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Métodos de Teste Toxicológico

Domingo, janeiro 16 2011 18: 45

Biomarcadores

A palavra biomarcador é a abreviação de marcador biológico, um termo que se refere a um evento mensurável que ocorre em um sistema biológico, como o corpo humano. Esse evento é então interpretado como um reflexo, ou marcador, de um estado mais geral do organismo ou da expectativa de vida. Na saúde ocupacional, um biomarcador é geralmente usado como um indicador do estado de saúde ou risco de doença.

Os biomarcadores são usados ​​para estudos in vitro e in vivo que podem incluir seres humanos. Normalmente, três tipos específicos de marcadores biológicos são identificados. Embora alguns biomarcadores possam ser difíceis de classificar, geralmente eles são separados em biomarcadores de exposição, biomarcadores de efeito ou biomarcadores de suscetibilidade (ver tabela 1).

Tabela 1. Exemplos de biomarcadores de exposição ou biomarcadores de efeito que são utilizados em estudos toxicológicos em saúde ocupacional

Amostra Medição Propósito
Biomarcadores de exposição
Tecido adiposo dioxina Exposição à dioxina
Sangue Conduzir Exposição ao chumbo
Osso alumínio exposição de alumínio
respiração exalada Tolueno exposição ao tolueno
Cabelo Mercúrio Exposição ao metilmercúrio
Sérum Benzeno Exposição ao benzeno
Urina Fenol Exposição ao benzeno
Biomarcadores de efeito
Sangue Carboxiemoglobina Exposição ao monóxido de carbono
glóbulos vermelhos Zinco-protoporfirina Exposição ao chumbo
Sérum Colinesterase Exposição a organofosforados
Urina Microglobulinas Exposição nefrotóxica
Os glóbulos brancos adutos de DNA Exposição a mutagênico

 

Dado um grau aceitável de validade, os biomarcadores podem ser empregados para diversos fins. Em uma base individual, um biomarcador pode ser usado para apoiar ou refutar um diagnóstico de um determinado tipo de envenenamento ou outro efeito adverso induzido quimicamente. Em um indivíduo saudável, um biomarcador também pode refletir a hipersuscetibilidade individual a exposições químicas específicas e, portanto, servir como base para previsão de risco e aconselhamento. Em grupos de trabalhadores expostos, alguns biomarcadores de exposição podem ser aplicados para avaliar a extensão da conformidade com os regulamentos de redução da poluição ou a eficácia dos esforços preventivos em geral.

Biomarcadores de Exposição

Um biomarcador de exposição pode ser um composto exógeno (ou um metabólito) dentro do corpo, um produto interativo entre o composto (ou metabólito) e um componente endógeno ou outro evento relacionado à exposição. Mais comumente, os biomarcadores de exposições a compostos estáveis, como metais, compreendem medições das concentrações de metais em amostras apropriadas, como sangue, soro ou urina. Com produtos químicos voláteis, sua concentração na respiração exalada (após a inalação de ar livre de contaminação) pode ser avaliada. Se o composto for metabolizado no corpo, um ou mais metabólitos podem ser escolhidos como biomarcadores da exposição; os metabolitos são frequentemente determinados em amostras de urina.

Métodos modernos de análise podem permitir a separação de isômeros ou congêneres de compostos orgânicos e a determinação da especiação de compostos metálicos ou proporções isotópicas de certos elementos. Análises sofisticadas permitem a determinação de mudanças na estrutura do DNA ou outras macromoléculas causadas pela ligação com produtos químicos reativos. Sem dúvida, essas técnicas avançadas ganharão consideravelmente em importância para aplicações em estudos de biomarcadores, e limites de detecção mais baixos e melhor validade analítica provavelmente tornarão esses biomarcadores ainda mais úteis.

Desenvolvimentos particularmente promissores ocorreram com biomarcadores de exposição a produtos químicos mutagênicos. Esses compostos são reativos e podem formar adutos com macromoléculas, como proteínas ou DNA. Adutos de DNA podem ser detectados em glóbulos brancos ou biópsias de tecidos, e fragmentos específicos de DNA podem ser excretados na urina. Por exemplo, a exposição ao óxido de etileno resulta em reações com as bases do DNA e, após a excisão da base danificada, a N-7-(2-hidroxietil)guanina será eliminada na urina. Alguns adutos podem não se referir diretamente a uma exposição específica. Por exemplo, a 8-hidroxi-2'-desoxiguanosina reflete o dano oxidativo ao DNA, e essa reação pode ser desencadeada por vários compostos químicos, muitos dos quais também induzem a peroxidação lipídica.

Outras macromoléculas também podem ser alteradas pela formação de adutos ou oxidação. De especial interesse, tais compostos reativos podem gerar adutos de hemoglobina que podem ser determinados como biomarcadores de exposição aos compostos. A vantagem é que grandes quantidades de hemoglobina podem ser obtidas a partir de uma amostra de sangue e, dada a vida útil de quatro meses das hemácias, os adutos formados com os aminoácidos da proteína indicarão a exposição total nesse período.

