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毒性試験方法

日曜日、1月16 2011 18:45

バイオマーカー

抽出時間と バイオマーカー 生物学的マーカーの略で、人体などの生物学的システムで発生する測定可能なイベントを指す用語です。 このイベントは、生物のより一般的な状態または平均余命の反映またはマーカーとして解釈されます。 労働衛生では、一般的にバイオマーカーが健康状態や疾病リスクの指標として使用されます。

バイオマーカーは、ヒトを含む可能性のある in vitro および in vivo 研究に使用されます。 通常、1 つの特定のタイプの生物学的マーカーが識別されます。 いくつかのバイオマーカーは分類が難しいかもしれませんが、通常、それらは曝露のバイオマーカー、影響のバイオマーカー、または感受性のバイオマーカーに分けられます (表 XNUMX を参照)。

表 1. 労働衛生の毒物学研究で使用される曝露のバイオマーカーまたは影響のバイオマーカーの例

サンプル 測定 目的
曝露バイオマーカー
脂肪組織 ダイオキシン ダイオキシン暴露
Lead 鉛暴露
アルミ アルミニウム露出
呼気 トルエン トルエン暴露
ヘア マーキュリー メチル水銀曝露
ヒアルロン酸抗酸化セラム ベンゼン ベンゼン暴露
尿 フェノール ベンゼン暴露
効果バイオマーカー
カルボキシヘモグロビン 一酸化炭素曝露
赤血球 亜鉛プロトポルフィリン 鉛暴露
ヒアルロン酸抗酸化セラム コリンエステラーゼ 有機リン曝露
尿 ミクログロブリン 腎毒性暴露
白血球 DNA付加物 変異原曝露

 

許容できる程度の妥当性があれば、バイオマーカーはいくつかの目的に使用できます。 バイオマーカーは、特定のタイプの中毒または他の化学的に誘発された悪影響の診断を支持または否定するために使用される場合があります。 健康な被験者では、バイオマーカーは特定の化学物質への曝露に対する個人の過敏性も反映する可能性があるため、リスク予測とカウンセリングの基礎として役立つ可能性があります. 暴露された労働者のグループでは、いくつかの暴露バイオマーカーを適用して、汚染軽減規制への準拠の程度または一般的な予防努力の有効性を評価できます。

曝露のバイオマーカー

曝露バイオマーカーは、体内の外因性化合物(または代謝産物)、化合物(または代謝産物)と内因性成分との間の相互作用生成物、または曝露に関連する別の事象である可能性があります。 最も一般的には、金属などの安定した化合物への曝露のバイオマーカーには、血液、血清、尿などの適切なサンプル中の金属濃度の測定値が含まれます。 揮発性化学物質の場合、(汚染のない空気を吸入した後) 呼気中のそれらの濃度を評価することができます。 化合物が体内で代謝される場合、XNUMX つまたは複数の代謝産物が曝露のバイオマーカーとして選択される可能性があります。 代謝物は、多くの場合、尿サンプルで測定されます。

最新の分析方法により、有機化合物の異性体または同族体の分離、および金属化合物のスペシエーションまたは特定の元素の同位体比の決定が可能になる場合があります。 高度な分析により、反応性化学物質との結合によって引き起こされる DNA やその他の高分子の構造の変化を調べることができます。 このような高度な技術は、バイオマーカー研究への応用において重要性が大幅に高まることは間違いありません。検出限界が低くなり、分析の妥当性が向上することで、これらのバイオマーカーがさらに有用になる可能性があります。

変異原性化学物質への暴露のバイオマーカーに関して、特に有望な開発が行われています。 これらの化合物は反応性があり、タンパク質や DNA などの高分子と付加物を形成する場合があります。 白血球または組織生検で DNA 付加物が検出される場合があり、特定の DNA 断片が尿中に排泄される場合があります。 例えば、エチレンオキシドへの暴露は DNA 塩基との反応を引き起こし、損傷した塩基の除去後、N-7-(2-ヒドロキシエチル)グアニンは尿中に排出されます。 一部の付加物は、特定の暴露を直接言及していない場合があります。 たとえば、8-ヒドロキシ-2'-デオキシグアノシンは DNA への酸化的損傷を反映しており、この反応はいくつかの化合物によって引き起こされる可能性があり、そのほとんどは脂質過酸化も誘発します。

付加体形成または酸化によって、他の巨大分子も変化し得る。 特に興味深いことに、そのような反応性化合物は、化合物への曝露のバイオマーカーとして決定できるヘモグロビン付加物を生成する可能性があります。 利点は、血液サンプルから十分な量のヘモグロビンを取得できることです。赤血球の寿命が XNUMX か月であることを考えると、タンパク質のアミノ酸で形成された付加体は、この期間中の総暴露量を示します。

付加物は、高性能脂質クロマトグラフィーなどの高感度技術によって決定される場合があり、いくつかの免疫学的方法も利用できます。 一般に、分析方法は新しく、高価であり、さらなる開発と検証が必要です。 を使用することで、より良い感度を得ることができます。 32DNA損傷が起こったことを非特異的に示すPポストラベリングアッセイ。 これらの技術はすべて、生物学的モニタリングに役立つ可能性があり、ますます多くの研究に適用されています。 しかし、よりシンプルで感度の高い分析方法が必要です。 一部の方法は低レベルの暴露で特異性が限られているため、喫煙やその他の要因が測定結果に大きな影響を与える可能性があり、解釈が困難になる可能性があります。

変異原性化合物、または変異原に代謝される化合物への暴露は、暴露された個人からの尿の変異原性を評価することによって決定することもできます。 尿サンプルは、簡単に測定できる方法で特定の点変異が発現している細菌株と一緒に培養されます。 尿サンプルに変異原性化学物質が存在する場合、細菌の変異率が高くなります。

曝露バイオマーカーは、曝露の時間的変動および異なるコンパートメントとの関係に関して評価する必要があります。 したがって、バイオマーカーによって表される時間枠、つまりバイオマーカー測定値が過去の曝露および/または蓄積された身体負荷を反映する程度は、結果を解釈するためにトキシコキネティックスデータから決定する必要があります。 特に、バイオマーカーが特定の標的臓器に留まる程度を考慮する必要があります。 血液サンプルはバイオマーカーの研究によく使用されますが、末梢血はコンパートメント間の輸送媒体として機能しますが、一般にコンパートメントとは見なされません。 血液中の濃度がさまざまな臓器のレベルを反映する程度は、さまざまな化学物質間で大きく異なり、通常、曝露の長さと曝露からの時間にも依存します。

このタイプの証拠は、バイオマーカーを(総)吸収線量の指標または有効線量(すなわち、標的組織に到達した量)の指標として分類するために使用されることがあります。 例えば、特定の溶媒への曝露は、曝露後の特定の時間における血液中の溶媒の実際の濃度に関するデータから評価することができる。 この測定値は、体内に吸収された溶媒の量を反映します。 吸収された量の一部は、溶媒の蒸気圧により吐き出されます。 血液中を循環している間、溶媒は体のさまざまな成分と相互作用し、最終的には酵素によって分解されるようになります. 代謝プロセスの結果は、グルタチオンとの抱合によって生成される特定のメルカプツール酸を測定することによって評価できます。 メルカプツール酸の累積排泄は、血中濃度よりも有効用量をよりよく反映している可能性があります.

生殖や老化などのライフイベントは、化学物質の分布に影響を与える可能性があります。 体内の化学物質の分布は妊娠によって大きく影響を受け、多くの化学物質が胎盤関門を通過して胎児が暴露される可能性があります。 授乳は脂溶性化学物質の排泄を引き起こす可能性があり、その結果、乳児による摂取の増加とともに母親の保持が減少します。 減量中または骨粗鬆症の発症中に、貯蔵された化学物質が放出される可能性があり、標的臓器の「内因性」暴露が新たに長期化する可能性があります。 他の要因が個々の化合物の吸収、代謝、保持、および分布に影響を与える可能性があり、感受性のバイオマーカーがいくつか利用可能です (以下を参照)。

効果のバイオマーカー

影響のマーカーは、内因性成分、機能的能力の尺度、または暴露によって影響を受ける身体または臓器系の状態またはバランスの他の指標である可能性があります。 このような効果マーカーは、一般に、異常の前臨床指標です。

これらのバイオマーカーは、特異的または非特異的である可能性があります。 特定のバイオマーカーは、特定の曝露の生物学的影響を示し、予防目的に使用できる可能性がある証拠を提供するため、有用です。 非特異的なバイオマーカーは、影響の個々の原因を示すものではありませんが、混合暴露による総合的な統合効果を反映している可能性があります。 したがって、両方のタイプのバイオマーカーは、労働衛生においてかなり役立つ可能性があります。

曝露バイオマーカーと効果バイオマーカーの間に明確な区別はありません。 たとえば、付加体の形成は、曝露ではなく影響を反映していると言えます。 しかし、効果バイオマーカーは通常、細胞、組織、または全身の機能の変化を示します。 一部の研究者は、暴露された実験動物の肝臓重量の増加や子供の成長低下などの全体的な変化を影響のバイオマーカーとして含めています。 労働衛生の目的で、効果バイオマーカーは、酵素の阻害など、無症状または可逆的な生化学的変化を示すものに制限する必要があります。 最も頻繁に使用される効果バイオマーカーは、おそらく特定の殺虫剤、つまり有機リン酸塩とカルバメートによって引き起こされるコリンエステラーゼの阻害です。 ほとんどの場合、この効果は完全に可逆的であり、酵素阻害は、この特定の殺虫剤グループへの総曝露を反映しています。

