分子および細胞生物学における洗練された技術の出現は、毒物学を含む生命科学の比較的急速な進化に拍車をかけました。 実際、毒物学の焦点は、動物全体や動物全体の集団から、個々の動物や人間の細胞や分子に移っています。 1980 年代半ば以降、毒物学者は生物系に対する化学物質の影響を評価するために、これらの新しい方法論を採用し始めました。 論理的な進歩として、そのような方法は毒性試験の目的に適合されています。 これらの科学的進歩は、社会的および経済的要因と連携して、製品の安全性と潜在的なリスクの評価に変化をもたらしました。
経済的要因は、テストする必要がある材料の量に特に関連しています。 毎年、数多くの新しい化粧品、医薬品、殺虫剤、化学製品、家庭用品が市場に投入されています。 これらの製品はすべて、潜在的な毒性について評価する必要があります。 さらに、十分にテストされていない、すでに使用されている化学物質のバックログがあります。 従来の全動物試験法を使用してこれらすべての化学物質に関する詳細な安全性情報を取得するという膨大な作業は、たとえ達成できたとしても、お金と時間の両方の面で費用がかかります。
公衆衛生と安全に関連する社会問題もあり、製品の安全性試験に動物を使用することに対する公衆の関心も高まっています。 人間の安全に関して、公益および環境擁護団体は、政府機関に対し、化学物質に対してより厳しい規制を適用するように大きな圧力をかけてきました。 最近の例としては、一部の環境保護団体が米国で塩素および塩素含有化合物を禁止する運動を行っています。 このような極端な行動の動機の XNUMX つは、これらの化合物のほとんどが十分にテストされていないという事実にあります。 毒物学の観点からすると、塩素の存在だけに基づいてさまざまな化学物質のクラス全体を禁止するという概念は、科学的に不健全であり、無責任です. しかし、公衆の観点からは、環境に放出された化学物質が重大な健康リスクを引き起こさないという保証が必要であることは理解できます。 このような状況は、毒性を評価するためのより効率的で迅速な方法の必要性を強調しています。
毒性試験の分野に影響を与えたもう 76 つの社会的関心事は、動物福祉です。 世界中でますます多くの動物保護団体が、製品の安全性試験に全動物を使用することに反対の声を上げています。 動物実験をやめさせようとして、化粧品、家庭用およびパーソナルケア製品、医薬品のメーカーに対して積極的なキャンペーンが行われています。 ヨーロッパでのこのような努力の結果、指令 768/1/EEC (化粧品指令) の修正第 1998 条が可決されました。 この指令の結果、XNUMX 年 XNUMX 月 XNUMX 日以降に動物実験を行った化粧品または化粧品成分は、代替方法の検証が不十分でない限り、欧州連合では販売できません。 この指令は、米国またはその他の国でのそのような製品の販売を管轄していませんが、ヨーロッパを含む国際市場を持つ企業に大きな影響を与えます。
動物全体を対象とした試験以外の試験を開発するための基礎を形成する代替法の概念は、XNUMX つの Rs: 削減 使用される動物の数。 洗練 動物のストレスや不快感を軽減するためのプロトコル。 と 置換 in vitro 試験（すなわち、生きている動物の体外で行われる試験）、コンピュータ モデル、または下等脊椎動物または無脊椎動物種での試験による現在の動物試験の評価。 三人 Rは、1959 年に XNUMX 人の英国の科学者、WMS ラッセルとレックス バーチによって出版された本で紹介されました。 人道的な実験技術の原則. ラッセルとバーチは、有効な科学的結果が得られる唯一の方法は動物の人道的な扱いであると主張し、動物の使用を減らし、最終的には動物に取って代わる方法を開発する必要があると信じていました。 興味深いことに、ラッセルとバーチが概説した原則は、1970 年代半ばに動物福祉運動が復活するまでほとんど注目されませんでした。 今日のXNUMXつのコンセプト Rs は、研究、テスト、および教育に関して最前線に立っています。
要約すると、in vitro 試験方法論の開発は、過去 20 年から XNUMX 年の間に収束したさまざまな要因の影響を受けてきました。 これらの要因のいずれかが単独で毒性試験戦略に大きな影響を与えたかどうかを確認することは困難です.
