminati e, insieme alle proprietà fisiche e chimiche della sostanza o miscela, può essere utilizzato per selezionare il grado di equipaggiamento protettivo richiesto. La conoscenza meccanicistica è utile anche per formare le basi per la terapia e la progettazione di nuovi farmaci per il trattamento delle malattie umane. Per il tossicologo forense il meccanismo della tossicità spesso fornisce informazioni su come un agente chimico o fisico può causare la morte o l'incapacità.

Se si comprende il meccanismo della tossicità, la tossicologia descrittiva diventa utile per prevedere gli effetti tossici delle sostanze chimiche correlate. È importante comprendere, tuttavia, che la mancanza di informazioni meccanicistiche non dissuade gli operatori sanitari dal proteggere la salute umana. Decisioni prudenti basate su studi sugli animali e sull'esperienza umana vengono utilizzate per stabilire livelli di esposizione sicuri. Tradizionalmente, un margine di sicurezza è stato stabilito utilizzando il "livello senza effetti avversi" o un "livello di effetti avversi più basso" da studi sugli animali (utilizzando disegni di esposizione ripetuta) e dividendo tale livello per un fattore di 100 per l'esposizione professionale o 1,000 per altra esposizione ambientale umana. Il successo di questo processo è evidente dai pochi casi di effetti nocivi per la salute attribuiti all'esposizione chimica nei lavoratori in cui in passato erano stati fissati e rispettati limiti di esposizione appropriati. Inoltre, la durata della vita umana continua ad aumentare, così come la qualità della vita. In generale, l'uso dei dati sulla tossicità ha portato a un efficace controllo normativo e volontario. La conoscenza dettagliata dei meccanismi tossici migliorerà la prevedibilità dei nuovi modelli di rischio attualmente in fase di sviluppo e si tradurrà in un miglioramento continuo.

La comprensione dei meccanismi ambientali è complessa e presuppone una conoscenza della perturbazione dell'ecosistema e dell'omeostasi (equilibrio). Anche se non discusso in questo articolo, una migliore comprensione dei meccanismi tossici e delle loro conseguenze finali in un ecosistema aiuterebbe gli scienziati a prendere decisioni prudenti in merito alla gestione dei rifiuti urbani e industriali. La gestione dei rifiuti è un'area di ricerca in crescita e continuerà ad essere molto importante in futuro.

Tecniche per lo studio dei meccanismi di tossicità

La maggior parte degli studi meccanicistici inizia con uno studio tossicologico descrittivo sugli animali o osservazioni cliniche sugli esseri umani. Idealmente, gli studi sugli animali includono attente osservazioni comportamentali e cliniche, attento esame biochimico di elementi del sangue e dell'urina per segni di funzione avversa dei principali sistemi biologici nel corpo e una valutazione post mortem di tutti i sistemi di organi mediante esame microscopico per verificare la presenza di lesioni (vedere le linee guida sui test dell'OCSE; le direttive CE sulla valutazione delle sostanze chimiche; le regole sui test dell'EPA degli Stati Uniti; i regolamenti sui prodotti chimici del Giappone). Questo è analogo a un esame fisico umano approfondito che si svolgerebbe in un ospedale per un periodo di tempo di due o tre giorni, ad eccezione dell'autopsia.

Comprendere i meccanismi della tossicità è l'arte e la scienza dell'osservazione, la creatività nella selezione delle tecniche per testare varie ipotesi e l'integrazione innovativa di segni e sintomi in una relazione causale. Gli studi meccanicistici iniziano con l'esposizione, seguono la distribuzione correlata al tempo e il destino nel corpo (farmacocinetica) e misurano l'effetto tossico risultante a un certo livello del sistema ea un certo livello di dose. Sostanze diverse possono agire a diversi livelli del sistema biologico causando tossicità.