一部の曝露は、酵素阻害をもたらさず、むしろ酵素活性の増加をもたらします。 これは、P450 ファミリーに属するいくつかの酵素の場合です (「毒性反応の遺伝的決定因子」を参照)。 それらは、特定の溶剤や多環芳香族炭化水素 (PAH) への暴露によって誘発される可能性があります。 これらの酵素は、生検が困難な組織に主に発現しているため、その特定の酵素によって代謝される化合物を投与することにより、in vivo で間接的に酵素活性を測定し、尿または血漿中の分解産物を測定します。

他の暴露は、体内で保護タンパク質の合成を誘発する可能性があります。 最良の例は、おそらくカドミウムに結合し、この金属の排泄を促進するメタロチオネインです。 カドミウム曝露は、メタロチオネイン遺伝子の発現増加をもたらす要因の XNUMX つです。 同様の保護タンパク質が存在する可能性がありますが、バイオマーカーとして受け入れられるようになるにはまだ十分に調査されていません. バイオマーカーとして使用できる可能性のある候補の中には、もともと熱ショックタンパク質と呼ばれていた、いわゆるストレスタンパク質があります。 これらのタンパク質は、さまざまな有害な暴露に反応して、さまざまな生物によって生成されます。

酸化的損傷は、血清中のマロンジアルデヒドの濃度またはエタンの呼気を測定することによって評価できます。 同様に、アルブミンなどの分子量の小さいタンパク質の尿中排泄は、初期の腎障害のバイオマーカーとして使用される可能性があります。 臨床現場で日常的に使用されるいくつかのパラメーター (例えば、血清ホルモンまたは酵素レベル) も、バイオマーカーとして有用である可能性があります。 ただし、これらのパラメーターの多くは、障害を早期に検出するのに十分な感度を備えていない可能性があります。

効果パラメーターの別のグループは、遺伝毒性効果 (染色体構造の変化) に関連しています。 このような影響は、細胞分裂を行う白血球の顕微鏡検査によって検出される可能性があります。 染色体への重大な損傷 (染色体異常または小核の形成) は、顕微鏡で見ることができます。 損傷は、細胞分裂中に細胞に色素を加えることによっても明らかになることがあります。 遺伝毒性物質への暴露は、各染色体の XNUMX つの染色分体間の色素交換の増加 (姉妹染色分体交換) として視覚化できます。 染色体異常は、がん発症リスクの増加に関連していますが、姉妹染色分体交換率の増加の重要性はあまり明確ではありません。

遺伝毒性のより高度な評価は、体細胞、つまり口腔粘膜から得られた白血球または上皮細胞の特定の点変異に基づいています。 特定の遺伝子座での変異により、細胞は毒性のある化学物質 (6-チオグアニンなど) を含む培養で増殖できるようになる場合があります。 あるいは、特定の遺伝子産物を評価することができる(例えば、特定の癌遺伝子によってコードされる癌タンパク質の血清または組織濃度)。 明らかに、これらの変異は、被った遺伝毒性損傷の合計を反映しており、原因となる曝露について必ずしも何も示していません。 これらの方法はまだ労働衛生での実用化の準備ができていませんが、この一連の研究の急速な進歩は、そのような方法が数年以内に利用可能になることを示唆しています.

感受性のバイオマーカー

感受性のマーカーは、遺伝性であれ誘導性であれ、個体が生体異物の影響またはそのような化合物のグループの影響に対して特に敏感であることを示す指標です。 ほとんどの注意は遺伝的感受性に集中していますが、他の要因も少なくとも同じくらい重要かもしれません. 過感受性は、遺伝的形質、個人の体質、または環境要因による可能性があります。

特定の化学物質を代謝する能力は可変であり、遺伝的に決定されます (「毒性反応の遺伝的決定因子」を参照)。 いくつかの関連する酵素は、単一の遺伝子によって制御されているようです。 例えば外来化学物質の酸化は、主にP450ファミリーに属する酵素ファミリーによって行われます。 他の酵素は、抱合によって代謝産物をより水溶性にします(例:N-アセチルトランスフェラーゼおよびμ-グルタチオン-S-トランスフェラーゼ)。 これらの酵素の活性は遺伝的に制御されており、かなり異なります。 前述のように、活性は、少量の薬物を投与し、尿中の代謝産物の量を測定することによって測定できます。 遺伝子のいくつかは現在特徴付けられており、遺伝子型を決定するための技術が利用可能です。 重要な研究は、特定の癌の形態を発症するリスクが外来化合物を代謝する能力に関連していることを示唆しています。 多くの問題がまだ解決されていないため、現時点では、これらの潜在的な感受性バイオマーカーの労働衛生における使用が制限されています。

アルファなどの他の継承された形質1抗トリプシン欠乏症またはグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ欠乏症もまた、体内の防御機構の欠損を引き起こし、それによって特定の暴露に対する過敏症を引き起こします.

感受性に関するほとんどの研究は、遺伝的素因を扱ってきました。 他の要因も同様に役割を果たしており、部分的に無視されてきました. 例えば、慢性疾患を持つ個人は、職業上の曝露に対してより敏感である可能性があります。 また、病気の過程や有毒化学物質への以前の曝露が無症状の臓器損傷を引き起こした場合、新たな有毒物質への曝露に耐える能力が低下する可能性があります. この場合、臓器機能の生化学的指標が感受性バイオマーカーとして使用される場合があります。 おそらく過感受性に関する最も良い例は、アレルギー反応に関するものです。 個人が特定の曝露に対して感作された場合、血清中に特異的な抗体が検出されます。 個人が感作されていない場合でも、他の現在または過去の曝露が、職業曝露に関連する悪影響を引き起こすリスクを高める可能性があります。

主な問題は、職場での混合暴露の共同効果を決定することです。 さらに、個人的な習慣や薬物使用により、感受性が高まる可能性があります。 たとえば、たばこの煙には通常、かなりの量のカドミウムが含まれています。 したがって、カドミウムへの職業的暴露により、体内にこの金属を相当量蓄積しているヘビースモーカーは、カドミウム関連の腎疾患を発症するリスクが高くなります.

労働衛生への応用

バイオマーカーは毒物学研究に非常に有用であり、多くは生物学的モニタリングに適用できる可能性があります。 とはいえ、限界も認識しなければなりません。 多くのバイオマーカーは、これまで実験動物でのみ研究されてきました。 他の種のトキシコキネティックスのパターンは、必ずしも人間の状況を反映していない可能性があり、外挿には、人間のボランティアでの確認研究が必要な場合があります。 また、遺伝的要因または体質的要因による個人差も考慮する必要があります。

場合によっては、ばく露バイオマーカーがまったく実現できない場合があります (たとえば、in vivo で短寿命の化学物質の場合)。 他の化学物質は、神経系などの通常の手順ではアクセスできない臓器に保存されているか、影響を与える可能性があります. 曝露経路も分布パターンに影響を与える可能性があり、したがってバイオマーカーの測定とその解釈にも影響を与える可能性があります。 たとえば、嗅神経を介した脳への直接曝露は、曝露バイオマーカーの測定による検出を逃れる可能性があります。 バイオマーカーの影響に関しては、それらの多くはまったく特定されておらず、変化はライフスタイル要因を含むさまざまな原因による可能性があります. おそらく特に感受性バイオマーカーに関しては、個々の遺伝子型の全体的な健康上の重要性について多くの不確実性が残っているため、解釈は現時点では非常に慎重でなければなりません.

労働衛生において、理想的なバイオマーカーはいくつかの要件を満たす必要があります。 まず第一に、サンプルの収集と分析はシンプルで信頼できるものでなければなりません。 最適な分析品質を得るには標準化が必要ですが、特定の要件はかなり異なります。 主な関心領域には、個人の準備、サンプリング手順とサンプルの取り扱い、および測定手順が含まれます。 後者には、校正や品質保証手順などの技術的要因と、オペレーターの教育や訓練などの個人関連要因が含まれます。

分析の妥当性とトレーサビリティを文書化するために、参照物質は関連するマトリックスに基づいており、適切な濃度の毒性物質または関連する代謝物が適切なレベルで含まれている必要があります。 バイオマーカーを生物学的モニタリングまたは診断目的で使用するには、責任のある研究所が、定義された性能特性を備えた十分に文書化された分析手順と、結果の検証を可能にするアクセス可能な記録を持っている必要があります。 とはいえ、同時に、一般的な品質保証手順を補足するための標準物質の特徴付けと使用の経済性を考慮しなければなりません。 したがって、達成可能な結果の品質とその用途は、参照資料、人員、および機器を含む品質保証の追加コストとバランスを取る必要があります。