In Vitro 毒性試験の考え方
このセクションでは、全動物試験の代替手段の XNUMX つとして、毒性を評価するための in vitro 法のみに焦点を当てます。 コンピューター モデリングや定量的な構造活性相関などの追加の非動物代替法については、この章の他の記事で説明します。
インビトロ研究は、一般に、動物またはヒトの細胞または体外の組織で行われます。 In vitro は文字通り「ガラス内」を意味し、定義された条件下でペトリ皿または試験管で培養された生体材料または生体材料の成分に対して実行される手順を指します。 これらは、in vivo 研究、または「生きている動物で」実施されたものとは対照的である可能性があります。 観察が皿の中の単一タイプの細胞に限定されている場合、複雑な生物に対する化学物質の影響を予測することは、不可能ではないにしても困難ですが、インビトロ研究は、固有の毒性についてもかなりの量の情報を提供します毒性の細胞および分子メカニズムとして。 さらに、それらは一般に安価であり、より制御された条件下で実施できるという点で、in vivo 研究よりも多くの利点を提供します。 さらに、in vitro 培養用の細胞を得るには少数の動物が必要であるという事実にもかかわらず、これらの方法は削減の代替手段 (in vivo 研究に比べて使用する動物がはるかに少ないため) および改良の代替手段 (必要性を排除するため) と見なすことができます。 in vivo 実験によって課せられる有害な毒性結果に動物をさらすこと）。
in vitro 毒性試験の結果を解釈し、毒性を評価する上での潜在的な有用性を判断し、それらを in vivo の全体的な毒性学的プロセスに関連付けるためには、毒性学的プロセスのどの部分が調査されているかを理解する必要があります。 毒物学的プロセス全体は、生物が物理的または化学的物質にさらされることから始まり、細胞および分子の相互作用を経て進行し、最終的に生物全体の反応として現れる事象で構成されています。 In vitro 試験は、一般に、細胞および分子レベルで行われる毒物学的プロセスの一部に限定されます。 in vitro 研究から得られる可能性のある情報の種類には、代謝経路、活性代謝物と細胞および分子標的との相互作用、および暴露の分子バイオマーカーとして機能する潜在的に測定可能な毒性エンドポイントが含まれます。 理想的な状況では、in vitro 試験から得られた情報を完全に解釈し、生物全体の反応に関連付けることができるように、生物への暴露による各化学物質の毒性のメカニズムを知ることができます。 しかし、完全な毒物学的メカニズムはほとんど解明されていないため、これは事実上不可能です。 したがって、毒物学者は、メカニズムが不明なため、in vitro 試験の結果を in vivo 毒性の完全に正確な予測として使用できないという状況に直面しています。 しかし、in vitro 試験を開発する過程で、毒性の細胞および分子メカニズムの構成要素が解明されることがよくあります。
in vitro 試験の開発と実施を取り巻く重要な未解決の問題の XNUMX つは、次の考慮事項に関連しています。 科学的観点からは、in vivo 試験の代替として機械論に基づいた試験のみを利用する方が間違いなく優れています。 しかし、完全なメカニズムの知識がなければ、近い将来に全動物試験を完全に置き換える in vitro 試験が開発される見込みはほとんどありません。 しかし、これは現在のケースである早期スクリーニングツールとして、より記述的なタイプのアッセイの使用を排除するものではありません. これらのスクリーニングにより、動物の使用が大幅に削減されました。 したがって、より多くのメカニズムに関する情報が得られるまでは、結果が in vivo で得られた結果と単純によく相関する試験を、より限定的に採用する必要があるかもしれません。
細胞毒性のインビトロ試験