Os adutos podem ser determinados por técnicas sensíveis, como cromatografia lipídica de alta eficiência, e alguns métodos imunológicos também estão disponíveis. Em geral, os métodos analíticos são novos, caros e precisam de mais desenvolvimento e validação. Melhor sensibilidade pode ser obtida usando o 32P pós-ensaio de marcação, que é uma indicação inespecífica de que ocorreu dano ao DNA. Todas essas técnicas são potencialmente úteis para monitoramento biológico e têm sido aplicadas em um número crescente de estudos. No entanto, métodos analíticos mais simples e sensíveis são necessários. Dada a especificidade limitada de alguns métodos em exposições de baixo nível, o tabagismo ou outros fatores podem ter um impacto significativo nos resultados da medição, causando dificuldades de interpretação.

A exposição a compostos mutagênicos, ou a compostos que são metabolizados em mutagênicos, também pode ser determinada pela avaliação da mutagenicidade da urina de um indivíduo exposto. A amostra de urina é incubada com uma cepa de bactéria na qual uma mutação pontual específica é expressa de uma forma que pode ser facilmente medida. Se produtos químicos mutagênicos estiverem presentes na amostra de urina, ocorrerá um aumento na taxa de mutações nas bactérias.

Os biomarcadores de exposição devem ser avaliados em relação à variação temporal da exposição e à relação com os diferentes compartimentos. Assim, o(s) período(s) de tempo representado(s) pelo biomarcador, ou seja, até que ponto a medição do biomarcador reflete a(s) exposição(ões) passada(s) e/ou carga corporal acumulada, deve(m) ser determinado(s) a partir de dados toxicocinéticos para interpretar o resultado. Em particular, o grau em que o biomarcador indica retenção em órgãos-alvo específicos deve ser considerado. Embora as amostras de sangue sejam frequentemente usadas para estudos de biomarcadores, o sangue periférico geralmente não é considerado um compartimento como tal, embora atue como um meio de transporte entre os compartimentos. O grau em que a concentração no sangue reflete os níveis em diferentes órgãos varia amplamente entre diferentes produtos químicos e geralmente também depende da duração da exposição, bem como do tempo desde a exposição.

Às vezes, esse tipo de evidência é usado para classificar um biomarcador como um indicador de dose (total) absorvida ou um indicador de dose efetiva (ou seja, a quantidade que atingiu o tecido-alvo). Por exemplo, a exposição a um determinado solvente pode ser avaliada a partir de dados sobre a concentração real do solvente no sangue em um determinado momento após a exposição. Essa medição refletirá a quantidade de solvente que foi absorvida pelo corpo. Parte da quantidade absorvida será exalada devido à pressão de vapor do solvente. Ao circular no sangue, o solvente interagirá com vários componentes do corpo e, eventualmente, ficará sujeito à degradação por enzimas. O resultado dos processos metabólicos pode ser avaliado pela determinação de ácidos mercaptúricos específicos produzidos por conjugação com glutationa. A excreção cumulativa de ácidos mercaptúricos pode refletir melhor a dose efetiva do que a concentração sanguínea.

Eventos da vida, como reprodução e senescência, podem afetar a distribuição de uma substância química. A distribuição de produtos químicos dentro do corpo é significativamente afetada pela gravidez, e muitos produtos químicos podem atravessar a barreira placentária, causando assim a exposição do feto. A lactação pode resultar na excreção de substâncias químicas lipossolúveis, levando assim a uma diminuição da retenção na mãe, juntamente com uma maior absorção pelo lactente. Durante a perda de peso ou desenvolvimento de osteoporose, produtos químicos armazenados podem ser liberados, o que pode resultar em uma exposição “endógena” renovada e prolongada de órgãos-alvo. Outros fatores podem afetar a absorção individual, metabolismo, retenção e distribuição de compostos químicos, e alguns biomarcadores de suscetibilidade estão disponíveis (ver abaixo).

Biomarcadores de Efeito

Um marcador de efeito pode ser um componente endógeno, ou uma medida da capacidade funcional, ou algum outro indicador do estado ou equilíbrio do corpo ou sistema orgânico, conforme afetado pela exposição. Esses marcadores de efeito são geralmente indicadores pré-clínicos de anormalidades.

Esses biomarcadores podem ser específicos ou inespecíficos. Os biomarcadores específicos são úteis porque indicam um efeito biológico de uma determinada exposição, fornecendo assim evidências que podem ser potencialmente utilizadas para fins preventivos. Os biomarcadores não específicos não apontam para uma causa individual do efeito, mas podem refletir o efeito total e integrado devido a uma exposição mista. Ambos os tipos de biomarcadores podem, portanto, ser de uso considerável na saúde ocupacional.

Não há uma distinção clara entre biomarcadores de exposição e biomarcadores de efeito. Por exemplo, pode-se dizer que a formação do aduto reflete um efeito e não a exposição. No entanto, os biomarcadores de efeito geralmente indicam alterações nas funções das células, tecidos ou do corpo inteiro. Alguns pesquisadores incluem alterações grosseiras, como aumento do peso do fígado de animais de laboratório expostos ou diminuição do crescimento em crianças, como biomarcadores de efeito. Para fins de saúde ocupacional, os biomarcadores de efeito devem ser restritos àqueles que indicam alterações bioquímicas subclínicas ou reversíveis, como inibição de enzimas. O biomarcador de efeito mais utilizado é provavelmente a inibição da colinesterase causada por certos inseticidas, ou seja, organofosforados e carbamatos. Na maioria dos casos, esse efeito é totalmente reversível e a inibição da enzima reflete a exposição total a esse grupo específico de inseticidas.