もうXNUMXつの要件は、バイオマーカーが、少なくとも研究の状況下では、特定のタイプの曝露に対して特異的であり、曝露の程度と明確な関係があることです. そうしないと、バイオマーカー測定の結果を解釈するのが難しすぎる可能性があります。 ばく露バイオマーカーの測定結果を適切に解釈するには、診断の有効性を知る必要があります (つまり、バイオマーカー値を健康リスクの可能性の大きさに変換すること)。 この分野では、金属はバイオマーカー研究のパラダイムとして機能します。 最近の研究は、用量反応関係の複雑さと微妙さを実証しており、無影響レベルを特定すること、したがって許容暴露を定義することもかなり困難です。 ただし、この種の研究は、関連する情報を明らかにするために必要な調査と改良の種類も示しています。 ほとんどの有機化合物について、曝露とそれに対応する健康への悪影響との間の定量的な関連性はまだ利用できません。 多くの場合、主要な標的臓器でさえ確実にわかっていません。 さらに、毒性データとバイオマーカー濃度の評価は、一度に単一の化合物にさらされるのではなく、物質の混合物にさらされることによって複雑になることがよくあります。

バイオマーカーを職業上の健康目的に適用する前に、いくつかの追加の考慮事項が必要です。 まず、バイオマーカーは無症状で可逆的な変化のみを反映する必要があります。 第二に、バイオマーカーの結果が健康リスクに関して解釈できることを考えると、予防努力が利用可能であり、バイオマーカーのデータが暴露を減らす必要性を示唆している場合に備えて現実的であると見なされるべきです. 第三に、バイオマーカーの実際の使用は、一般的に倫理的に許容できるものと見なされなければなりません。

産業衛生測定値は、適用される暴露限度と比較される場合があります。 同様に、曝露バイオマーカーまたは効果バイオマーカーの結果は、生物学的曝露指数と呼ばれることもある生物学的作用限界と比較することができます。 そのような制限は、適切な分野の臨床医と科学者の最善のアドバイスに基づいている必要があり、「リスク管理者」としての責任ある管理者は、関連する倫理的、社会的、文化的、経済的要因を考慮に入れる必要があります。 可能であれば、科学的根拠には、危険にさらされている集団内の感受性の変動に関する情報によって補足された用量反応関係を含める必要があります。 一部の国では、労働者や一般市民が基準設定プロセスに関与し、特に科学的な不確実性が大きい場合に重要な情報を提供しています。 主な不確実性の XNUMX つは、予防すべき健康への悪影響をどのように定義するかということです。たとえば、曝露バイオマーカーとしての付加体形成自体が、予防すべき悪影響 (すなわち、効果バイオマーカー) を表しているかどうかなどです。 同じ化合物について、一方で偶発的曝露と他方で職業的曝露に対して異なる制限を設けることが倫理的に正当化できるかどうかを決定する際に、難しい問題が生じる可能性があります。

バイオマーカーの使用によって生成された情報は、一般に、医師と患者の関係の中で検査を受ける個人に伝えられるべきです。 倫理的な懸念は、実際の健康リスクに関して現在詳細に解釈できない非常に実験的なバイオマーカー分析に関連して特に考慮する必要があります。 例えば、一般集団については、血中鉛濃度以外の曝露バイオマーカーの解釈に関して、現時点では限られたガイダンスが存在します。 また、生成されたデータの信頼性も重要です (つまり、適切なサンプリングが行われているかどうか、関連する実験室で健全な品質保証手順が使用されているかどうか)。 特別な懸念の追加領域は、個々の過感受性に関連しています。 研究からのフィードバックを提供する際には、これらの問題を考慮に入れる必要があります。

バイオマーカー研究の影響を受ける、またはバイオマーカー研究の実施に関係する社会のすべてのセクターは、研究によって生成された情報をどのように扱うかについての意思決定プロセスに関与する必要があります。 避けられない倫理的対立を防止または克服するための具体的な手順は、地域または国の法的および社会的枠組みの中で開発されるべきです。 しかし、それぞれの状況は異なる一連の疑問と落とし穴を表しており、暴露バイオマーカーのすべてのアプリケーションをカバーするために一般市民が関与するための単一の手順を開発することはできません。

 

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日曜日、1月16 2011 18:49

遺伝毒性評価

遺伝毒性評価は、遺伝子、染色体、ゲノムの XNUMX つの一般的な種類の変化 (突然変異) のいずれかを遺伝物質 (DNA) に誘発する薬剤の評価です。 人間などの生物では、遺伝子は DNA で構成されており、DNA はヌクレオチド塩基と呼ばれる個々の単位で構成されています。 遺伝子は、染色体と呼ばれる個別の物理的構造に配置されています。 遺伝毒性は、人の健康に重大かつ不可逆的な影響を与える可能性があります。 遺伝毒性損傷は、がんの誘発における重要なステップであり、先天異常や胎児死亡の誘発にも関与する可能性があります。 上記の XNUMX つのクラスの変異は、人間などの生物が持つ XNUMX 種類の組織、すなわち精子または卵子 (生殖細胞) と残りの組織 (体細胞) のいずれかで発生する可能性があります。

遺伝子変異を測定するアッセイは、遺伝子内のヌクレオチドの置換、付加、または欠失を検出するアッセイです。 染色体変異を測定するアッセイは、1927 つまたは複数の染色体が関与する切断または染色体再編成を検出するアッセイです。 ゲノム変異を測定するアッセイは、異数性と呼ばれる染色体数の変化を検出するアッセイです。 遺伝毒性評価は、200 年に Herman Muller が遺伝毒性 (変異原性) 因子を検出する最初のアッセイを開発して以来、大きく変化しました。 それ以来、DNA の変異を測定する XNUMX 以上のアッセイが開発されました。 しかし、現在、遺伝毒性評価に一般的に使用されているアッセイは XNUMX 未満です。 この記事では、これらのアッセイをレビューし、それらが何を測定するかを説明し、毒性評価におけるこれらのアッセイの役割を探ります。

開発前のがんハザードの特定 遺伝毒性学分野

遺伝毒物学は、全体的なリスク評価プロセスの不可欠な部分となり、発がん活性の信頼できる予測因子として近年注目を集めています。 しかし、遺伝毒性学が開発される前 (1970 年以前) には、ヒトに対する潜在的ながんの危険性を特定するために他の方法が使用されていました。 ヒトのがんリスクを特定するために現在使用されている方法には、次の XNUMX つの主要なカテゴリがあります。疫学研究、長期 in vivo バイオアッセイ、中期 in vivo バイオアッセイ、短期 in vivo および in vitro バイオアッセイ、人工知能およびメカニズムベースの推論。

表 1 に、これらの方法の長所と短所を示します。

表 1. ヒトのがんリスクを特定する現在の方法の長所と短所

  Advantages デメリット
疫学的研究 (1) 人間は病気の究極の指標です。
(2) 敏感な集団または影響を受けやすい集団を評価する。
(3) 職業被ばくコホート。 (4) 環境警戒警報
(1) 一般的に回顧的 (死亡診断書、リコール バイアスなど)。 (2)鈍感で、費用がかかり、時間がかかります。 (3) 信頼できる暴露データが入手できない、または入手が困難な場合がある。 (4) 組み合わされた、複数の、複雑なエクスポージャー。 適切な対照コホートの欠如; (5) 人間に対する実験は行われていない。 (6) 予防ではなく、がんの発見
長期 in vivo バイオアッセイ (1) 前向きおよび遡及的 (検証) 評価。 (2) 特定されたヒト発がん物質との優れた相関性。 (3) 既知の曝露レベルと条件。 (4) 化学毒性および発がん性の影響を特定する。 (5) 比較的迅速に結果が得られる。 (6) 化学クラス間の質的比較。 (7) 人間に密接に関連する統合的でインタラクティブな生物学的システム (1) めったに複製されず、リソースを大量に消費します。 (3) そのような実験に適した限られた施設。 (4) 種外挿の議論。 (5) 使用される曝露は、多くの場合、人間が経験するレベルをはるかに超えています。 (6) 単一の化学物質への暴露は、一般に複数の化学物質への同時暴露であるヒトへの暴露を模倣しない
中期および短期の in vivo および in vitro バイオアッセイ (1) 他のアッセイよりも迅速で安価です。 (2) 簡単に複製できる大規模なサンプル。
(3) 生物学的に意味のあるエンドポイントが測定されます (突然変異など)。 (4) 長期バイオアッセイ用の化学物質を選択するためのスクリーニングアッセイとして使用できます
(1) in vitro では in vivo を完全には予測できない。 (2) 通常、生物または臓器に特異的。 (3)動物や人間全体に匹敵しない効力
化学構造と生物活性の関連 (1) 比較的簡単、迅速、安価。 (2) 特定の化学クラス (例えば、ニトロソアミンおよびベンジジン染料) に対して信頼できる。 (3) 生物学的データから開発されたが、追加の生物学的実験に依存していない (1) 「生物学的」ではない。 (2) 定式化された規則に対する多くの例外。 (3) 遡及的でめったに (しかしなりつつある) 前向きである
メカニズムに基づく推論 (1) 特定のクラスの化学物質について合理的に正確である。 (2) 仮説の改良を可能にする。 (3) リスク評価を敏感な集団に向けることができる (1) 化学的発がんのメカニズムは未定義で、複数あり、化学的またはクラス特異的である可能性が高い。 (2) 一般的なメカニズムの例外を強調できない場合がある

 