このセクションでは、化学物質の細胞毒性の可能性を評価するために開発されたいくつかの in vitro 試験について説明します。 ほとんどの場合、これらのテストは簡単に実行でき、分析は自動化できます。 細胞毒性の一般的に使用される in vitro 試験の 96 つは、ニュートラル レッド アッセイです。 このアッセイは培養細胞に対して行われ、ほとんどのアプリケーションでは、直径 6.4 mm の 0.01 個の小さなウェルを含む培養皿で細胞を維持できます。 各ウェルは 1 回の測定に使用できるため、この配置では、複数の濃度の被験化学物質や、それぞれに十分な数の複製を持つ陽性および陰性コントロールに対応できます。 少なくとも 96 桁（例えば、XNUMXmM から XNUMXmM）にわたるさまざまな濃度の被験化学物質、ならびに陽性対照および陰性対照化学物質で細胞を処理した後、細胞をすすぎ、ニュートラルレッドで処理します。生きた細胞だけが取り込んで保持できる染料。 色素は、被験物質の除去時に添加して即時効果を測定するか、または被験物質を除去した後、蓄積効果または遅発性効果を測定するために添加することができます。 各ウェルの色の濃さは、そのウェル内の生細胞の数に対応しています。 色強度は、プレートリーダーを装備することができる分光光度計によって測定される。 プレート リーダーは、培養皿の XNUMX の各ウェルの個別の測定値を提供するようにプログラムされています。 この自動化された方法論により、研究者は濃度反応実験を迅速に実行し、統計的に有用なデータを取得できます。
細胞毒性のもう 3 つの比較的単純なアッセイは、MTT テストです。 MTT (4,5[2-ジメチルチアゾール-2,5-イル]-XNUMX-ジフェニルテトラゾリウム ブロマイド) は、ミトコンドリア酵素によって青色に還元されるテトラゾリウム色素です。 生存可能なミトコンドリアを持つ細胞のみが、この反応を実行する能力を保持します。 したがって、色の濃さはミトコンドリアの完全性の程度に直接関係しています。 これは、一般的な細胞毒性化合物だけでなく、ミトコンドリアを特異的に標的とする薬剤を検出するのに役立つテストです。
乳酸脱水素酵素 (LDH) 活性の測定は、細胞毒性の広範なアッセイとしても使用されます。 この酵素は通常、生細胞の細胞質に存在し、毒物によって悪影響を受けた死んだ細胞や死にかけている細胞の漏れやすい細胞膜を通して細胞培養培地に放出されます。 細胞の化学処理後、放出されたＬＤＨの量を測定し、毒性の経時変化を決定するために、少量の培養培地を様々な時点で除去することができる。 LDH 放出アッセイは細胞毒性の非常に一般的な評価ですが、実行が簡単で、リアルタイムで実行できるため有用です。
細胞損傷を検出するために開発されている多くの新しい方法があります。 より洗練された方法では、蛍光プローブを使用して、カルシウム放出や pH および膜電位の変化など、さまざまな細胞内パラメーターを測定します。 一般に、これらのプローブは非常に感度が高く、より微妙な細胞の変化を検出する可能性があるため、エンドポイントとして細胞死を使用する必要性が減少します。 さらに、これらの蛍光アッセイの多くは、96 ウェル プレートと蛍光プレート リーダーを使用して自動化できます。
これらの試験のいずれかを使用して一連の化学物質に関するデータが収集されると、相対的な毒性が決定される可能性があります。 in vitro 試験で決定される化学物質の相対毒性は、未処理細胞のエンドポイント応答に 50% の影響を与える濃度として表すことができます。 この決定は EC と呼ばれます。50 (E効果的な Cの集中 50% の細胞) で、さまざまな化学物質の毒性を in vitro で比較するために使用できます。 (相対毒性の評価に使用される同様の用語は IC50これは、細胞プロセス、例えば、ニュートラルレッドを吸収する能力を 50% 阻害する化学物質の濃度を示しています。) 化学物質の相対的な in vitro 毒性が、相対的な in vitro 毒性に匹敵するかどうかを評価することは容易ではありません。 in vivo 系にはトキシコキネティクス、代謝、修復および防御メカニズムなど、非常に多くの交絡因子があるためです。 さらに、これらのアッセイのほとんどは一般的な細胞毒性のエンドポイントを測定するため、機械論に基づいていません。 したがって、in vitro と in vivo の相対毒性の間の一致は、単純に相関関係にあります。 インビトロからインビボへの外挿には多くの複雑さと困難があるにもかかわらず、これらのインビトロ試験は非常に価値があることが証明されています。なぜなら、これらの試験管内試験は、実行が簡単で安価であり、毒性の高い薬物または化学物質を初期段階でフラグ付けするためのスクリーニングとして使用できるからです。発達。