Algumas exposições não resultam na inibição da enzima, mas sim no aumento da atividade de uma enzima. É o caso de várias enzimas pertencentes à família P450 (ver “Determinantes genéticos da resposta tóxica”). Eles podem ser induzidos por exposições a certos solventes e hidrocarbonetos poliaromáticos (PAHs). Uma vez que essas enzimas são expressas principalmente em tecidos dos quais uma biópsia pode ser difícil de obter, a atividade enzimática é determinada indiretamente in vivo pela administração de um composto que é metabolizado por essa enzima específica e, em seguida, o produto de decomposição é medido na urina ou no plasma.

Outras exposições podem induzir a síntese de uma proteína protetora no organismo. O melhor exemplo é provavelmente a metalotioneína, que se liga ao cádmio e promove a excreção desse metal; a exposição ao cádmio é um dos fatores que resultam no aumento da expressão do gene da metalotioneína. Proteínas protetoras semelhantes podem existir, mas ainda não foram suficientemente exploradas para serem aceitas como biomarcadores. Entre os candidatos a possíveis usos como biomarcadores estão as chamadas proteínas de estresse, originalmente chamadas de proteínas de choque térmico. Essas proteínas são geradas por uma variedade de organismos diferentes em resposta a uma variedade de exposições adversas.

O dano oxidativo pode ser avaliado pela determinação da concentração de malondialdeído no soro ou pela exalação de etano. Da mesma forma, a excreção urinária de proteínas de baixo peso molecular, como a albumina, pode ser utilizada como biomarcador de lesão renal precoce. Vários parâmetros usados ​​rotineiramente na prática clínica (por exemplo, níveis séricos de hormônios ou enzimas) também podem ser úteis como biomarcadores. No entanto, muitos desses parâmetros podem não ser suficientemente sensíveis para detectar comprometimento precoce.

Outro grupo de parâmetros de efeito refere-se aos efeitos genotóxicos (alterações na estrutura dos cromossomos). Tais efeitos podem ser detectados por microscopia de glóbulos brancos que sofrem divisão celular. Danos sérios aos cromossomos – aberrações cromossômicas ou formação de micronúcleos – podem ser vistos em um microscópio. Os danos também podem ser revelados pela adição de um corante às células durante a divisão celular. A exposição a um agente genotóxico pode então ser visualizada como uma troca aumentada do corante entre as duas cromátides de cada cromossomo (troca de cromátides-irmãs). As aberrações cromossômicas estão relacionadas a um risco aumentado de desenvolver câncer, mas o significado de uma taxa aumentada de troca de cromátides-irmãs é menos claro.

Uma avaliação mais sofisticada da genotoxicidade é baseada em mutações pontuais específicas em células somáticas, isto é, glóbulos brancos ou células epiteliais obtidas da mucosa oral. Uma mutação em um locus específico pode tornar as células capazes de crescer em uma cultura que contém uma substância química tóxica (como a 6-tioguanina). Alternativamente, um produto gênico específico pode ser avaliado (por exemplo, concentrações séricas ou teciduais de oncoproteínas codificadas por oncogenes específicos). Obviamente, essas mutações refletem o dano genotóxico total incorrido e não necessariamente indicam nada sobre a exposição causadora. Esses métodos ainda não estão prontos para uso prático em saúde ocupacional, mas o rápido progresso nessa linha de pesquisa sugere que tais métodos estarão disponíveis dentro de alguns anos.

Biomarcadores de Suscetibilidade

Um marcador de suscetibilidade, herdada ou induzida, é um indicador de que o indivíduo é particularmente sensível ao efeito de um xenobiótico ou aos efeitos de um grupo desses compostos. A maior parte da atenção tem sido focada na suscetibilidade genética, embora outros fatores possam ser pelo menos tão importantes. A hipersuscetibilidade pode ser devida a uma característica hereditária, à constituição do indivíduo ou a fatores ambientais.

A capacidade de metabolizar certos produtos químicos é variável e é determinada geneticamente (consulte “Determinantes genéticos da resposta tóxica”). Várias enzimas relevantes parecem ser controladas por um único gene. Por exemplo, a oxidação de produtos químicos estranhos é realizada principalmente por uma família de enzimas pertencentes à família P450. Outras enzimas tornam os metabólitos mais solúveis em água por conjugação (por exemplo, N-acetiltransferase e μ-glutationa).S-transferase). A atividade dessas enzimas é controlada geneticamente e varia consideravelmente. Conforme mencionado acima, a atividade pode ser determinada pela administração de uma pequena dose de um medicamento e, em seguida, pela determinação da quantidade do metabólito na urina. Alguns dos genes já foram caracterizados e as técnicas estão disponíveis para determinar o genótipo. Estudos importantes sugerem que o risco de desenvolver certas formas de câncer está relacionado à capacidade de metabolizar compostos estranhos. Muitas questões ainda permanecem sem resposta, limitando, neste momento, o uso desses potenciais biomarcadores de suscetibilidade na saúde ocupacional.

Outros traços herdados, como alfa1-deficiência de antitripsina ou deficiência de glicose-6-fosfato desidrogenase, também resultam em mecanismos de defesa deficientes no corpo, causando hipersuscetibilidade a certas exposições.