遺伝毒性試験の理論的根拠と概念的根拠

遺伝毒性評価に使用されるアッセイの正確な種類と数は常に進化しており、国によって異なりますが、最も一般的なものには、(1) 細菌および/または培養哺乳類細胞における遺伝子変異、および (2) 細胞における染色体変異のアッセイが含まれます。培養された哺乳動物細胞および/または生きているマウス内の骨髄。 この XNUMX 番目のカテゴリ内のアッセイの一部は、異数性も検出できます。 これらのアッセイは生殖細胞の変異を検出しませんが、主に生殖細胞アッセイを実行するための余分なコストと複雑さのために使用されます。 それにもかかわらず、マウスの生殖細胞アッセイは、生殖細胞の影響に関する情報が必要な場合に使用されます。

25 年間 (1970 年から 1995 年) にわたる体系的な研究、特にノースカロライナ州の米国国家毒性プログラムでの体系的な研究により、病原体の変異原性を検出するための個別の数のアッセイが使用されるようになりました。 アッセイの有用性を評価する理論的根拠は、齧歯類でがんを引き起こし、ヒトでがんを引き起こすと疑われる物質 (すなわち、発がん物質) を検出する能力に基づいていました。 これは、過去数十年間の研究により、がん細胞には特定の遺伝子に変異が含まれており、多くの発がん物質が変異原でもあることが示されているためです。 したがって、がん細胞は体細胞変異を含むと見なされ、発がんは体細胞変異誘発の一種と見なされます。

今日最も一般的に使用されている遺伝毒性アッセイが選択されたのは、その大規模なデータベース、比較的低コスト、および実行の容易さだけでなく、多くのげっ歯類およびおそらくヒトの発がん物質を検出することが示されているためです。 その結果、遺伝毒性アッセイは、エージェントの潜在的な発がん性を予測するために使用されます。

遺伝毒性学の分野における重要な概念的および実際的な発展は、多くの発がん物質が体内の酵素によって修飾され、親化学物質の最終的な発がん性および変異原性の形態であることが多い変化した形態 (代謝物) を作成するという認識でした。 ペトリ皿でこの代謝を複製するために、ハインリッヒ・マリングは、げっ歯類の肝臓からの調製物を含めると、この代謝変換または活性化を行うのに必要な酵素の多くが含まれることを示しました. したがって、ディッシュまたはチューブ (in vitro) で実行される多くの遺伝毒性アッセイでは、同様の酵素製剤の添加が採用されています。 単純な製剤は S9 ミックスと呼ばれ、精製された製剤はミクロソームと呼ばれます。 一部の細菌細胞および哺乳類細胞は、これらの酵素を産生するげっ歯類またはヒト由来の遺伝子の一部を含むように遺伝子操作されており、S9 ミックスまたはミクロソームを追加する必要性が減少しています。

遺伝毒性アッセイおよび技術

遺伝毒性スクリーニングに使用される主な細菌系は、サルモネラ菌 (エイムズ) 変異原性アッセイであり、程度ははるかに低いものの WP2 株です。 大腸菌. 1980 年代半ばの研究では、サルモネラ システムの 98 つの菌株 (TA100 と TA90) のみを使用するだけで、既知のサルモネラ変異原の約 XNUMX% を検出できることが示されました。 したがって、これら XNUMX つの菌株は、ほとんどのスクリーニング目的に使用されます。 ただし、より広範なテストには、他のさまざまな菌株が利用可能です。

これらのアッセイはさまざまな方法で実行されますが、9 つの一般的な手順は、プレートの取り込みと液体懸濁液のアッセイです。 プレート組み込みアッセイでは、細胞、被験物質、および(必要に応じて)S9 を一緒に液化寒天に加え、ペトリ寒天プレートの表面に注ぎます。 トップアガーは数分以内に硬化し、プレートを9〜XNUMX日間インキュベートします。その後、変異細胞が増殖してコロニーと呼ばれる視覚的に検出可能な細胞のクラスターを形成し、カウントされます. 寒天培地には、選択剤が含まれているか、新しく変異した細胞のみが増殖するような成分で構成されています。 液体インキュベーションアッセイも同様ですが、細胞、試験薬剤、および SXNUMX を液化寒天を含まない液体で一緒にインキュベートし、次に細胞を洗浄して試験薬剤と SXNUMX を除去し、寒天に播種します。

哺乳動物培養細胞の変異は、主に次の XNUMX つの遺伝子のいずれかで検出されます。 hprt および tk. 細菌アッセイと同様に、哺乳動物細胞株 (げっ歯類またはヒト細胞から開発) をプラスチック製の培養皿またはチューブ内で試験剤に曝露し、変異細胞のみを増殖させる選択剤を含む培地を含む培養皿に播種します。 . この目的で使用されるアッセイには、CHO/HPRT、TK6、およびマウス リンパ腫 L5178Y/TK が含まれます。+ / - アッセイ。 代謝に関与するいくつかのヒト遺伝子を含むだけでなく、さまざまな DNA 修復変異を含む他の細胞株も使用されます。 これらのシステムは、遺伝子内の突然変異 (遺伝子突然変異) および遺伝子に隣接する染色体の領域を含む突然変異 (染色体突然変異) の回復を可能にします。 ただし、この後者のタイプの突然変異は、 tk よりも遺伝子システム hprt の位置による遺伝子システム tk 遺伝子。

細菌変異原性の液体培養試験と同様に、哺乳動物細胞変異原性試験では、一般に培養皿または試験管中の細胞を被験物質および S9 の存在下で数時間暴露します。 次に、細胞を洗浄し、さらに数日間培養して、正常な (野生型) 遺伝子産物を分解し、新たに変異した遺伝子産物を発現させて蓄積させます。変異細胞のみが増殖します。 細菌アッセイと同様に、変異細胞は視覚的に検出可能なコロニーに成長し、その後カウントされます。

染色体変異は、主に細胞遺伝学的アッセイによって特定されます。細胞遺伝学的アッセイでは、げっ歯類および/または培養皿内のげっ歯類またはヒトの細胞を被験化学物質に曝露し、XNUMX つまたは複数の細胞分裂を起こさせ、染色体を染色し、顕微鏡で染色体を視覚的に調べます。染色体の構造や数の変化を検出します。 さまざまなエンドポイントを調べることができますが、規制当局によって現在最も重要であると認められているのは、染色体異常と小核と呼ばれるサブカテゴリの XNUMX つです。

染色体異常の存在について細胞にスコアを付けるには、かなりのトレーニングと専門知識が必要であり、これは時間とお金の面で費用のかかる手順になります。 対照的に、小核はほとんどトレーニングを必要とせず、その検出は自動化できます。 小核は、染色体を含む核とは異なる、細胞内の小さな点として現れます。 小核は、染色体の切断または異数性のいずれかから生じます。 染色体異常に比べて小核の採点が容易であるため、また最近の研究では、生きているマウスの骨髄に染色体異常を誘発する薬剤は、一般にこの組織に小核を誘発することが示されているため、小核は現在、一般的に骨髄の能力の指標として測定されています。染色体突然変異誘発剤。

生殖細胞アッセイは、上記の他のアッセイよりもはるかに少ない頻度で使用されますが、エージェントが生殖細胞にリスクをもたらすかどうかを判断するために不可欠です。変異は、次世代の健康への影響につながる可能性があります. 最も一般的に使用される生殖細胞アッセイはマウスで行われ、(1) 染色体間の遺伝性転座 (交換) (遺伝性転座アッセイ)、(2) 特定の遺伝子が関与する遺伝子または染色体変異 (目に見えるまたは生化学的な特異的遺伝子座) を検出するシステムを含みます。アッセイ)、および(3)生存率に影響を与える変異(優性致死アッセイ)。 体細胞アッセイと同様に、生殖細胞アッセイでの作業仮定は、これらのアッセイで陽性の薬剤は潜在的なヒト生殖細胞変異原であると推定されるということです。

現状と今後の展望

最近の研究では、げっ歯類の 90 種類の発がん性物質 (推定ヒト発がん性物質および体細胞変異原物質) の約 41% を検出するために必要な情報は 1 つだけであることが示されています。 これらには、(2) 試薬の化学構造に関する知識、特に求電子部分が含まれている場合 (構造活性相関に関するセクションを参照)。 (3) サルモネラ変異原性データ。 (90) げっ歯類 (マウスおよびラット) における XNUMX 日間の慢性毒性試験からのデータ。 実際、IARC が宣言したヒト発がん物質の本質的にすべてが、サルモネラ菌アッセイとマウス骨髄小核アッセイだけを使用して変異原として検出可能です。 潜在的なヒト発がん物質を検出するためのこれらの変異原性アッセイの使用は、ほとんどのヒト発がん物質がラットとマウスの両方で発がん性があり(トランス種発がん物質)、ほとんどのトランス種発がん物質がサルモネラ菌で変異原性であり、および/または小核を誘発するという発見によってさらに支持されています。マウスの骨髄で。

DNA技術の進歩、ヒトゲノムプロジェクト、およびがんにおける突然変異の役割に関する理解の向上により、標準的なスクリーニング手順に組み込まれる可能性が高い新しい遺伝毒性アッセイが開発されています. これらの中には、トランスジェニック細胞とげっ歯類の使用があります。 トランスジェニックシステムは、別の種の遺伝子が細胞または生物に導入されたシステムです。 例えば、マウスへの細菌遺伝子の導入に基づいて、動物の任意の臓器または組織における突然変異の検出を可能にするトランスジェニックマウスが現在実験的に使用されている. サルモネラなどの細菌細胞、および P450 遺伝子などの発がん性/変異原性物質の代謝に関与する遺伝子を含む哺乳動物細胞 (ヒト細胞株を含む) が利用可能になりました。 トランスジェニックげっ歯類内のトランスジーン、または hprt、またはサルモネラ内の標的遺伝子を実行できるようになったため、化学物質によって誘発された突然変異の正確な性質を決定でき、化学物質の作用機序への洞察を提供し、病原体に推定的に曝露されたヒトの突然変異との比較を可能にします.