標的臓器毒性
In vitro 試験は、特定の標的臓器毒性を評価するためにも使用できます。 そのような試験の設計には多くの困難が伴いますが、最も顕著なのは、in vitro システムが in vivo で臓器の多くの機能を維持できないことです。 多くの場合、細胞を動物から採取して培養すると、細胞は急速に変性および/または脱分化する傾向があります。つまり、器官のような機能を失い、より一般的なものになります。 これは、短期間、通常は数日以内に、培養物が毒素の器官特異的効果を評価するのにもはや役に立たないという問題を提示します。
これらの問題の多くは、分子生物学および細胞生物学の最近の進歩により克服されつつあります。 インビボでの細胞環境について得られる情報は、インビトロでの培養条件の調節に利用することができる。 1980 年代半ば以降、新しい成長因子やサイトカインが発見され、現在ではその多くが市販されています。 培養中の細胞にこれらの因子を添加すると、細胞の完全性が維持され、より分化した機能を長期間保持するのにも役立ちます。 他の基礎研究により、培養中の細胞の栄養およびホルモン要件に関する知識が増し、新しい培地が処方される可能性があります。 最近の進歩は、細胞を培養できる天然および人工の細胞外マトリックスの両方を特定することにおいてもなされました。 これらの異なるマトリックスでの細胞の培養は、構造と機能の両方に大きな影響を与える可能性があります。 この知識から得られる主な利点は、培養中の細胞の環境を複雑に制御し、基本的な細胞プロセスおよびさまざまな化学物質への応答に対するこれらの要因の影響を個別に調べる能力です。 要するに、これらのシステムは、臓器固有の毒性メカニズムに関する優れた洞察を提供できます。
多くの標的臓器毒性研究は、初代細胞で実施されます。初代細胞は、定義上、臓器から新たに分離され、通常、培養中に有限の寿命を示します。 毒性評価のために器官から単一細胞タイプの初代培養を行うことには多くの利点があります。 機構的な観点から、このような培養は、化学物質の特定の細胞標的を研究するのに役立ちます。 場合によっては、器官からの XNUMX つ以上の細胞型を一緒に培養することができ、これにより、毒素に応答した細胞間相互作用を観察できるという追加の利点が得られます。 皮膚の共培養システムの中には、生体内の皮膚に似た三次元構造を形成するように設計されたものがあります。 肝臓や腎臓など、異なる臓器の細胞を共培養することも可能です。 このタイプの培養は、肝臓で生物活性化されなければならない化学物質の腎臓細胞に特異的な影響を評価するのに役立ちます。
分子生物学的ツールは、標的臓器毒性試験に役立つ連続細胞株の開発にも重要な役割を果たしてきました。 これらの細胞株は、初代細胞に DNA をトランスフェクトすることによって生成されます。 トランスフェクション手順において、細胞およびＤＮＡは、ＤＮＡが細胞によって取り込まれることができるように処理される。 通常、DNA はウイルス由来であり、発現すると細胞が不死化する (つまり、培養中で長期間生きて増殖できる) 遺伝子を含んでいます。 不死化遺伝子が誘導性プロモーターによって制御されるように、ＤＮＡを操作することもできる。 このタイプの構築物の利点は、不死化遺伝子の発現を可能にする適切な化学的刺激を受けた場合にのみ、細胞が分裂することです。 このような構築物の例は、シミアンウイルス 40 (SV40) 由来のラージ T 抗原遺伝子 (不死化遺伝子) であり、その前にメタロチオネイン遺伝子のプロモーター領域があり、培地中の金属の存在によって誘導されます。 したがって、遺伝子が細胞にトランスフェクトされた後、細胞を低濃度の亜鉛で処理して、MT プロモーターを刺激し、T 抗原遺伝子の発現をオンにすることができます。 これらの条件下で、細胞は増殖します。 培地から亜鉛が除去されると、細胞は分裂を停止し、理想的な条件下では、組織固有の機能を発現する状態に戻ります。