A maioria das pesquisas relacionadas à suscetibilidade tratou da predisposição genética. Outros fatores também desempenham um papel e foram parcialmente negligenciados. Por exemplo, indivíduos com uma doença crônica podem ser mais sensíveis a uma exposição ocupacional. Além disso, se um processo de doença ou exposição anterior a substâncias químicas tóxicas causou algum dano subclínico de órgão, é provável que a capacidade de resistir a uma nova exposição tóxica seja menor. Os indicadores bioquímicos da função do órgão podem, neste caso, ser usados ​​como biomarcadores de suscetibilidade. Talvez o melhor exemplo em relação à hipersuscetibilidade esteja relacionado às respostas alérgicas. Se um indivíduo se tornou sensível a uma exposição específica, anticorpos específicos podem ser detectados no soro. Mesmo que o indivíduo não tenha se tornado sensibilizado, outras exposições atuais ou passadas podem aumentar o risco de desenvolver um efeito adverso relacionado a uma exposição ocupacional.

Um grande problema é determinar o efeito conjunto de exposições mistas no trabalho. Além disso, hábitos pessoais e uso de drogas podem resultar em maior suscetibilidade. Por exemplo, a fumaça do tabaco geralmente contém uma quantidade considerável de cádmio. Assim, com a exposição ocupacional ao cádmio, um fumante inveterado que acumulou quantidades substanciais desse metal no corpo terá maior risco de desenvolver doença renal relacionada ao cádmio.

Aplicação em Saúde Ocupacional

Os biomarcadores são extremamente úteis na pesquisa toxicológica e muitos podem ser aplicáveis ​​no monitoramento biológico. No entanto, as limitações também devem ser reconhecidas. Muitos biomarcadores até agora foram estudados apenas em animais de laboratório. Os padrões toxicocinéticos em outras espécies podem não refletir necessariamente a situação em seres humanos, e a extrapolação pode exigir estudos confirmatórios em voluntários humanos. Além disso, deve-se levar em consideração as variações individuais devido a fatores genéticos ou constitucionais.

Em alguns casos, os biomarcadores de exposição podem não ser viáveis ​​(por exemplo, para produtos químicos de vida curta in vivo). Outros produtos químicos podem ser armazenados ou afetar órgãos que não podem ser acessados ​​por procedimentos de rotina, como o sistema nervoso. A via de exposição também pode afetar o padrão de distribuição e, portanto, também a medição do biomarcador e sua interpretação. Por exemplo, a exposição direta do cérebro através do nervo olfativo provavelmente escapará da detecção pela medição dos biomarcadores de exposição. Quanto aos biomarcadores de efeito, muitos deles não são nada específicos, e a alteração pode ser devida a uma variedade de causas, incluindo fatores de estilo de vida. Talvez em particular com os biomarcadores de suscetibilidade, a interpretação deva ser muito cautelosa no momento, pois muitas incertezas permanecem sobre o significado geral de saúde de genótipos individuais.

Na saúde ocupacional, o biomarcador ideal deve atender a vários requisitos. Em primeiro lugar, a coleta e análise de amostras devem ser simples e confiáveis. Para uma qualidade analítica ideal, a padronização é necessária, mas os requisitos específicos variam consideravelmente. As principais áreas de preocupação incluem: preparação do indivíduo, procedimento de amostragem e manuseio da amostra e procedimento de medição; o último abrange fatores técnicos, como calibração e procedimentos de garantia de qualidade, e fatores relacionados ao indivíduo, como educação e treinamento de operadores.

Para documentação de validade analítica e rastreabilidade, os materiais de referência devem ser baseados em matrizes relevantes e com concentrações apropriadas de substâncias tóxicas ou metabólitos relevantes em níveis apropriados. Para que os biomarcadores sejam usados ​​para monitoramento biológico ou para fins diagnósticos, os laboratórios responsáveis ​​devem ter procedimentos analíticos bem documentados com características de desempenho definidas e registros acessíveis para permitir a verificação dos resultados. Ao mesmo tempo, no entanto, a economia de caracterizar e usar materiais de referência para complementar os procedimentos de garantia de qualidade em geral deve ser considerada. Assim, a qualidade alcançável dos resultados e os usos a que eles são destinados devem ser equilibrados com os custos adicionais de garantia de qualidade, incluindo materiais de referência, mão de obra e instrumentação.

Outra exigência é que o biomarcador seja específico, pelo menos nas circunstâncias do estudo, para um determinado tipo de exposição, com uma relação clara com o grau de exposição. Caso contrário, o resultado da medição do biomarcador pode ser muito difícil de interpretar. Para uma interpretação adequada do resultado da medição de um biomarcador de exposição, a validade diagnóstica deve ser conhecida (ou seja, a tradução do valor do biomarcador na magnitude de possíveis riscos à saúde). Nesta área, os metais servem de paradigma para a pesquisa de biomarcadores. Pesquisas recentes demonstraram a complexidade e sutileza das relações dose-resposta, com dificuldade considerável em identificar níveis sem efeito e, portanto, também em definir exposições toleráveis. No entanto, esse tipo de pesquisa também ilustrou os tipos de investigação e o refinamento necessários para descobrir as informações relevantes. Para a maioria dos compostos orgânicos, ainda não estão disponíveis associações quantitativas entre as exposições e os correspondentes efeitos adversos à saúde; em muitos casos, mesmo os órgãos-alvo primários não são conhecidos com certeza. Além disso, a avaliação dos dados de toxicidade e concentrações de biomarcadores é muitas vezes complicada pela exposição a misturas de substâncias, em vez da exposição a um único composto no momento.