細胞遺伝学における分子の進歩により、染色体変異のより詳細な評価が可能になりました。 これらには、特定の遺伝子に結合する (ハイブリダイズする) プローブ (DNA の小さな断片) の使用が含まれます。 染色体上の遺伝子の再編成は、プローブの位置の変化によって明らかになります。プローブは蛍光性で、染色体上の色付きのセクターとして簡単に視覚化できます。 DNA切断のための単一細胞ゲル電気泳動アッセイ(一般に「コメット」アッセイと呼ばれる)は、単一細胞内のDNA切断の検出を可能にし、染色体損傷を検出するための細胞遺伝学的技術と組み合わせて非常に有用なツールになる可能性があります.

長年の使用と大規模で体系的に開発されたデータベースの生成の後、遺伝毒性評価は、短期間 (数週間) で比較的低コストでわずか数回のアッセイで実行できるようになりました。 得られたデータを使用して、薬剤がげっ歯類になる能力、およびおそらくヒトの発がん物質/体細胞変異原になる能力を予測することができます。 このような能力により、環境への変異原性物質および発がん性物質の導入を制限し、代替の非変異原性物質を開発することが可能になります。 将来の研究は、現在のアッセイよりも優れた予測性を備えたさらに優れた方法につながるはずです.

 

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日曜日、1月16 2011 18:53

In Vitro 毒性試験

分子および細胞生物学における洗練された技術の出現は、毒物学を含む生命科学の比較的急速な進化に拍車をかけました。 実際、毒物学の焦点は、動物全体や動物全体の集団から、個々の動物や人間の細胞や分子に移っています。 1980 年代半ば以降、毒物学者は生物系に対する化学物質の影響を評価するために、これらの新しい方法論を採用し始めました。 論理的な進歩として、そのような方法は毒性試験の目的に適合されています。 これらの科学的進歩は、社会的および経済的要因と連携して、製品の安全性と潜在的なリスクの評価に変化をもたらしました。

経済的要因は、テストする必要がある材料の量に特に関連しています。 毎年、数多くの新しい化粧品、医薬品、殺虫剤、化学製品、家庭用品が市場に投入されています。 これらの製品はすべて、潜在的な毒性について評価する必要があります。 さらに、十分にテストされていない、すでに使用されている化学物質のバックログがあります。 従来の全動物試験法を使用してこれらすべての化学物質に関する詳細な安全性情報を取得するという膨大な作業は、たとえ達成できたとしても、お金と時間の両方の面で費用がかかります。

公衆衛生と安全に関連する社会問題もあり、製品の安全性試験に動物を使用することに対する公衆の関心も高まっています。 人間の安全に関して、公益および環境擁護団体は、政府機関に対し、化学物質に対してより厳しい規制を適用するように大きな圧力をかけてきました。 最近の例としては、一部の環境保護団体が米国で塩素および塩素含有化合物を禁止する運動を行っています。 このような極端な行動の動機の XNUMX つは、これらの化合物のほとんどが十分にテストされていないという事実にあります。 毒物学の観点からすると、塩素の存在だけに基づいてさまざまな化学物質のクラス全体を禁止するという概念は、科学的に不健全であり、無責任です. しかし、公衆の観点からは、環境に放出された化学物質が重大な健康リスクを引き起こさないという保証が必要であることは理解できます。 このような状況は、毒性を評価するためのより効率的で迅速な方法の必要性を強調しています。

毒性試験の分野に影響を与えたもう 76 つの社会的関心事は、動物福祉です。 世界中でますます多くの動物保護団体が、製品の安全性試験に全動物を使用することに反対の声を上げています。 動物実験をやめさせようとして、化粧品、家庭用およびパーソナルケア製品、医薬品のメーカーに対して積極的なキャンペーンが行われています。 ヨーロッパでのこのような努力の結果、指令 768/1/EEC (化粧品指令) の修正第 1998 条が可決されました。 この指令の結果、XNUMX 年 XNUMX 月 XNUMX 日以降に動物実験を行った化粧品または化粧品成分は、代替方法の検証が不十分でない限り、欧州連合では販売できません。 この指令は、米国またはその他の国でのそのような製品の販売を管轄していませんが、ヨーロッパを含む国際市場を持つ企業に大きな影響を与えます。

動物全体を対象とした試験以外の試験を開発するための基礎を形成する代替法の概念は、XNUMX つの Rs: 削減 使用される動物の数。 洗練 動物のストレスや不快感を軽減するためのプロトコル。 と 置換 in vitro 試験(すなわち、生きている動物の体外で行われる試験)、コンピュータ モデル、または下等脊椎動物または無脊椎動物種での試験による現在の動物試験の評価。 三人 Rは、1959 年に XNUMX 人の英国の科学者、WMS ラッセルとレックス バーチによって出版された本で紹介されました。 人道的な実験技術の原則. ラッセルとバーチは、有効な科学的結果が得られる唯一の方法は動物の人道的な扱いであると主張し、動物の使用を減らし、最終的には動物に取って代わる方法を開発する必要があると信じていました。 興味深いことに、ラッセルとバーチが概説した原則は、1970 年代半ばに動物福祉運動が復活するまでほとんど注目されませんでした。 今日のXNUMXつのコンセプト Rs は、研究、テスト、および教育に関して最前線に立っています。

要約すると、in vitro 試験方法論の開発は、過去 20 年から XNUMX 年の間に収束したさまざまな要因の影響を受けてきました。 これらの要因のいずれかが単独で毒性試験戦略に大きな影響を与えたかどうかを確認することは困難です.

In Vitro 毒性試験の考え方

このセクションでは、全動物試験の代替手段の XNUMX つとして、毒性を評価するための in vitro 法のみに焦点を当てます。 コンピューター モデリングや定量的な構造活性相関などの追加の非動物代替法については、この章の他の記事で説明します。

インビトロ研究は、一般に、動物またはヒトの細胞または体外の組織で行われます。 In vitro は文字通り「ガラス内」を意味し、定義された条件下でペトリ皿または試験管で培養された生体材料または生体材料の成分に対して実行される手順を指します。 これらは、in vivo 研究、または「生きている動物で」実施されたものとは対照的である可能性があります。 観察が皿の中の単一タイプの細胞に限定されている場合、複雑な生物に対する化学物質の影響を予測することは、不可能ではないにしても困難ですが、インビトロ研究は、固有の毒性についてもかなりの量の情報を提供します毒性の細胞および分子メカニズムとして。 さらに、それらは一般に安価であり、より制御された条件下で実施できるという点で、in vivo 研究よりも多くの利点を提供します。 さらに、in vitro 培養用の細胞を得るには少数の動物が必要であるという事実にもかかわらず、これらの方法は削減の代替手段 (in vivo 研究に比べて使用する動物がはるかに少ないため) および改良の代替手段 (必要性を排除するため) と見なすことができます。 in vivo 実験によって課せられる有害な毒性結果に動物をさらすこと)。

in vitro 毒性試験の結果を解釈し、毒性を評価する上での潜在的な有用性を判断し、それらを in vivo の全体的な毒性学的プロセスに関連付けるためには、毒性学的プロセスのどの部分が調査されているかを理解する必要があります。 毒物学的プロセス全体は、生物が物理的または化学的物質にさらされることから始まり、細胞および分子の相互作用を経て進行し、最終的に生物全体の反応として現れる事象で構成されています。 In vitro 試験は、一般に、細胞および分子レベルで行われる毒物学的プロセスの一部に限定されます。 in vitro 研究から得られる可能性のある情報の種類には、代謝経路、活性代謝物と細胞および分子標的との相互作用、および暴露の分子バイオマーカーとして機能する潜在的に測定可能な毒性エンドポイントが含まれます。 理想的な状況では、in vitro 試験から得られた情報を完全に解釈し、生物全体の反応に関連付けることができるように、生物への暴露による各化学物質の毒性のメカニズムを知ることができます。 しかし、完全な毒物学的メカニズムはほとんど解明されていないため、これは事実上不可能です。 したがって、毒物学者は、メカニズムが不明なため、in vitro 試験の結果を in vivo 毒性の完全に正確な予測として使用できないという状況に直面しています。 しかし、in vitro 試験を開発する過程で、毒性の細胞および分子メカニズムの構成要素が解明されることがよくあります。

in vitro 試験の開発と実施を取り巻く重要な未解決の問題の XNUMX つは、次の考慮事項に関連しています。 科学的観点からは、in vivo 試験の代替として機械論に基づいた試験のみを利用する方が間違いなく優れています。 しかし、完全なメカニズムの知識がなければ、近い将来に全動物試験を完全に置き換える in vitro 試験が開発される見込みはほとんどありません。 しかし、これは現在のケースである早期スクリーニングツールとして、より記述的なタイプのアッセイの使用を排除するものではありません. これらのスクリーニングにより、動物の使用が大幅に削減されました。 したがって、より多くのメカニズムに関する情報が得られるまでは、結果が in vivo で得られた結果と単純によく相関する試験を、より限定的に採用する必要があるかもしれません。

