遺伝毒性評価は、遺伝子、染色体、ゲノムの XNUMX つの一般的な種類の変化 (突然変異) のいずれかを遺伝物質 (DNA) に誘発する薬剤の評価です。 人間などの生物では、遺伝子は DNA で構成されており、DNA はヌクレオチド塩基と呼ばれる個々の単位で構成されています。 遺伝子は、染色体と呼ばれる個別の物理的構造に配置されています。 遺伝毒性は、人の健康に重大かつ不可逆的な影響を与える可能性があります。 遺伝毒性損傷は、がんの誘発における重要なステップであり、先天異常や胎児死亡の誘発にも関与する可能性があります。 上記の XNUMX つのクラスの変異は、人間などの生物が持つ XNUMX 種類の組織、すなわち精子または卵子 (生殖細胞) と残りの組織 (体細胞) のいずれかで発生する可能性があります。
遺伝子変異を測定するアッセイは、遺伝子内のヌクレオチドの置換、付加、または欠失を検出するアッセイです。 染色体変異を測定するアッセイは、1927 つまたは複数の染色体が関与する切断または染色体再編成を検出するアッセイです。 ゲノム変異を測定するアッセイは、異数性と呼ばれる染色体数の変化を検出するアッセイです。 遺伝毒性評価は、200 年に Herman Muller が遺伝毒性 (変異原性) 因子を検出する最初のアッセイを開発して以来、大きく変化しました。 それ以来、DNA の変異を測定する XNUMX 以上のアッセイが開発されました。 しかし、現在、遺伝毒性評価に一般的に使用されているアッセイは XNUMX 未満です。 この記事では、これらのアッセイをレビューし、それらが何を測定するかを説明し、毒性評価におけるこれらのアッセイの役割を探ります。
開発前のがんハザードの特定 遺伝毒性学分野
遺伝毒物学は、全体的なリスク評価プロセスの不可欠な部分となり、発がん活性の信頼できる予測因子として近年注目を集めています。 しかし、遺伝毒性学が開発される前 (1970 年以前) には、ヒトに対する潜在的ながんの危険性を特定するために他の方法が使用されていました。 ヒトのがんリスクを特定するために現在使用されている方法には、次の XNUMX つの主要なカテゴリがあります。疫学研究、長期 in vivo バイオアッセイ、中期 in vivo バイオアッセイ、短期 in vivo および in vitro バイオアッセイ、人工知能およびメカニズムベースの推論。
表 1. ヒトのがんリスクを特定する現在の方法の長所と短所
| Advantages | デメリット | |
| 疫学的研究 | (1) 人間は病気の究極の指標です。 (2) 敏感な集団または影響を受けやすい集団を評価する。 (3) 職業被ばくコホート。 (4) 環境警戒警報 |
(1) 一般的に回顧的 (死亡診断書、リコール バイアスなど)。 （2）鈍感で、費用がかかり、時間がかかります。 (3) 信頼できる暴露データが入手できない、または入手が困難な場合がある。 (4) 組み合わされた、複数の、複雑なエクスポージャー。 適切な対照コホートの欠如; (5) 人間に対する実験は行われていない。 (6) 予防ではなく、がんの発見 |
| 長期 in vivo バイオアッセイ | (1) 前向きおよび遡及的 (検証) 評価。 (2) 特定されたヒト発がん物質との優れた相関性。 (3) 既知の曝露レベルと条件。 (4) 化学毒性および発がん性の影響を特定する。 (5) 比較的迅速に結果が得られる。 (6) 化学クラス間の質的比較。 (7) 人間に密接に関連する統合的でインタラクティブな生物学的システム | (1) めったに複製されず、リソースを大量に消費します。 (3) そのような実験に適した限られた施設。 (4) 種外挿の議論。 (5) 使用される曝露は、多くの場合、人間が経験するレベルをはるかに超えています。 (6) 単一の化学物質への暴露は、一般に複数の化学物質への同時暴露であるヒトへの暴露を模倣しない |
| 中期および短期の in vivo および in vitro バイオアッセイ | (1) 他のアッセイよりも迅速で安価です。 (2) 簡単に複製できる大規模なサンプル。 (3) 生物学的に意味のあるエンドポイントが測定されます (突然変異など)。 (4) 長期バイオアッセイ用の化学物質を選択するためのスクリーニングアッセイとして使用できます |