Esposizione

La via di esposizione negli studi meccanicistici è solitamente la stessa dell'esposizione umana. La via è importante perché possono esserci effetti che si verificano localmente nel sito di esposizione oltre agli effetti sistemici dopo che la sostanza chimica è stata assorbita nel sangue e distribuita in tutto il corpo. Un esempio semplice ma convincente di un effetto locale sarebbe l'irritazione e l'eventuale corrosione della pelle in seguito all'applicazione di forti soluzioni acide o alcaline progettate per la pulizia di superfici dure. Allo stesso modo, l'irritazione e la morte cellulare possono verificarsi nelle cellule che rivestono il naso e/oi polmoni in seguito all'esposizione a vapori o gas irritanti come ossidi di azoto o ozono. (Entrambi sono costituenti dell'inquinamento atmosferico, o smog). Dopo l'assorbimento di una sostanza chimica nel sangue attraverso la pelle, i polmoni o il tratto gastrointestinale, la concentrazione in qualsiasi organo o tessuto è controllata da molti fattori che determinano la farmacocinetica della sostanza chimica nel corpo. Il corpo ha la capacità di attivare e disintossicare varie sostanze chimiche come indicato di seguito.

Ruolo della farmacocinetica nella tossicità

La farmacocinetica descrive le relazioni temporali per l'assorbimento chimico, la distribuzione, il metabolismo (alterazioni biochimiche nel corpo) e l'eliminazione o l'escrezione dal corpo. Relativamente ai meccanismi di tossicità, queste variabili farmacocinetiche possono essere molto importanti e in alcuni casi determinare se la tossicità si verificherà o meno. Ad esempio, se un materiale non viene assorbito in quantità sufficiente, non si verificherà tossicità sistemica (all'interno del corpo). Al contrario, una sostanza chimica altamente reattiva che viene disintossicata rapidamente (secondi o minuti) dagli enzimi digestivi o epatici potrebbe non avere il tempo di causare tossicità. Alcune sostanze e miscele alogenate policicliche così come alcuni metalli come il piombo non causerebbero una tossicità significativa se l'escrezione fosse rapida; ma l'accumulo a livelli sufficientemente elevati ne determina la tossicità poiché l'escrezione non è rapida (talvolta misurata in anni). Fortunatamente, la maggior parte delle sostanze chimiche non ha una ritenzione così lunga nel corpo. L'accumulo di un materiale innocuo non indurrebbe ancora tossicità. Il tasso di eliminazione dal corpo e disintossicazione è spesso indicato come l'emivita della sostanza chimica, che è il tempo in cui il 50% della sostanza chimica viene espulso o alterato in una forma non tossica.

Tuttavia, se una sostanza chimica si accumula in una particolare cellula o organo, ciò potrebbe segnalare un motivo per esaminare ulteriormente la sua potenziale tossicità in quell'organo. Più recentemente, sono stati sviluppati modelli matematici per estrapolare le variabili farmacocinetiche dagli animali all'uomo. Questi modelli farmacocinetici sono estremamente utili per generare ipotesi e verificare se l'animale sperimentale può essere una buona rappresentazione per l'uomo. Su questo argomento sono stati scritti numerosi capitoli e testi (Gehring et al. 1976; Reitz et al. 1987; Nolan et al. 1995). Un esempio semplificato di un modello fisiologico è rappresentato in figura 1.