細胞毒性のインビトロ試験

このセクションでは、化学物質の細胞毒性の可能性を評価するために開発されたいくつかの in vitro 試験について説明します。 ほとんどの場合、これらのテストは簡単に実行でき、分析は自動化できます。 細胞毒性の一般的に使用される in vitro 試験の 96 つは、ニュートラル レッド アッセイです。 このアッセイは培養細胞に対して行われ、ほとんどのアプリケーションでは、直径 6.4 mm の 0.01 個の小さなウェルを含む培養皿で細胞を維持できます。 各ウェルは 1 回の測定に使用できるため、この配置では、複数の濃度の被験化学物質や、それぞれに十分な数の複製を持つ陽性および陰性コントロールに対応できます。 少なくとも 96 桁(例えば、XNUMXmM から XNUMXmM)にわたるさまざまな濃度の被験化学物質、ならびに陽性対照および陰性対照化学物質で細胞を処理した後、細胞をすすぎ、ニュートラルレッドで処理します。生きた細胞だけが取り込んで保持できる染料。 色素は、被験物質の除去時に添加して即時効果を測定するか、または被験物質を除去した後、蓄積効果または遅発性効果を測定するために添加することができます。 各ウェルの色の濃さは、そのウェル内の生細胞の数に対応しています。 色強度は、プレートリーダーを装備することができる分光光度計によって測定される。 プレート リーダーは、培養皿の XNUMX の各ウェルの個別の測定値を提供するようにプログラムされています。 この自動化された方法論により、研究者は濃度反応実験を迅速に実行し、統計的に有用なデータを取得できます。

細胞毒性のもう 3 つの比較的単純なアッセイは、MTT テストです。 MTT (4,5[2-ジメチルチアゾール-2,5-イル]-XNUMX-ジフェニルテトラゾリウム ブロマイド) は、ミトコンドリア酵素によって青色に還元されるテトラゾリウム色素です。 生存可能なミトコンドリアを持つ細胞のみが、この反応を実行する能力を保持します。 したがって、色の濃さはミトコンドリアの完全性の程度に直接関係しています。 これは、一般的な細胞毒性化合物だけでなく、ミトコンドリアを特異的に標的とする薬剤を検出するのに役立つテストです。

乳酸脱水素酵素 (LDH) 活性の測定は、細胞毒性の広範なアッセイとしても使用されます。 この酵素は通常、生細胞の細胞質に存在し、毒物によって悪影響を受けた死んだ細胞や死にかけている細胞の漏れやすい細胞膜を通して細胞培養培地に放出されます。 細胞の化学処理後、放出されたLDHの量を測定し、毒性の経時変化を決定するために、少量の培養培地を様々な時点で除去することができる。 LDH 放出アッセイは細胞毒性の非常に一般的な評価ですが、実行が簡単で、リアルタイムで実行できるため有用です。

細胞損傷を検出するために開発されている多くの新しい方法があります。 より洗練された方法では、蛍光プローブを使用して、カルシウム放出や pH および膜電位の変化など、さまざまな細胞内パラメーターを測定します。 一般に、これらのプローブは非常に感度が高く、より微妙な細胞の変化を検出する可能性があるため、エンドポイントとして細胞死を使用する必要性が減少します。 さらに、これらの蛍光アッセイの多くは、96 ウェル プレートと蛍光プレート リーダーを使用して自動化できます。

これらの試験のいずれかを使用して一連の化学物質に関するデータが収集されると、相対的な毒性が決定される可能性があります。 in vitro 試験で決定される化学物質の相対毒性は、未処理細胞のエンドポイント応答に 50% の影響を与える濃度として表すことができます。 この決定は EC と呼ばれます。50 (E効果的な Cの集中 50% の細胞) で、さまざまな化学物質の毒性を in vitro で比較するために使用できます。 (相対毒性の評価に使用される同様の用語は IC50これは、細胞プロセス、例えば、ニュートラルレッドを吸収する能力を 50% 阻害する化学物質の濃度を示しています。) 化学物質の相対的な in vitro 毒性が、相対的な in vitro 毒性に匹敵するかどうかを評価することは容易ではありません。 in vivo 系にはトキシコキネティクス、代謝、修復および防御メカニズムなど、非常に多くの交絡因子があるためです。 さらに、これらのアッセイのほとんどは一般的な細胞毒性のエンドポイントを測定するため、機械論に基づいていません。 したがって、in vitro と in vivo の相対毒性の間の一致は、単純に相関関係にあります。 インビトロからインビボへの外挿には多くの複雑さと困難があるにもかかわらず、これらのインビトロ試験は非常に価値があることが証明されています。なぜなら、これらの試験管内試験は、実行が簡単で安価であり、毒性の高い薬物または化学物質を初期段階でフラグ付けするためのスクリーニングとして使用できるからです。発達。

標的臓器毒性

In vitro 試験は、特定の標的臓器毒性を評価するためにも使用できます。 そのような試験の設計には多くの困難が伴いますが、最も顕著なのは、in vitro システムが in vivo で臓器の多くの機能を維持できないことです。 多くの場合、細胞を動物から採取して培養すると、細胞は急速に変性および/または脱分化する傾向があります。つまり、器官のような機能を失い、より一般的なものになります。 これは、短期間、通常は数日以内に、培養物が毒素の器官特異的効果を評価するのにもはや役に立たないという問題を提示します。

これらの問題の多くは、分子生物学および細胞生物学の最近の進歩により克服されつつあります。 インビボでの細胞環境について得られる情報は、インビトロでの培養条件の調節に利用することができる。 1980 年代半ば以降、新しい成長因子やサイトカインが発見され、現在ではその多くが市販されています。 培養中の細胞にこれらの因子を添加すると、細胞の完全性が維持され、より分化した機能を長期間保持するのにも役立ちます。 他の基礎研究により、培養中の細胞の栄養およびホルモン要件に関する知識が増し、新しい培地が処方される可能性があります。 最近の進歩は、細胞を培養できる天然および人工の細胞外マトリックスの両方を特定することにおいてもなされました。 これらの異なるマトリックスでの細胞の培養は、構造と機能の両方に大きな影響を与える可能性があります。 この知識から得られる主な利点は、培養中の細胞の環境を複雑に制御し、基本的な細胞プロセスおよびさまざまな化学物質への応答に対するこれらの要因の影響を個別に調べる能力です。 要するに、これらのシステムは、臓器固有の毒性メカニズムに関する優れた洞察を提供できます。

多くの標的臓器毒性研究は、初代細胞で実施されます。初代細胞は、定義上、臓器から新たに分離され、通常、培養中に有限の寿命を示します。 毒性評価のために器官から単一細胞タイプの初代培養を行うことには多くの利点があります。 機構的な観点から、このような培養は、化学物質の特定の細胞標的を研究するのに役立ちます。 場合によっては、器官からの XNUMX つ以上の細胞型を一緒に培養することができ、これにより、毒素に応答した細胞間相互作用を観察できるという追加の利点が得られます。 皮膚の共培養システムの中には、生体内の皮膚に似た三次元構造を形成するように設計されたものがあります。 肝臓や腎臓など、異なる臓器の細胞を共培養することも可能です。 このタイプの培養は、肝臓で生物活性化されなければならない化学物質の腎臓細胞に特異的な影響を評価するのに役立ちます。

分子生物学的ツールは、標的臓器毒性試験に役立つ連続細胞株の開発にも重要な役割を果たしてきました。 これらの細胞株は、初代細胞に DNA をトランスフェクトすることによって生成されます。 トランスフェクション手順において、細胞およびDNAは、DNAが細胞によって取り込まれることができるように処理される。 通常、DNA はウイルス由来であり、発現すると細胞が不死化する (つまり、培養中で長期間生きて増殖できる) 遺伝子を含んでいます。 不死化遺伝子が誘導性プロモーターによって制御されるように、DNAを操作することもできる。 このタイプの構築物の利点は、不死化遺伝子の発現を可能にする適切な化学的刺激を受けた場合にのみ、細胞が分裂することです。 このような構築物の例は、シミアンウイルス 40 (SV40) 由来のラージ T 抗原遺伝子 (不死化遺伝子) であり、その前にメタロチオネイン遺伝子のプロモーター領域があり、培地中の金属の存在によって誘導されます。 したがって、遺伝子が細胞にトランスフェクトされた後、細胞を低濃度の亜鉛で処理して、MT プロモーターを刺激し、T 抗原遺伝子の発現をオンにすることができます。 これらの条件下で、細胞は増殖します。 培地から亜鉛が除去されると、細胞は分裂を停止し、理想的な条件下では、組織固有の機能を発現する状態に戻ります。

細胞培養技術の進歩と組み合わせた不死化細胞を生成する能力は、脳、腎臓、肝臓など、さまざまな臓器からの細胞株の作成に大きく貢献しています。 ただし、これらの細胞株を真正な細胞タイプの代理として使用する前に、それらが実際にどの程度「正常」であるかを判断するために慎重に特徴付けする必要があります。