Antes que o biomarcador seja aplicado para fins de saúde ocupacional, algumas considerações adicionais são necessárias. Primeiro, o biomarcador deve refletir apenas uma alteração subclínica e reversível. Em segundo lugar, dado que os resultados dos biomarcadores podem ser interpretados em relação aos riscos à saúde, esforços preventivos devem estar disponíveis e devem ser considerados realistas caso os dados dos biomarcadores sugiram a necessidade de reduzir a exposição. Em terceiro lugar, o uso prático do biomarcador deve ser geralmente considerado eticamente aceitável.

As medições de higiene industrial podem ser comparadas com os limites de exposição aplicáveis. Da mesma forma, os resultados em biomarcadores de exposição ou biomarcadores de efeito podem ser comparados aos limites de ação biológica, às vezes referidos como índices de exposição biológica. Esses limites devem ser baseados no melhor conselho de médicos e cientistas de disciplinas apropriadas, e os administradores responsáveis ​​como “gerentes de risco” devem levar em consideração os fatores éticos, sociais, culturais e econômicos relevantes. A base científica deve, se possível, incluir relações dose-resposta complementadas por informações sobre variações na suscetibilidade dentro da população em risco. Em alguns países, trabalhadores e membros do público em geral estão envolvidos no processo de estabelecimento de padrões e fornecem contribuições importantes, especialmente quando a incerteza científica é considerável. Uma das maiores incertezas é como definir um efeito adverso à saúde que deve ser evitado - por exemplo, se a formação de aduto como um biomarcador de exposição por si só representa um efeito adverso (ou seja, biomarcador de efeito) que deve ser evitado. É provável que surjam questões difíceis ao decidir se é eticamente defensável, para o mesmo composto, ter limites diferentes para exposição acidental, por um lado, e exposição ocupacional, por outro.

As informações geradas pelo uso de biomarcadores geralmente devem ser transmitidas aos indivíduos examinados na relação médico-paciente. As preocupações éticas devem ser consideradas em particular em relação a análises de biomarcadores altamente experimentais que atualmente não podem ser interpretadas em detalhes em termos de riscos reais à saúde. Para a população em geral, por exemplo, existe orientação limitada no momento com relação à interpretação de biomarcadores de exposição além da concentração de chumbo no sangue. Também é importante a confiança nos dados gerados (ou seja, se a amostragem apropriada foi realizada e se procedimentos sólidos de garantia de qualidade foram utilizados no laboratório envolvido). Uma área adicional de preocupação especial está relacionada à hipersuscetibilidade individual. Essas questões devem ser levadas em consideração ao fornecer o feedback do estudo.

Todos os setores da sociedade afetados ou preocupados com a realização de um estudo de biomarcadores precisam ser envolvidos no processo de tomada de decisão sobre como lidar com as informações geradas pelo estudo. Procedimentos específicos para prevenir ou superar conflitos éticos inevitáveis ​​devem ser desenvolvidos dentro dos marcos legais e sociais da região ou país. No entanto, cada situação representa um conjunto diferente de questões e armadilhas, e nenhum procedimento único para envolvimento do público pode ser desenvolvido para cobrir todas as aplicações de biomarcadores de exposição.

 

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Domingo, janeiro 16 2011 18: 49

Avaliação de Toxicidade Genética

A avaliação da toxicidade genética é a avaliação dos agentes quanto à sua capacidade de induzir qualquer um dos três tipos gerais de alterações (mutações) no material genético (DNA): gene, cromossômico e genômico. Em organismos como os humanos, os genes são compostos de DNA, que consiste em unidades individuais chamadas bases de nucleotídeos. Os genes são arranjados em estruturas físicas discretas chamadas cromossomos. A genotoxicidade pode resultar em efeitos significativos e irreversíveis na saúde humana. O dano genotóxico é um passo crítico na indução do câncer e também pode estar envolvido na indução de defeitos congênitos e morte fetal. As três classes de mutações mencionadas acima podem ocorrer dentro de qualquer um dos dois tipos de tecidos possuídos por organismos como os humanos: esperma ou óvulos (células germinativas) e o tecido remanescente (células somáticas).

Os ensaios que medem a mutação genética são aqueles que detectam a substituição, adição ou deleção de nucleotídeos dentro de um gene. Os ensaios que medem a mutação cromossômica são aqueles que detectam quebras ou rearranjos cromossômicos envolvendo um ou mais cromossomos. Os ensaios que medem a mutação genômica são aqueles que detectam alterações no número de cromossomos, uma condição chamada aneuploidia. A avaliação da toxicidade genética mudou consideravelmente desde o desenvolvimento por Herman Muller em 1927 do primeiro ensaio para detectar agentes genotóxicos (mutagênicos). Desde então, foram desenvolvidos mais de 200 ensaios que medem mutações no DNA; no entanto, menos de dez ensaios são comumente usados ​​atualmente para avaliação de toxicidade genética. Este artigo analisa esses ensaios, descreve o que eles medem e explora o papel desses ensaios na avaliação de toxicidade.