Figura 1. Un modello farmacocinetico semplificato

Diversi livelli e sistemi possono essere influenzati negativamente

La tossicità può essere descritta a diversi livelli biologici. La lesione può essere valutata nell'intera persona (o animale), nel sistema di organi, nella cellula o nella molecola. I sistemi di organi includono il sistema immunitario, respiratorio, cardiovascolare, renale, endocrino, digestivo, muscolo-scheletrico, sanguigno, riproduttivo e nervoso centrale. Alcuni organi chiave includono fegato, reni, polmoni, cervello, pelle, occhi, cuore, testicoli o ovaie e altri organi importanti. A livello cellulare/biochimico, gli effetti avversi includono l'interferenza con la normale funzione proteica, la funzione del recettore endocrino, l'inibizione dell'energia metabolica o l'inibizione o l'induzione di enzimi xenobiotici (sostanze estranee). Gli effetti avversi a livello molecolare comprendono l'alterazione della normale funzione della trascrizione del DNA-RNA, del legame specifico del recettore citoplasmatico e nucleare e dei geni o dei prodotti genici. In definitiva, la disfunzione in un sistema di organi principali è probabilmente causata da un'alterazione molecolare in una particolare cellula bersaglio all'interno di quell'organo. Tuttavia, non sempre è possibile ricondurre un meccanismo a un'origine molecolare della causalità, né è necessario. L'intervento e la terapia possono essere progettati senza una completa comprensione del bersaglio molecolare. Tuttavia, la conoscenza del meccanismo specifico della tossicità aumenta il valore predittivo e l'accuratezza dell'estrapolazione ad altre sostanze chimiche. La figura 2 è una rappresentazione schematica dei vari livelli in cui è possibile rilevare l'interferenza dei normali processi fisiologici. Le frecce indicano che le conseguenze per un individuo possono essere determinate dall'alto verso il basso (esposizione, farmacocinetica a tossicità sistemica/organo) o dal basso verso l'alto (cambiamento molecolare, effetto cellulare/biochimico a tossicità sistemica/organo).

Figura 2. Rappresentazione dei meccanismi di tossicità

Esempi di meccanismi di tossicità

I meccanismi di tossicità possono essere semplici o molto complessi. Spesso c'è una differenza tra il tipo di tossicità, il meccanismo di tossicità e il livello dell'effetto, in relazione al fatto che gli effetti avversi siano dovuti a una singola dose elevata acuta (come un avvelenamento accidentale) o a una dose inferiore esposizione ripetuta (da esposizione professionale o ambientale). Classicamente, a scopo di test, una singola dose elevata acuta viene somministrata mediante intubazione diretta nello stomaco di un roditore o esposizione a un'atmosfera di gas o vapore per due o quattro ore, a seconda di quale sia meglio simile all'esposizione umana. Gli animali vengono osservati per un periodo di due settimane dopo l'esposizione e quindi i principali organi esterni e interni vengono esaminati per rilevare lesioni. I test a dose ripetuta vanno da mesi ad anni. Per le specie di roditori, due anni sono considerati uno studio cronico (durata della vita) sufficiente per valutare la tossicità e la cancerogenicità, mentre per i primati non umani, due anni sarebbero considerati uno studio subcronico (meno della vita) per valutare la tossicità a dose ripetuta. Dopo l'esposizione viene condotto un esame completo di tutti i tessuti, organi e fluidi per determinare eventuali effetti avversi.

Meccanismi di tossicità acuta

I seguenti esempi sono specifici per effetti acuti ad alte dosi che possono portare alla morte o a gravi inabilitazioni. Tuttavia, in alcuni casi, l'intervento comporterà effetti transitori e completamente reversibili. La dose o la gravità dell'esposizione determineranno il risultato.

Asfissianti semplici. Il meccanismo di tossicità dei gas inerti e di alcune altre sostanze non reattive è la mancanza di ossigeno (anossia). Queste sostanze chimiche, che causano la privazione di ossigeno al sistema nervoso centrale (SNC), sono chiamate semplici asfissianti. Se una persona entra in uno spazio chiuso che contiene azoto senza ossigeno sufficiente, si verifica un'immediata deplezione di ossigeno nel cervello che porta all'incoscienza e infine alla morte se la persona non viene rimossa rapidamente. In casi estremi (quasi zero ossigeno) l'incoscienza può verificarsi in pochi secondi. Il salvataggio dipende dalla rapida rimozione in un ambiente ossigenato. La sopravvivenza con danno cerebrale irreversibile può verificarsi a causa di un salvataggio ritardato, a causa della morte dei neuroni, che non possono rigenerarsi.