細胞培養技術の進歩と組み合わせた不死化細胞を生成する能力は、脳、腎臓、肝臓など、さまざまな臓器からの細胞株の作成に大きく貢献しています。 ただし、これらの細胞株を真正な細胞タイプの代理として使用する前に、それらが実際にどの程度「正常」であるかを判断するために慎重に特徴付けする必要があります。
標的臓器毒性を研究するための他の in vitro システムでは、複雑さが増しています。 in vitro システムは、単一細胞から全臓器培養へと複雑さが増すにつれて、in vivo 環境に匹敵するようになりますが、同時に、変数の数が増えると、制御がはるかに難しくなります。 したがって、より高いレベルの組織に移行することで得られるものは、研究者が実験環境を制御できないために失われる可能性があります。 表 1 は、肝毒性の研究に使用されてきたさまざまな in vitro システムの特性の一部を比較しています。
表 1. 肝毒性試験用の in vitro システムの比較
| エントルピー | 複雑 （相互作用のレベル） |
肝臓特有の機能を保持する能力 | 潜在的な培養期間 | 環境をコントロールする能力 |
| 不死化細胞株 | 一部の細胞間 (細胞株によって異なります) | 不良から良好 (細胞株によって異なります) | 不定 | 優れた |
| 初代肝細胞培養 | セル間 | 可～優（培養条件により異なる） | 数日から数週間 | 優れた |
| 肝細胞共培養 | cell to cell (同じ細胞型と異なる細胞型の間) | 最良です | 週間 | 優れた |
| レバースライス | 細胞から細胞へ（すべての細胞タイプの中で） | 最良です | 数時間から数日 | 良い |
| 分離、灌流肝臓 | 細胞間 (すべての細胞型の中で)、および臓器内 | 優れた | 時 | フェア |
精密に切断された組織切片は、毒物学的研究により広く使用されています。 研究者が無菌環境で均一な組織切片を切断できるようにする新しい器具が利用可能になりました。 組織切片は、臓器のすべての種類の細胞が存在し、生体内の構造と細胞間コミュニケーションを維持するという点で、細胞培養システムよりも優れた利点を提供します。 したがって、特定の標的器官毒性を調査するだけでなく、器官内の標的細胞タイプを決定するために、インビトロ研究を実施することができる。 スライスの欠点は、主にスライスの内部の細胞への酸素の拡散が不十分なために、最初の 24 時間の培養後に急速に変性することです。 しかし、最近の研究では、穏やかな回転によってより効率的な通気が達成される可能性があることが示されています。 これは、より複雑な培地の使用とともに、スライスが最大 96 時間生き残ることを可能にします。
組織外植片は、組織切片と概念が似ており、特定の標的臓器における化学物質の毒性を判断するためにも使用できます。 組織外植片は、組織の小片 (催奇形性の研究では、無傷の胚) を除去し、さらなる研究のために培養に入れることによって確立されます。 外植片培養は、皮膚の刺激性や腐食性、気管のアスベスト研究、脳組織の神経毒性研究など、短期間の毒性研究に有用です。
分離された灌流臓器は、標的臓器の毒性を評価するために使用することもできます。 これらのシステムは、すべての細胞タイプが存在するという点で、組織切片および外植片と同様の利点を提供しますが、切片の準備に伴う操作によって導入される組織へのストレスはありません。 さらに、それらは臓器内相互作用の維持を可能にします。 主な欠点は、短期間の生存率であり、in vitro 毒性試験での使用が制限されます。 代替として機能するという点では、これらの培養は、動物が毒物による in vivo 治療の悪影響を経験しないため、洗練されたものと見なすことができます。 ただし、それらを使用しても、必要な動物の数が大幅に減少するわけではありません。