Identificação de Riscos de Câncer Antes do Desenvolvimento do Campo da Toxicologia Genética

A toxicologia genética tornou-se parte integrante do processo geral de avaliação de risco e ganhou estatura nos últimos tempos como um preditor confiável para atividade carcinogênica. No entanto, antes do desenvolvimento da toxicologia genética (antes de 1970), outros métodos foram e ainda estão sendo usados ​​para identificar riscos potenciais de câncer para os seres humanos. Existem seis categorias principais de métodos atualmente usados ​​para identificar riscos de câncer humano: estudos epidemiológicos, bioensaios in vivo de longo prazo, bioensaios in vivo de médio prazo, bioensaios in vivo e in vitro de curto prazo, inteligência artificial (estrutura-atividade), e inferência baseada em mecanismo.

A Tabela 1 apresenta as vantagens e desvantagens desses métodos.

Tabela 1. Vantagens e desvantagens dos métodos atuais para identificar riscos de câncer humano

  Diferenciais Desvantagens
Estudos epidemiológicos (1) os seres humanos são indicadores definitivos de doenças;
(2) avaliar populações sensíveis ou suscetíveis;
(3) coortes de exposição ocupacional; (4) alertas sentinelas ambientais
(1) geralmente retrospectivo (certidões de óbito, vieses de memória, etc.); (2) insensível, caro, demorado; (3) dados de exposição confiáveis ​​às vezes indisponíveis ou difíceis de obter; (4) exposições combinadas, múltiplas e complexas; falta de coortes de controle apropriadas; (5) experimentos em humanos não realizados; (6) detecção de câncer, não prevenção
Bioensaios in vivo de longa duração (1) avaliações prospectivas e retrospectivas (validação); (2) excelente correlação com carcinógenos humanos identificados; (3) níveis de exposição e condições conhecidas; (4) identifica efeitos de toxicidade química e carcinogenicidade; (5) resultados obtidos de forma relativamente rápida; (6) comparações qualitativas entre classes químicas; (7) sistemas biológicos integrados e interativos intimamente relacionados aos humanos (1) raramente replicado, uso intensivo de recursos; (3) instalações limitadas adequadas para tais experimentos; (4) debate sobre extrapolação de espécies; (5) as exposições usadas são frequentemente em níveis muito superiores aos experimentados por humanos; (6) a exposição a um único produto químico não imita as exposições humanas, que geralmente são a vários produtos químicos simultaneamente
Bioensaios in vivo e in vitro de médio e curto prazo (1) mais rápido e menos dispendioso do que outros ensaios; (2) grandes amostras que são facilmente reproduzíveis;
(3) pontos finais biologicamente significativos são medidos (mutação, etc.); (4) podem ser usados ​​como ensaios de triagem para selecionar produtos químicos para bioensaios de longo prazo
(1) in vitro não prediz totalmente in vivo; (2) geralmente organismo ou órgão específico; (3) potências não comparáveis ​​a animais inteiros ou humanos
Associações estrutura química-atividade biológica (1) relativamente fácil, rápido e barato; (2) confiável para certas classes químicas (por exemplo, nitrosaminas e corantes de benzidina); (3) desenvolvido a partir de dados biológicos, mas não dependente de experimentação biológica adicional (1) não “biológica”; (2) muitas exceções às regras formuladas; (3) retrospectivo e raramente (mas se tornando) prospectivo
Inferências baseadas em mecanismos (1) razoavelmente preciso para certas classes de produtos químicos; (2) permite refinamentos de hipóteses; (3) pode orientar avaliações de risco para populações sensíveis (1) mecanismos de carcinogênese química indefinidos, múltiplos e provavelmente químicos ou específicos de classe; (2) pode deixar de destacar exceções aos mecanismos gerais

 

Justificativa e Base Conceitual para Ensaios de Toxicologia Genética

Embora os tipos e números exatos de ensaios usados ​​para avaliação de toxicidade genética estejam em constante evolução e variem de país para país, os mais comuns incluem ensaios para (1) mutação genética em bactérias e/ou células de mamíferos cultivadas e (2) mutação cromossômica em células de mamíferos cultivadas e/ou medula óssea em camundongos vivos. Alguns dos ensaios dentro desta segunda categoria também podem detectar aneuploidia. Embora esses ensaios não detectem mutações em células germinativas, eles são usados ​​principalmente devido ao custo extra e à complexidade da realização de ensaios de células germinativas. No entanto, ensaios de células germinativas em camundongos são usados ​​quando informações sobre os efeitos das células germinativas são desejadas.

Estudos sistemáticos durante um período de 25 anos (1970-1995), especialmente no Programa Nacional de Toxicologia dos EUA na Carolina do Norte, resultaram no uso de um número discreto de ensaios para detectar a atividade mutagênica dos agentes. A justificativa para avaliar a utilidade dos ensaios foi baseada em sua capacidade de detectar agentes que causam câncer em roedores e que são suspeitos de causar câncer em humanos (ou seja, carcinógenos). Isso ocorre porque estudos durante as últimas décadas indicaram que as células cancerígenas contêm mutações em certos genes e que muitos carcinógenos também são mutagênicos. Assim, as células cancerígenas são vistas como contendo mutações de células somáticas, e a carcinogênese é vista como um tipo de mutagênese de células somáticas.