標的臓器毒性を研究するための他の in vitro システムでは、複雑さが増しています。 in vitro システムは、単一細胞から全臓器培養へと複雑さが増すにつれて、in vivo 環境に匹敵するようになりますが、同時に、変数の数が増えると、制御がはるかに難しくなります。 したがって、より高いレベルの組織に移行することで得られるものは、研究者が実験環境を制御できないために失われる可能性があります。 表 1 は、肝毒性の研究に使用されてきたさまざまな in vitro システムの特性の一部を比較しています。

表 1. 肝毒性試験用の in vitro システムの比較

エントルピー 複雑
(相互作用のレベル)
肝臓特有の機能を保持する能力 潜在的な培養期間 環境をコントロールする能力
不死化細胞株 一部の細胞間 (細胞株によって異なります) 不良から良好 (細胞株によって異なります) 不定 優れた
初代肝細胞培養 セル間 可~優(培養条件により異なる) 数日から数週間 優れた
肝細胞共培養 cell to cell (同じ細胞型と異なる細胞型の間) 最良です 週間 優れた
レバースライス 細胞から細胞へ(すべての細胞タイプの中で) 最良です 数時間から数日 良い
分離、灌流肝臓 細胞間 (すべての細胞型の中で)、および臓器内 優れた フェア

 

精密に切断された組織切片は、毒物学的研究により広く使用されています。 研究者が無菌環境で均一な組織切片を切断できるようにする新しい器具が利用可能になりました。 組織切片は、臓器のすべての種類の細胞が存在し、生体内の構造と細胞間コミュニケーションを維持するという点で、細胞培養システムよりも優れた利点を提供します。 したがって、特定の標的器官毒性を調査するだけでなく、器官内の標的細胞タイプを決定するために、インビトロ研究を実施することができる。 スライスの欠点は、主にスライスの内部の細胞への酸素の拡散が不十分なために、最初の 24 時間の培養後に急速に変性することです。 しかし、最近の研究では、穏やかな回転によってより効率的な通気が達成される可能性があることが示されています。 これは、より複雑な培地の使用とともに、スライスが最大 96 時間生き残ることを可能にします。

組織外植片は、組織切片と概念が似ており、特定の標的臓器における化学物質の毒性を判断するためにも使用できます。 組織外植片は、組織の小片 (催奇形性の研究では、無傷の胚) を除去し、さらなる研究のために培養に入れることによって確立されます。 外植片培養は、皮膚の刺激性や腐食性、気管のアスベスト研究、脳組織の神経毒性研究など、短期間の毒性研究に有用です。

分離された灌流臓器は、標的臓器の毒性を評価するために使用することもできます。 これらのシステムは、すべての細胞タイプが存在するという点で、組織切片および外植片と同様の利点を提供しますが、切片の準備に伴う操作によって導入される組織へのストレスはありません。 さらに、それらは臓器内相互作用の維持を可能にします。 主な欠点は、短期間の生存率であり、in vitro 毒性試験での使用が制限されます。 代替として機能するという点では、これらの培養は、動物が毒物による in vivo 治療の悪影響を経験しないため、洗練されたものと見なすことができます。 ただし、それらを使用しても、必要な動物の数が大幅に減少するわけではありません。

要約すると、標的臓器毒性の評価に利用できる in vitro システムにはいくつかの種類があります。 これらの技術の XNUMX つまたは複数を使用して、毒性のメカニズムに関する多くの情報を取得することが可能です。 毒性学的プロセスの比較的小さな部分を表す in vitro システムから、in vivo で発生するプロセス全体を推定する方法を知ることには、依然として困難が残っています。

眼刺激性のインビトロ試験

動物福祉の観点からおそらく最も論争の的となっている全動物毒性試験は、ウサギで実施される眼刺激性に関するドレイズ試験です。 このテストでは、化学物質の一定量をウサギの片方の目に入れ、もう片方の目をコントロールとして使用します。 刺激および炎症の程度は、曝露後のさまざまな時点で記録されます。 人道的な理由だけでなく、観察の主観性と結果の変動性のためにも批判されてきたこのテストに代わる方法論を開発するために大きな努力が払われています. ドレイズ テストが受けた厳しい批判にもかかわらず、他の方法では識別が困難な、特に軽度から中程度の刺激性物質を予測することに、ドレイズ テストが非常に成功していることが証明されていることに注目することは興味深いことです。 したがって、インビトロの代替手段に対する需要は非常に大きいです。

ドレイズ テストに代わるものを探すのは複雑ですが、成功すると予測されています。 多数の in vitro およびその他の代替法が開発されており、場合によってはそれらが実装されています。 定義上、動物にとって痛みや苦痛が少ないドレイズ試験の改良版には、人道的な理由だけでなく、ウサギの目に少量の試験材料を入れるロー ボリューム アイ テストが含まれます。人々が実際に偶発的に暴露される可能性のある量をより厳密に模倣します。 別の改良点として、pH が 2 未満または 11.5 を超える物質は、眼に重度の刺激性があることが知られているため、動物実験は行われなくなりました。

1980 年から 1989 年の間に、化粧品の眼刺激性試験に使用されるウサギの数は推定 87% 減少しました。 in vitro 試験は、全動物試験の大幅な削減を実現するための階層試験アプローチの一部として組み込まれています。 このアプローチは、過去の眼刺激性データの徹底的な調査と、評価対象の化学物質の物理的および化学的分析から始まる多段階プロセスです。 これら XNUMX つのプロセスで十分な情報が得られない場合は、一連の in vitro 試験が行われます。 in vitro 試験から得られた追加データは、その物質の安全性を評価するのに十分かもしれません。 そうでない場合、最後のステップは限定的な in vivo 試験を実施することです。 このアプローチが、被験物質の安全性を予測するために必要な動物の数をどのように排除するか、少なくとも劇的に減らすことができるかは容易に理解できます。

この階層テスト戦略の一部として使用される一連の in vitro テストは、特定の業界のニーズによって異なります。 眼刺激性試験は、化粧品から医薬品、工業用化学物質まで、さまざまな業界で行われています。 業界ごとに必要な情報の種類は異なるため、一連の in vitro 試験を XNUMX つ定義することはできません。 テスト バッテリーは、通常、細胞毒性、組織の生理学と生化学の変化、定量的な構造活性相関、炎症メディエーター、回復と修復の XNUMX つのパラメーターを評価するように設計されています。 刺激の原因の XNUMX つである細胞毒性のテストの例として、培養細胞を使用したニュートラルレッドアッセイがあります (上記参照)。 化学物質への暴露に起因する細胞生理学および生化学の変化は、ヒト角膜上皮細胞の培養でアッセイすることができます。 あるいは、研究者は、食肉処理場から入手した無傷または解剖したウシまたはニワトリの眼球も使用しています。 これらの全臓器培養で測定されたエンドポイントの多くは、角膜混濁や角膜腫脹など、in vivo で測定されたものと同じです。

炎症は化学物質による眼の損傷の構成要素であることが多く、このパラメータを調べるために利用できるアッセイが多数あります。 アラキドン酸やサイトカインなどの炎症プロセス中に放出されるメディエーターの存在を、さまざまな生化学的アッセイで検出します。 鶏卵の絨毛尿膜 (CAM) も、炎症の指標として使用できます。 CAM アッセイでは、14 ~ XNUMX 日齢のニワトリ胚の殻の小片を取り除き、CAM を露出させます。 その後、化学物質が CAM に適用され、血管出血などの炎症の徴候がその後さまざまな時点で記録されます。

in vitro で評価するのが最も困難な in vivo プロセスの XNUMX つは、眼の損傷の回復と修復です。 新しく開発された装置であるシリコン マイクロフィジオメーターは、細胞外 pH の小さな変化を測定し、培養細胞をリアルタイムで監視するために使用できます。 この分析は、in vivo 回復とかなりよく相関することが示されており、このプロセスの in vitro テストとして使用されています。 これは、眼刺激性に対するドレイズ試験の代替として採用されている試験の種類の概要です。 今後数年以内に、完全な一連の in vitro テスト バッテリーが定義され、それぞれが特定の目的のために検証される可能性があります。

検証

in vitro 試験方法論が規制当局に受け入れられ、実施されるための鍵は検証です。これは、特定の目的のために候補試験の信頼性を確立するプロセスです。 検証プロセスを定義し、調整する努力は、米国とヨーロッパの両方で行われてきました。 欧州連合は、そこでの取り組みを調整し、米国の学術センターであるジョンズ・ホプキンス動物実験代替法センター (CAAT) などのアメリカの組織と交流するために、1993 年に欧州代替法検証センター (ECVAM) を設立しました。 、および国立衛生研究所、米国環境保護庁、米国食品医薬品局、および消費者製品安全委員会の代表者で構成される、代替法の検証のための機関間調整委員会 (ICCVAM)。

in vitro 試験の検証には、実質的な組織と計画が必要です。 政府の規制当局と産業界および学術界の科学者の間で、受け入れ可能な手順についてコンセンサスが必要であり、プロトコルが設定された基準を満たしていることを保証するために、科学諮問委員会による十分な監督が必要です。 検証研究は、化学物質バンクからの較正された一連の化学物質と、単一のソースからの細胞または組織を使用して、一連の参照実験室で実施する必要があります。 候補試験の試験所内再現性と試験所間再現性の両方を実証し、結果を適切な統計分析にかけなければなりません。 検証研究のさまざまな構成要素からの結果がまとめられると、科学諮問委員会は、特定の目的に対する候補試験の有効性について勧告を行うことができます。 さらに、研究の結果は、査読のあるジャーナルに掲載され、データベースに配置されるべきです。