(1) in vitro では in vivo を完全には予測できない。 (2) 通常、生物または臓器に特異的。 (3)動物や人間全体に匹敵しない効力 |
| 化学構造と生物活性の関連 | (1) 比較的簡単、迅速、安価。 (2) 特定の化学クラス (例えば、ニトロソアミンおよびベンジジン染料) に対して信頼できる。 (3) 生物学的データから開発されたが、追加の生物学的実験に依存していない | (1) 「生物学的」ではない。 (2) 定式化された規則に対する多くの例外。 (3) 遡及的でめったに (しかしなりつつある) 前向きである |
| メカニズムに基づく推論 | (1) 特定のクラスの化学物質について合理的に正確である。 (2) 仮説の改良を可能にする。 (3) リスク評価を敏感な集団に向けることができる | (1) 化学的発がんのメカニズムは未定義で、複数あり、化学的またはクラス特異的である可能性が高い。 (2) 一般的なメカニズムの例外を強調できない場合がある |
遺伝毒性試験の理論的根拠と概念的根拠
遺伝毒性評価に使用されるアッセイの正確な種類と数は常に進化しており、国によって異なりますが、最も一般的なものには、(1) 細菌および/または培養哺乳類細胞における遺伝子変異、および (2) 細胞における染色体変異のアッセイが含まれます。培養された哺乳動物細胞および/または生きているマウス内の骨髄。 この XNUMX 番目のカテゴリ内のアッセイの一部は、異数性も検出できます。 これらのアッセイは生殖細胞の変異を検出しませんが、主に生殖細胞アッセイを実行するための余分なコストと複雑さのために使用されます。 それにもかかわらず、マウスの生殖細胞アッセイは、生殖細胞の影響に関する情報が必要な場合に使用されます。
25 年間 (1970 年から 1995 年) にわたる体系的な研究、特にノースカロライナ州の米国国家毒性プログラムでの体系的な研究により、病原体の変異原性を検出するための個別の数のアッセイが使用されるようになりました。 アッセイの有用性を評価する理論的根拠は、齧歯類でがんを引き起こし、ヒトでがんを引き起こすと疑われる物質 (すなわち、発がん物質) を検出する能力に基づいていました。 これは、過去数十年間の研究により、がん細胞には特定の遺伝子に変異が含まれており、多くの発がん物質が変異原でもあることが示されているためです。 したがって、がん細胞は体細胞変異を含むと見なされ、発がんは体細胞変異誘発の一種と見なされます。
今日最も一般的に使用されている遺伝毒性アッセイが選択されたのは、その大規模なデータベース、比較的低コスト、および実行の容易さだけでなく、多くのげっ歯類およびおそらくヒトの発がん物質を検出することが示されているためです。 その結果、遺伝毒性アッセイは、エージェントの潜在的な発がん性を予測するために使用されます。
遺伝毒性学の分野における重要な概念的および実際的な発展は、多くの発がん物質が体内の酵素によって修飾され、親化学物質の最終的な発がん性および変異原性の形態であることが多い変化した形態 (代謝物) を作成するという認識でした。 ペトリ皿でこの代謝を複製するために、ハインリッヒ・マリングは、げっ歯類の肝臓からの調製物を含めると、この代謝変換または活性化を行うのに必要な酵素の多くが含まれることを示しました. したがって、ディッシュまたはチューブ (in vitro) で実行される多くの遺伝毒性アッセイでは、同様の酵素製剤の添加が採用されています。 単純な製剤は S9 ミックスと呼ばれ、精製された製剤はミクロソームと呼ばれます。 一部の細菌細胞および哺乳類細胞は、これらの酵素を産生するげっ歯類またはヒト由来の遺伝子の一部を含むように遺伝子操作されており、S9 ミックスまたはミクロソームを追加する必要性が減少しています。
遺伝毒性アッセイおよび技術