要約すると、標的臓器毒性の評価に利用できる in vitro システムにはいくつかの種類があります。 これらの技術の XNUMX つまたは複数を使用して、毒性のメカニズムに関する多くの情報を取得することが可能です。 毒性学的プロセスの比較的小さな部分を表す in vitro システムから、in vivo で発生するプロセス全体を推定する方法を知ることには、依然として困難が残っています。
眼刺激性のインビトロ試験
動物福祉の観点からおそらく最も論争の的となっている全動物毒性試験は、ウサギで実施される眼刺激性に関するドレイズ試験です。 このテストでは、化学物質の一定量をウサギの片方の目に入れ、もう片方の目をコントロールとして使用します。 刺激および炎症の程度は、曝露後のさまざまな時点で記録されます。 人道的な理由だけでなく、観察の主観性と結果の変動性のためにも批判されてきたこのテストに代わる方法論を開発するために大きな努力が払われています. ドレイズ テストが受けた厳しい批判にもかかわらず、他の方法では識別が困難な、特に軽度から中程度の刺激性物質を予測することに、ドレイズ テストが非常に成功していることが証明されていることに注目することは興味深いことです。 したがって、インビトロの代替手段に対する需要は非常に大きいです。
ドレイズ テストに代わるものを探すのは複雑ですが、成功すると予測されています。 多数の in vitro およびその他の代替法が開発されており、場合によってはそれらが実装されています。 定義上、動物にとって痛みや苦痛が少ないドレイズ試験の改良版には、人道的な理由だけでなく、ウサギの目に少量の試験材料を入れるロー ボリューム アイ テストが含まれます。人々が実際に偶発的に暴露される可能性のある量をより厳密に模倣します。 別の改良点として、pH が 2 未満または 11.5 を超える物質は、眼に重度の刺激性があることが知られているため、動物実験は行われなくなりました。
1980 年から 1989 年の間に、化粧品の眼刺激性試験に使用されるウサギの数は推定 87% 減少しました。 in vitro 試験は、全動物試験の大幅な削減を実現するための階層試験アプローチの一部として組み込まれています。 このアプローチは、過去の眼刺激性データの徹底的な調査と、評価対象の化学物質の物理的および化学的分析から始まる多段階プロセスです。 これら XNUMX つのプロセスで十分な情報が得られない場合は、一連の in vitro 試験が行われます。 in vitro 試験から得られた追加データは、その物質の安全性を評価するのに十分かもしれません。 そうでない場合、最後のステップは限定的な in vivo 試験を実施することです。 このアプローチが、被験物質の安全性を予測するために必要な動物の数をどのように排除するか、少なくとも劇的に減らすことができるかは容易に理解できます。
この階層テスト戦略の一部として使用される一連の in vitro テストは、特定の業界のニーズによって異なります。 眼刺激性試験は、化粧品から医薬品、工業用化学物質まで、さまざまな業界で行われています。 業界ごとに必要な情報の種類は異なるため、一連の in vitro 試験を XNUMX つ定義することはできません。 テスト バッテリーは、通常、細胞毒性、組織の生理学と生化学の変化、定量的な構造活性相関、炎症メディエーター、回復と修復の XNUMX つのパラメーターを評価するように設計されています。 刺激の原因の XNUMX つである細胞毒性のテストの例として、培養細胞を使用したニュートラルレッドアッセイがあります (上記参照)。 化学物質への暴露に起因する細胞生理学および生化学の変化は、ヒト角膜上皮細胞の培養でアッセイすることができます。 あるいは、研究者は、食肉処理場から入手した無傷または解剖したウシまたはニワトリの眼球も使用しています。 これらの全臓器培養で測定されたエンドポイントの多くは、角膜混濁や角膜腫脹など、in vivo で測定されたものと同じです。