Os ensaios de toxicidade genética usados ​​mais comumente hoje foram selecionados não apenas por causa de seu grande banco de dados, custo relativamente baixo e facilidade de desempenho, mas porque demonstraram detectar muitos carcinógenos de roedores e, presumivelmente, humanos. Consequentemente, os ensaios de toxicidade genética são usados ​​para prever a potencial carcinogenicidade dos agentes.

Um importante desenvolvimento conceitual e prático no campo da toxicologia genética foi o reconhecimento de que muitos carcinógenos foram modificados por enzimas dentro do corpo, criando formas alteradas (metabólitos) que frequentemente eram a forma carcinogênica e mutagênica definitiva do produto químico original. Para duplicar esse metabolismo em uma placa de Petri, Heinrich Malling mostrou que a inclusão de uma preparação de fígado de roedor continha muitas das enzimas necessárias para realizar essa conversão ou ativação metabólica. Assim, muitos ensaios de toxicidade genética realizados em placas ou tubos (in vitro) empregam a adição de preparações enzimáticas semelhantes. As preparações simples são chamadas de mistura S9 e as preparações purificadas são chamadas de microssomos. Algumas células bacterianas e de mamíferos já foram geneticamente modificadas para conter alguns dos genes de roedores ou humanos que produzem essas enzimas, reduzindo a necessidade de adicionar mistura S9 ou microssomos.

Ensaios e Técnicas de Toxicologia Genética

Os sistemas bacterianos primários usados ​​para triagem de toxicidade genética são o ensaio de mutagenicidade de Salmonella (Ames) e, em uma extensão muito menor, a cepa WP2 de Escherichia coli. Estudos em meados da década de 1980 indicaram que o uso de apenas duas cepas do sistema Salmonella (TA98 e TA100) eram suficientes para detectar aproximadamente 90% dos mutagênicos conhecidos de Salmonella. Assim, essas duas cepas são usadas para a maioria dos propósitos de triagem; no entanto, várias outras cepas estão disponíveis para testes mais extensos.

Esses ensaios são realizados de várias maneiras, mas dois procedimentos gerais são os ensaios de incorporação em placa e suspensão líquida. No ensaio de incorporação de placa, as células, o produto químico de teste e (quando desejado) o S9 são adicionados juntos em um ágar liquefeito e despejados na superfície de uma placa de Petri de ágar. O ágar superior endurece em alguns minutos e as placas são incubadas por dois a três dias, após o que as células mutantes cresceram para formar aglomerados visualmente detectáveis ​​de células chamadas colônias, que são então contadas. O meio de ágar contém agentes seletivos ou é composto de ingredientes de forma que apenas as células recém-mutadas irão crescer. O ensaio de incubação líquida é semelhante, exceto que as células, agente de teste e S9 são incubados juntos em líquido que não contém ágar liquefeito e, em seguida, as células são lavadas para remover o agente de teste e S9 e semeadas no ágar.

Mutações em células de mamíferos cultivadas são detectadas principalmente em um dos dois genes: hprt e tk. Semelhante aos ensaios bacterianos, as linhagens de células de mamíferos (desenvolvidas a partir de roedores ou células humanas) são expostas ao agente de teste em placas de cultura de plástico ou tubos e, em seguida, são semeadas em placas de cultura que contêm meio com um agente seletivo que permite apenas o crescimento de células mutantes . Os ensaios usados ​​para esse fim incluem o CHO/HPRT, o TK6 e o ​​linfoma de camundongo L5178Y/TK+/- ensaios. Outras linhas de células contendo várias mutações de reparo de DNA, bem como contendo alguns genes humanos envolvidos no metabolismo também são usadas. Esses sistemas permitem a recuperação de mutações dentro do gene (mutação gênica), bem como mutações envolvendo regiões do cromossomo que flanqueiam o gene (mutação cromossômica). No entanto, este último tipo de mutação é recuperado em muito maior extensão pelo tk sistemas de genes do que pelos hprt sistemas de genes devido à localização do tk desconfortável.

Semelhante ao ensaio de incubação líquida para mutagenicidade bacteriana, os ensaios de mutagenicidade de células de mamíferos geralmente envolvem a exposição das células em placas ou tubos de cultura na presença do agente de teste e S9 por várias horas. As células são então lavadas, cultivadas por mais alguns dias para permitir que os produtos gênicos normais (tipo selvagem) sejam degradados e os produtos gênicos recém-mutados sejam expressos e acumulados, e então eles são semeados em meio contendo um agente seletivo que permite apenas as células mutantes para crescer. Como os ensaios bacterianos, as células mutantes crescem em colônias visualmente detectáveis ​​que são então contadas.

A mutação cromossômica é identificada principalmente por ensaios citogenéticos, que envolvem a exposição de roedores e/ou roedores ou células humanas em placas de cultura a um produto químico de teste, permitindo que uma ou mais divisões celulares ocorram, coloração dos cromossomos e, em seguida, exame visual dos cromossomos através de um microscópio para detectar alterações na estrutura ou no número de cromossomos. Embora uma variedade de parâmetros possa ser examinada, os dois que são atualmente aceitos pelas agências reguladoras como sendo os mais significativos são as aberrações cromossômicas e uma subcategoria chamada micronúcleos.