検証プロセスの定義は現在進行中です。 新しい検証研究はそれぞれ、次の研究の設計に役立つ情報を提供します。 国際的なコミュニケーションと協力は、特に EC 化粧品指令の可決によって課された緊急性の高まりを考えると、広く受け入れられる一連のプロトコルの迅速な開発に不可欠です。 この法律は、本格的な検証作業を実施するために必要な推進力を実際に提供する可能性があります。 このプロセスが完了して初めて、さまざまな規制当局による in vitro 法が受け入れられるようになります。

まとめ

この記事では、in vitro 毒性試験の現状を幅広く概観しました。 in vitro 毒性学の科学は比較的歴史が浅いですが、指数関数的に成長しています。 今後数年間の課題は、細胞および分子研究によって生成されたメカニズムの知識を in vivo データの膨大なインベントリに組み込み、毒性学的メカニズムのより完全な説明を提供し、in vitro データを使用できるパラダイムを確立することです。 in vivo での毒性を予測します。 これらの in vitro 法の固有の価値を実現できるのは、毒物学者と政府代表者の協調した努力のみです。

 

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日曜日、1月16 2011 18:56

構造活性関係

構造活性相関 (SAR) 分析は、化学物質の分子構造に関する情報を利用して、持続性、分布、取り込みと吸収、および毒性に関連する重要な特性を予測することです。 SAR は、潜在的な有害化学物質を特定する代替方法であり、産業界や政府がさらなる評価や新しい化学物質の初期段階の意思決定のために物質に優先順位を付けるのを支援する可能性があります。 毒物学は、ますます費用がかかり、リソースを大量に消費する事業になっています。 化学物質が暴露されたヒト集団に悪影響を与える可能性に対する懸念の高まりにより、規制機関および保健機関は、毒物学的危険を検出するためのテストの範囲と感度を拡大するようになりました。 同時に、業界に対する規制の実際の負担と認識されている負担により、毒性試験方法とデータ分析の実用性に対する懸念が生じています。 現在、化学的発がん性の決定は、複数の臓器の慎重な組織病理学的分析、および細胞と標的臓器の前腫瘍性変化の検出を伴う、数回の用量での少なくとも 3 つの雌雄の種の生涯試験に依存しています。 米国では、がんバイオアッセイの費用は 1995 万ドル (XNUMX ドル) を超えると推定されています。

無限の財源があっても、今日世界で生産されている約 70,000 の既存の化学物質をテストする負担は、訓練を受けた毒物学者の利用可能なリソースを超えます。 これらの化学物質の第 1984 段階の評価を完了するには何世紀もかかるだろう (NRC 1993)。 多くの国で、毒性試験における動物の使用に関する倫理的懸念が高まっており、毒性試験の標準的な方法の使用にさらなる圧力がかかっています。 SAR は製薬業界で広く使用されており、治療に有益に使用できる可能性のある分子を特定しています (Hansch and Zhang 1979)。 環境および労働衛生政策において、SAR は、物理化学的環境における化合物の分散を予測し、潜在的な毒性をさらに評価するために新しい化学物質をスクリーニングするために使用されます。 米国有害物質規制法 (TSCA) に基づき、EPA は 5 年以来、製造前通知 (PMN) プロセスにおける新しい化学物質の「最初のスクリーニング」として SAR アプローチを使用してきました。 オーストラリアは、新しい化学物質通知 (NICNAS) 手順の一部として、同様のアプローチを使用しています。 US SAR 分析では、セクションで要求されているように、物質の製造、処理、流通、使用、または廃棄が人間の健康または環境に不当な損害のリスクをもたらすと結論付ける合理的な根拠があると判断するための重要な根拠です。 TSCA の 6(f)。 この発見に基づいて、EPA は TSCA のセクション XNUMX に基づいて物質の実際のテストを要求することができます。

SAR の根拠

SAR の科学的根拠は、化学物質の分子構造が物理化学系および生物学的システムにおけるその挙動の重要な側面を予測するという仮定に基づいています (Hansch and Leo 1979)。

SARプロセス

SAR レビュー プロセスには、純粋な化合物だけでなく実験的な製剤を含む化学構造の同定が含まれます。 構造的に類似した物質の同定; 構造類似体に関する情報をデータベースや文献で検索する。 構造類似体に関する毒性およびその他のデータの分析。 いくつかのまれなケースでは、十分に理解されている毒性メカニズムに基づいて、化合物の構造に関する情報だけで SAR 分析をサポートするのに十分な場合があります。 SAR に関するいくつかのデータベースと、分子構造予測のためのコンピューターベースの方法がコンパイルされています。

この情報を使用して、次のエンドポイントを SAR で推定できます。

  • 物理化学パラメータ: 沸点、蒸気圧、水溶性、オクタノール/水分配係数
  • 生物学的/環境的運命パラメータ: 生分解、土壌収着、光分解、薬物動態
  • 毒性パラメータ: 水生生物毒性、吸収、急性哺乳類毒性 (限界試験または LD)50)、皮膚、肺および眼への刺激、感作、亜慢性毒性、変異原性。

 

発がん性、発生毒性、生殖毒性、神経毒性、免疫毒性、またはその他の標的臓器への影響などの重要な健康エンドポイントに対する SAR 手法は存在しないことに注意する必要があります。 これは次の 1988 つの要因によるものです。SA​​R 仮説を​​検証するための大規模なデータベースの欠如、毒性作用の構造的決定要因に関する知識の欠如、標的細胞とこれらのエンドポイントに関与するメカニズムの多様性 (「米国生殖毒性物質および神経毒性物質のリスク評価へのアプローチ」)。 分配係数と溶解度に関する情報を使用して薬物動態を予測するために SAR を利用するいくつかの限定的な試みがあります (Johanson and Naslund 450)。 一連の化合物の P1993 依存性代謝と、サイトゾルの「ダイオキシン」受容体へのダイオキシンおよび PCB 様分子の結合を予測するために、より広範な定量的 SAR が行われました (Hansch and Zhang XNUMX)。

表 1 に示すように、SAR は、上記のエンドポイントのいくつかについて予測可能性が異なることが示されています。 米国 EPA の専門家によって実施された SAR は、生分解を含む生物活性の予測よりも、物理化学的特性の予測のほうがうまくいきませんでした。 毒性エンドポイントについては、SAR が変異原性の予測に最適でした。 Ashby と Tennant (1991) は、より広範な研究で、NTP 化学物質の分析において、短期遺伝毒性の良好な予測可能性も見出しました。 遺伝毒性の分子メカニズム(「遺伝毒性学」を参照)および DNA 結合における求電子性の役割に関する現在の理解を考えると、これらの発見は驚くべきことではありません。 対照的に、SAR は哺乳類の全身性および亜慢性毒性を過小予測し、水生生物に対する急性毒性を過大予測する傾向がありました。

表 1. SAR とテスト データの比較: OECD/NTP 分析

エンドポイント 合意 (%) 不一致 (%)
沸点 50 50 30
蒸気圧 63 37 113
水溶性 68 32 133
分配係数 61 39 82
生分解 93 7 107
魚毒性 77 22 130
ミジンコ中毒 67 33 127
哺乳類急性毒性(LD50 ) 80 201 142
皮膚刺激 82 18 144
目の炎症 78 22 144
皮膚感作 84 16 144
亜慢性毒性 57 32 143
変異原性2 88 12 139
変異原性3 82-944 1-10 301
発がん性3 : XNUMX年間のバイオアッセイ 72-954 - 301

出典: OECD からのデータ、私信 C. Auer、US EPA。 この分析では、比較可能な SAR 予測と実際のテスト データが利用可能なエンドポイントのみが使用されました。 NTP データは、Ashby と Tennant 1991 からのものです。

1 懸念されるのは、SAR が試験した化学物質の 12% で急性毒性を予測できなかったことです。

2 Ames 試験と SAR の一致に基づく OECD データ

3 いくつかのクラスの「構造的に警告する化学物質」の SAR 予測と比較したジェネトックス アッセイに基づく NTP データ。

4 一致率はクラスによって異なります。 最高の一致は、芳香族アミノ/ニトロ化合物でした。 「その他」の構造で最も低い。

上記のように、その他の有毒エンドポイントについては、SAR の有用性はあまり実証されていません。 哺乳動物の毒性予測は、複雑な分子のトキシコキネティクスに関する SAR が欠如しているため複雑です。 それにもかかわらず、哺乳類の複雑な毒性エンドポイントに対する SAR の原則を提案するいくつかの試みがなされてきた (例えば、潜在的な雄の生殖毒性物質の SAR 分析については Bernstein (1984) を参照)。 ほとんどの場合、データベースは小さすぎて、構造ベースの予測を厳密にテストすることはできません。

この時点で、SAR は主に毒性試験リソースへの投資を優先するため、または潜在的な危険性について早期に懸念を提起するために役立つ可能性があると結論付けることができます。 変異原性の場合にのみ、SAR 分析自体を信頼性をもって利用して、他の決定を通知できる可能性があります。 この章の他の箇所で説明されているように、SAR がリスク評価の目的に必要な種類の定量的情報を提供できる可能性は低いため、エンドポイントはありません。 百科事典.

 

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