Asfissianti chimici. Il monossido di carbonio (CO) compete con l'ossigeno per legarsi all'emoglobina (nei globuli rossi) e quindi priva i tessuti dell'ossigeno per il metabolismo energetico; ne può derivare la morte cellulare. L'intervento comprende la rimozione dalla fonte di CO e il trattamento con ossigeno. L'uso diretto dell'ossigeno si basa sull'azione tossica del CO. Un altro potente asfissiante chimico è il cianuro. Lo ione cianuro interferisce con il metabolismo cellulare e l'utilizzo dell'ossigeno per produrre energia. Il trattamento con nitrito di sodio provoca un cambiamento dell'emoglobina nei globuli rossi in metaemoglobina. La metaemoglobina ha una maggiore affinità di legame con lo ione cianuro rispetto al bersaglio cellulare del cianuro. Di conseguenza, la metaemoglobina lega il cianuro e tiene il cianuro lontano dalle cellule bersaglio. Questo costituisce la base per la terapia antidotica.

Depressori del sistema nervoso centrale (SNC).. La tossicità acuta è caratterizzata da sedazione o incoscienza per una serie di materiali come solventi che non sono reattivi o che si trasformano in intermedi reattivi. Si ipotizza che la sedazione/anestesia sia dovuta a un'interazione del solvente con le membrane delle cellule del SNC, che compromette la loro capacità di trasmettere segnali elettrici e chimici. Mentre la sedazione può sembrare una lieve forma di tossicità ed è stata la base per lo sviluppo dei primi anestetici, "la dose fa ancora il veleno". Se viene somministrata una dose sufficiente per ingestione o inalazione, l'animale può morire per arresto respiratorio. Se non si verifica la morte per anestesia, questo tipo di tossicità è solitamente facilmente reversibile quando il soggetto viene rimosso dall'ambiente o la sostanza chimica viene ridistribuita o eliminata dal corpo.

Effetti sulla pelle. Gli effetti negativi sulla pelle possono variare dall'irritazione alla corrosione, a seconda della sostanza incontrata. Gli acidi forti e le soluzioni alcaline sono incompatibili con i tessuti viventi e sono corrosivi, causando ustioni chimiche e possibili cicatrici. La cicatrizzazione è dovuta alla morte delle cellule dermiche profonde della pelle responsabili della rigenerazione. Concentrazioni inferiori possono solo causare irritazione del primo strato di pelle.

Un altro meccanismo tossico specifico della pelle è quello della sensibilizzazione chimica. Ad esempio, la sensibilizzazione si verifica quando il 2,4-dinitroclorobenzene si lega alle proteine ​​naturali della pelle e il sistema immunitario riconosce il complesso alterato legato alle proteine ​​come materiale estraneo. In risposta a questo materiale estraneo, il sistema immunitario attiva cellule speciali per eliminare la sostanza estranea mediante il rilascio di mediatori (citochine) che causano eruzioni cutanee o dermatiti (vedi “Immunotossicologia”). Questa è la stessa reazione del sistema immunitario quando si verifica l'esposizione all'edera velenosa. La sensibilizzazione immunitaria è molto specifica per la particolare sostanza chimica e richiede almeno due esposizioni prima che venga suscitata una risposta. La prima esposizione sensibilizza (prepara le cellule a riconoscere la sostanza chimica) e le successive esposizioni innescano la risposta del sistema immunitario. La rimozione dal contatto e la terapia sintomatica con creme antinfiammatorie contenenti steroidi sono generalmente efficaci nel trattamento di individui sensibilizzati. Nei casi gravi o refrattari viene utilizzato un immunosoppressore ad azione sistemica come il prednisone in combinazione con il trattamento topico.