炎症は化学物質による眼の損傷の構成要素であることが多く、このパラメータを調べるために利用できるアッセイが多数あります。 アラキドン酸やサイトカインなどの炎症プロセス中に放出されるメディエーターの存在を、さまざまな生化学的アッセイで検出します。 鶏卵の絨毛尿膜 (CAM) も、炎症の指標として使用できます。 CAM アッセイでは、14 ～ XNUMX 日齢のニワトリ胚の殻の小片を取り除き、CAM を露出させます。 その後、化学物質が CAM に適用され、血管出血などの炎症の徴候がその後さまざまな時点で記録されます。
in vitro で評価するのが最も困難な in vivo プロセスの XNUMX つは、眼の損傷の回復と修復です。 新しく開発された装置であるシリコン マイクロフィジオメーターは、細胞外 pH の小さな変化を測定し、培養細胞をリアルタイムで監視するために使用できます。 この分析は、in vivo 回復とかなりよく相関することが示されており、このプロセスの in vitro テストとして使用されています。 これは、眼刺激性に対するドレイズ試験の代替として採用されている試験の種類の概要です。 今後数年以内に、完全な一連の in vitro テスト バッテリーが定義され、それぞれが特定の目的のために検証される可能性があります。
検証
in vitro 試験方法論が規制当局に受け入れられ、実施されるための鍵は検証です。これは、特定の目的のために候補試験の信頼性を確立するプロセスです。 検証プロセスを定義し、調整する努力は、米国とヨーロッパの両方で行われてきました。 欧州連合は、そこでの取り組みを調整し、米国の学術センターであるジョンズ・ホプキンス動物実験代替法センター (CAAT) などのアメリカの組織と交流するために、1993 年に欧州代替法検証センター (ECVAM) を設立しました。 、および国立衛生研究所、米国環境保護庁、米国食品医薬品局、および消費者製品安全委員会の代表者で構成される、代替法の検証のための機関間調整委員会 (ICCVAM)。
in vitro 試験の検証には、実質的な組織と計画が必要です。 政府の規制当局と産業界および学術界の科学者の間で、受け入れ可能な手順についてコンセンサスが必要であり、プロトコルが設定された基準を満たしていることを保証するために、科学諮問委員会による十分な監督が必要です。 検証研究は、化学物質バンクからの較正された一連の化学物質と、単一のソースからの細胞または組織を使用して、一連の参照実験室で実施する必要があります。 候補試験の試験所内再現性と試験所間再現性の両方を実証し、結果を適切な統計分析にかけなければなりません。 検証研究のさまざまな構成要素からの結果がまとめられると、科学諮問委員会は、特定の目的に対する候補試験の有効性について勧告を行うことができます。 さらに、研究の結果は、査読のあるジャーナルに掲載され、データベースに配置されるべきです。
検証プロセスの定義は現在進行中です。 新しい検証研究はそれぞれ、次の研究の設計に役立つ情報を提供します。 国際的なコミュニケーションと協力は、特に EC 化粧品指令の可決によって課された緊急性の高まりを考えると、広く受け入れられる一連のプロトコルの迅速な開発に不可欠です。 この法律は、本格的な検証作業を実施するために必要な推進力を実際に提供する可能性があります。 このプロセスが完了して初めて、さまざまな規制当局による in vitro 法が受け入れられるようになります。
まとめ
この記事では、in vitro 毒性試験の現状を幅広く概観しました。 in vitro 毒性学の科学は比較的歴史が浅いですが、指数関数的に成長しています。 今後数年間の課題は、細胞および分子研究によって生成されたメカニズムの知識を in vivo データの膨大なインベントリに組み込み、毒性学的メカニズムのより完全な説明を提供し、in vitro データを使用できるパラダイムを確立することです。 in vivo での毒性を予測します。 これらの in vitro 法の固有の価値を実現できるのは、毒物学者と政府代表者の協調した努力のみです。