遺伝毒性スクリーニングに使用される主な細菌系は、サルモネラ菌 (エイムズ) 変異原性アッセイであり、程度ははるかに低いものの WP2 株です。 大腸菌. 1980 年代半ばの研究では、サルモネラ システムの 98 つの菌株 (TA100 と TA90) のみを使用するだけで、既知のサルモネラ変異原の約 XNUMX% を検出できることが示されました。 したがって、これら XNUMX つの菌株は、ほとんどのスクリーニング目的に使用されます。 ただし、より広範なテストには、他のさまざまな菌株が利用可能です。
これらのアッセイはさまざまな方法で実行されますが、9 つの一般的な手順は、プレートの取り込みと液体懸濁液のアッセイです。 プレート組み込みアッセイでは、細胞、被験物質、および（必要に応じて）S9 を一緒に液化寒天に加え、ペトリ寒天プレートの表面に注ぎます。 トップアガーは数分以内に硬化し、プレートを9〜XNUMX日間インキュベートします。その後、変異細胞が増殖してコロニーと呼ばれる視覚的に検出可能な細胞のクラスターを形成し、カウントされます. 寒天培地には、選択剤が含まれているか、新しく変異した細胞のみが増殖するような成分で構成されています。 液体インキュベーションアッセイも同様ですが、細胞、試験薬剤、および SXNUMX を液化寒天を含まない液体で一緒にインキュベートし、次に細胞を洗浄して試験薬剤と SXNUMX を除去し、寒天に播種します。
哺乳動物培養細胞の変異は、主に次の XNUMX つの遺伝子のいずれかで検出されます。 hprt & tk. 細菌アッセイと同様に、哺乳動物細胞株 (げっ歯類またはヒト細胞から開発) をプラスチック製の培養皿またはチューブ内で試験剤に曝露し、変異細胞のみを増殖させる選択剤を含む培地を含む培養皿に播種します。 . この目的で使用されるアッセイには、CHO/HPRT、TK6、およびマウス リンパ腫 L5178Y/TK が含まれます。+ / - アッセイ。 代謝に関与するいくつかのヒト遺伝子を含むだけでなく、さまざまな DNA 修復変異を含む他の細胞株も使用されます。 これらのシステムは、遺伝子内の突然変異 (遺伝子突然変異) および遺伝子に隣接する染色体の領域を含む突然変異 (染色体突然変異) の回復を可能にします。 ただし、この後者のタイプの突然変異は、 tk よりも遺伝子システム hprt の位置による遺伝子システム tk 遺伝子。
細菌変異原性の液体培養試験と同様に、哺乳動物細胞変異原性試験では、一般に培養皿または試験管中の細胞を被験物質および S9 の存在下で数時間暴露します。 次に、細胞を洗浄し、さらに数日間培養して、正常な (野生型) 遺伝子産物を分解し、新たに変異した遺伝子産物を発現させて蓄積させます。変異細胞のみが増殖します。 細菌アッセイと同様に、変異細胞は視覚的に検出可能なコロニーに成長し、その後カウントされます。
染色体変異は、主に細胞遺伝学的アッセイによって特定されます。細胞遺伝学的アッセイでは、げっ歯類および/または培養皿内のげっ歯類またはヒトの細胞を被験化学物質に曝露し、XNUMX つまたは複数の細胞分裂を起こさせ、染色体を染色し、顕微鏡で染色体を視覚的に調べます。染色体の構造や数の変化を検出します。 さまざまなエンドポイントを調べることができますが、規制当局によって現在最も重要であると認められているのは、染色体異常と小核と呼ばれるサブカテゴリの XNUMX つです。
染色体異常の存在について細胞にスコアを付けるには、かなりのトレーニングと専門知識が必要であり、これは時間とお金の面で費用のかかる手順になります。 対照的に、小核はほとんどトレーニングを必要とせず、その検出は自動化できます。 小核は、染色体を含む核とは異なる、細胞内の小さな点として現れます。 小核は、染色体の切断または異数性のいずれかから生じます。 染色体異常に比べて小核の採点が容易であるため、また最近の研究では、生きているマウスの骨髄に染色体異常を誘発する薬剤は、一般にこの組織に小核を誘発することが示されているため、小核は現在、一般的に骨髄の能力の指標として測定されています。染色体突然変異誘発剤。