Sensibilizzazione polmonare. Una risposta di sensibilizzazione immunitaria è provocata dal toluene diisocianato (TDI), ma il sito bersaglio sono i polmoni. La sovraesposizione al TDI in soggetti predisposti provoca edema polmonare (accumulo di liquidi), costrizione bronchiale e respirazione compromessa. Questa è una condizione grave e richiede la rimozione dell'individuo da potenziali esposizioni successive. Il trattamento è principalmente sintomatico. La sensibilizzazione della pelle e dei polmoni segue una risposta alla dose. Il superamento del livello fissato per l'esposizione professionale può causare effetti negativi.

Effetti sugli occhi. Le lesioni agli occhi vanno dall'arrossamento dello strato esterno (arrossamento da piscina) alla formazione di cataratta della cornea fino al danneggiamento dell'iride (parte colorata dell'occhio). I test di irritazione oculare vengono condotti quando si ritiene che non si verificheranno lesioni gravi. Molti dei meccanismi che causano la corrosione della pelle possono anche causare lesioni agli occhi. I materiali corrosivi per la pelle, come gli acidi forti (pH inferiore a 2) e gli alcali (pH superiore a 11.5), non sono testati sugli occhi degli animali perché la maggior parte causerà corrosione e cecità a causa di un meccanismo simile a quello che provoca la corrosione della pelle . Inoltre, agenti tensioattivi come detergenti e tensioattivi possono causare lesioni agli occhi che vanno dall'irritazione alla corrosione. Un gruppo di materiali che richiede cautela sono i tensioattivi caricati positivamente (cationici), che possono causare ustioni, opacità permanente della cornea e vascolarizzazione (formazione di vasi sanguigni). Un'altra sostanza chimica, il dinitrofenolo, ha un effetto specifico sulla formazione della cataratta. Ciò sembra essere correlato alla concentrazione di questa sostanza chimica nell'occhio, che è un esempio di specificità distributiva farmacocinetica.

Sebbene l'elenco di cui sopra sia lungi dall'essere esaustivo, è progettato per dare al lettore un apprezzamento per vari meccanismi di tossicità acuta.

Meccanismi di tossicità subcronica e cronica

Quando vengono somministrati come singola dose elevata, alcuni prodotti chimici non hanno lo stesso meccanismo di tossicità di quando vengono somministrati ripetutamente come dose inferiore ma comunque tossica. Quando viene somministrata una singola dose elevata, c'è sempre la possibilità di superare la capacità della persona di disintossicare o espellere la sostanza chimica, e questo può portare a una risposta tossica diversa rispetto a quando vengono somministrate dosi ripetitive inferiori. L'alcol è un buon esempio. Alte dosi di alcol portano a effetti primari sul sistema nervoso centrale, mentre dosi ripetute inferiori provocano danni al fegato.

Inibizione anticolinesterasica. La maggior parte dei pesticidi organofosfati, ad esempio, ha poca tossicità per i mammiferi fino a quando non viene attivata metabolicamente, principalmente nel fegato. Il principale meccanismo d'azione degli organofosfati è l'inibizione dell'acetilcolinesterasi (AChE) nel cervello e nel sistema nervoso periferico. AChE è l'enzima normale che termina la stimolazione del neurotrasmettitore acetilcolina. Una lieve inibizione dell'AChE per un periodo prolungato non è stata associata a effetti avversi. A livelli elevati di esposizione, l'incapacità di terminare questa stimolazione neuronale provoca una sovrastimolazione del sistema nervoso colinergico. La sovrastimolazione colinergica alla fine si traduce in una serie di sintomi, incluso l'arresto respiratorio, seguito dalla morte se non trattata. Il trattamento primario è la somministrazione di atropina, che blocca gli effetti dell'acetilcolina, e la somministrazione di cloruro di pralidossima, che riattiva l'AChE inibito. Pertanto, sia la causa che il trattamento della tossicità da organofosfati vengono affrontati comprendendo le basi biochimiche della tossicità.

Attivazione metabolica. Molte sostanze chimiche, tra cui il tetracloruro di carbonio, il cloroformio, l'acetilamminofluorene, le nitrosammine e il paraquat sono metabolicamente attivate a radicali liberi o altri intermedi reattivi che inibiscono e interferiscono con la normale funzione cellulare. Ad alti livelli di esposizione ciò provoca la morte cellulare (vedi “Danno cellulare e morte cellulare”). Mentre le interazioni specifiche ei bersagli cellulari rimangono sconosciuti, i sistemi di organi che hanno la capacità di attivare queste sostanze chimiche, come fegato, reni e polmoni, sono tutti potenziali bersagli di lesioni. Nello specifico, particolari cellule all'interno di un organo hanno una capacità maggiore o minore di attivare o disintossicare questi intermedi, e questa capacità determina la suscettibilità intracellulare all'interno di un organo. Il metabolismo è uno dei motivi per cui la comprensione della farmacocinetica, che descrive questi tipi di trasformazioni e la distribuzione e l'eliminazione di questi intermedi, è importante per riconoscere il meccanismo d'azione di queste sostanze chimiche.

Meccanismi del cancro. Il cancro è una molteplicità di malattie e mentre la comprensione di alcuni tipi di cancro sta aumentando rapidamente a causa delle numerose tecniche biologiche molecolari che sono state sviluppate dal 1980, c'è ancora molto da imparare. Tuttavia, è chiaro che lo sviluppo del cancro è un processo in più fasi e che i geni critici sono fondamentali per diversi tipi di cancro. Le alterazioni del DNA (mutazioni somatiche) in alcuni di questi geni critici possono causare un aumento della suscettibilità o lesioni cancerose (vedi “Tossicologia genetica”). L'esposizione a sostanze chimiche naturali (nei cibi cotti come manzo e pesce) o chimiche sintetiche (come la benzidina, usata come colorante) o agenti fisici (luce ultravioletta del sole, radon dal suolo, radiazioni gamma da procedure mediche o attività industriale) sono tutte contributori alle mutazioni geniche somatiche. Tuttavia, esistono sostanze naturali e sintetiche (come gli antiossidanti) e processi di riparazione del DNA che sono protettivi e mantengono l'omeostasi. È chiaro che la genetica è un fattore importante nel cancro, poiché sindromi di malattie genetiche come lo xeroderma pigmentoso, in cui manca la normale riparazione del DNA, aumentano notevolmente la suscettibilità al cancro della pelle dall'esposizione alla luce ultravioletta del sole.

Meccanismi riproduttivi. Analogamente al cancro, sono noti molti meccanismi di tossicità riproduttiva e/o dello sviluppo, ma c'è ancora molto da imparare. È noto che alcuni virus (come la rosolia), infezioni batteriche e farmaci (come talidomide e vitamina A) influiranno negativamente sullo sviluppo. Recentemente, il lavoro di Khera (1991), rivisto da Carney (1994), mostra una buona evidenza che gli effetti sullo sviluppo anormali nei test sugli animali con glicole etilenico sono attribuibili ai metaboliti acidi metabolici materni. Ciò si verifica quando il glicole etilenico viene metabolizzato in metaboliti acidi tra cui acido glicolico e ossalico. I successivi effetti sulla placenta e sul feto sembrano essere dovuti a questo processo di tossicità metabolica.

Conclusione

L'intento di questo articolo è quello di fornire una prospettiva su diversi meccanismi noti di tossicità e la necessità di studi futuri. È importante capire che la conoscenza meccanicistica non è assolutamente necessaria per proteggere la salute umana o ambientale. Questa conoscenza migliorerà la capacità del professionista di prevedere e gestire meglio la tossicità. Le effettive tecniche utilizzate per chiarire qualsiasi particolare meccanismo dipendono dalla conoscenza collettiva degli scienziati e dal pensiero di coloro che prendono decisioni riguardanti la salute umana.

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