生殖細胞アッセイは、上記の他のアッセイよりもはるかに少ない頻度で使用されますが、エージェントが生殖細胞にリスクをもたらすかどうかを判断するために不可欠です。変異は、次世代の健康への影響につながる可能性があります. 最も一般的に使用される生殖細胞アッセイはマウスで行われ、(1) 染色体間の遺伝性転座 (交換) (遺伝性転座アッセイ)、(2) 特定の遺伝子が関与する遺伝子または染色体変異 (目に見えるまたは生化学的な特異的遺伝子座) を検出するシステムを含みます。アッセイ）、および（3）生存率に影響を与える変異（優性致死アッセイ）。 体細胞アッセイと同様に、生殖細胞アッセイでの作業仮定は、これらのアッセイで陽性の薬剤は潜在的なヒト生殖細胞変異原であると推定されるということです。
現状と今後の展望
最近の研究では、げっ歯類の 90 種類の発がん性物質 (推定ヒト発がん性物質および体細胞変異原物質) の約 41% を検出するために必要な情報は 1 つだけであることが示されています。 これらには、(2) 試薬の化学構造に関する知識、特に求電子部分が含まれている場合 (構造活性相関に関するセクションを参照)。 (3) サルモネラ変異原性データ。 (90) げっ歯類 (マウスおよびラット) における XNUMX 日間の慢性毒性試験からのデータ。 実際、IARC が宣言したヒト発がん物質の本質的にすべてが、サルモネラ菌アッセイとマウス骨髄小核アッセイだけを使用して変異原として検出可能です。 潜在的なヒト発がん物質を検出するためのこれらの変異原性アッセイの使用は、ほとんどのヒト発がん物質がラットとマウスの両方で発がん性があり（トランス種発がん物質）、ほとんどのトランス種発がん物質がサルモネラ菌で変異原性であり、および/または小核を誘発するという発見によってさらに支持されています。マウスの骨髄で。
DNA技術の進歩、ヒトゲノムプロジェクト、およびがんにおける突然変異の役割に関する理解の向上により、標準的なスクリーニング手順に組み込まれる可能性が高い新しい遺伝毒性アッセイが開発されています. これらの中には、トランスジェニック細胞とげっ歯類の使用があります。 トランスジェニックシステムは、別の種の遺伝子が細胞または生物に導入されたシステムです。 例えば、マウスへの細菌遺伝子の導入に基づいて、動物の任意の臓器または組織における突然変異の検出を可能にするトランスジェニックマウスが現在実験的に使用されている. サルモネラなどの細菌細胞、および P450 遺伝子などの発がん性/変異原性物質の代謝に関与する遺伝子を含む哺乳動物細胞 (ヒト細胞株を含む) が利用可能になりました。 トランスジェニックげっ歯類内のトランスジーン、または hprt、またはサルモネラ内の標的遺伝子を実行できるようになったため、化学物質によって誘発された突然変異の正確な性質を決定でき、化学物質の作用機序への洞察を提供し、病原体に推定的に曝露されたヒトの突然変異との比較を可能にします.
細胞遺伝学における分子の進歩により、染色体変異のより詳細な評価が可能になりました。 これらには、特定の遺伝子に結合する (ハイブリダイズする) プローブ (DNA の小さな断片) の使用が含まれます。 染色体上の遺伝子の再編成は、プローブの位置の変化によって明らかになります。プローブは蛍光性で、染色体上の色付きのセクターとして簡単に視覚化できます。 DNA切断のための単一細胞ゲル電気泳動アッセイ（一般に「コメット」アッセイと呼ばれる）は、単一細胞内のDNA切断の検出を可能にし、染色体損傷を検出するための細胞遺伝学的技術と組み合わせて非常に有用なツールになる可能性があります.
長年の使用と大規模で体系的に開発されたデータベースの生成の後、遺伝毒性評価は、短期間 (数週間) で比較的低コストでわずか数回のアッセイで実行できるようになりました。 得られたデータを使用して、薬剤がげっ歯類になる能力、およびおそらくヒトの発がん物質/体細胞変異原になる能力を予測することができます。 このような能力により、環境への変異原性物質および発がん性物質の導入を制限し、代替の非変異原性物質を開発することが可能になります。 将来の研究は、現在のアッセイよりも優れた予測性を備えたさらに優れた方法につながるはずです.