São necessários treinamento e experiência consideráveis ​​para pontuar as células quanto à presença de aberrações cromossômicas, o que torna esse procedimento caro em termos de tempo e dinheiro. Em contraste, os micronúcleos requerem pouco treinamento e sua detecção pode ser automatizada. Os micronúcleos aparecem como pequenos pontos dentro da célula que são distintos do núcleo, que contém os cromossomos. Os micronúcleos resultam de quebra cromossômica ou de aneuploidia. Devido à facilidade de marcar micronúcleos em comparação com aberrações cromossômicas, e porque estudos recentes indicam que os agentes que induzem aberrações cromossômicas na medula óssea de camundongos vivos geralmente induzem micronúcleos neste tecido, os micronúcleos são agora comumente medidos como uma indicação da capacidade de um agente para induzir mutação cromossômica.

Embora os ensaios de células germinativas sejam usados ​​com muito menos frequência do que os outros ensaios descritos acima, eles são indispensáveis ​​para determinar se um agente representa um risco para as células germinativas, cujas mutações podem levar a efeitos na saúde nas gerações seguintes. Os ensaios de células germinativas mais comumente usados ​​são em camundongos e envolvem sistemas que detectam (1) translocações hereditárias (trocas) entre cromossomos (ensaio de translocação hereditária), (2) genes ou mutações cromossômicas envolvendo genes específicos (visíveis ou bioquímicas de locus específico ensaios) e (3) mutações que afetam a viabilidade (ensaio letal dominante). Tal como acontece com os ensaios de células somáticas, a suposição de trabalho com os ensaios de células germinativas é que os agentes positivos nesses ensaios são presumivelmente mutagênicos em células germinativas humanas.

Situação Atual e Perspectivas Futuras

Estudos recentes indicaram que apenas três informações eram necessárias para detectar aproximadamente 90% de um conjunto de 41 carcinógenos de roedores (ou seja, presumíveis carcinógenos humanos e mutagênicos de células somáticas). Estes incluíram (1) conhecimento da estrutura química do agente, especialmente se ele contiver porções eletrofílicas (consulte a seção sobre relações estrutura-atividade); (2) Dados de mutagenicidade de Salmonella; e (3) dados de um ensaio de toxicidade crônica de 90 dias em roedores (camundongos e ratos). De fato, praticamente todos os carcinógenos humanos declarados pela IARC são detectáveis ​​como mutagênicos usando apenas o ensaio de Salmonella e o ensaio de micronúcleo de medula óssea de camundongo. O uso desses ensaios de mutagenicidade para detectar potenciais carcinógenos humanos é apoiado ainda mais pela constatação de que a maioria dos carcinógenos humanos são carcinógenos em ratos e camundongos (carcinógenos transespécies) e que a maioria dos carcinógenos transespécies são mutagênicos em Salmonella e/ou induzem micronúcleos na medula óssea de camundongos.

Com os avanços na tecnologia do DNA, o projeto do genoma humano e uma melhor compreensão do papel da mutação no câncer, estão sendo desenvolvidos novos ensaios de genotoxicidade que provavelmente serão incorporados aos procedimentos de triagem padrão. Entre eles estão o uso de células transgênicas e roedores. Sistemas transgênicos são aqueles em que um gene de outra espécie foi introduzido em uma célula ou organismo. Por exemplo, já estão em uso experimental camundongos transgênicos que permitem a detecção de mutação em qualquer órgão ou tecido do animal, a partir da introdução de um gene bacteriano no camundongo. Células bacterianas, como Salmonella, e células de mamíferos (incluindo linhagens celulares humanas) já estão disponíveis contendo genes envolvidos no metabolismo de agentes carcinogênicos/mutagênicos, como os genes P450. Análise molecular das mutações reais induzidas no gene trans em roedores transgênicos ou em genes nativos, como hprt, ou os genes-alvo dentro da Salmonella podem agora ser realizados, de modo que a natureza exata das mutações induzidas pelos produtos químicos possa ser determinada, fornecendo informações sobre o mecanismo de ação do produto químico e permitindo comparações com mutações em humanos presumivelmente expostos ao agente .

Avanços moleculares em citogenética agora permitem uma avaliação mais detalhada de mutações cromossômicas. Isso inclui o uso de sondas (pequenos pedaços de DNA) que se ligam (hibridizam) a genes específicos. Rearranjos de genes no cromossomo podem então ser revelados pela localização alterada das sondas, que são fluorescentes e facilmente visualizadas como setores coloridos nos cromossomos. O ensaio de eletroforese em gel de célula única para quebra de DNA (comumente chamado de ensaio “cometa”) permite a detecção de quebras de DNA dentro de células individuais e pode se tornar uma ferramenta extremamente útil em combinação com técnicas citogenéticas para detectar danos cromossômicos.

Após muitos anos de uso e a geração de um banco de dados grande e sistematicamente desenvolvido, a avaliação da toxicidade genética pode agora ser feita com apenas alguns ensaios por um custo relativamente pequeno em um curto período de tempo (algumas semanas). Os dados produzidos podem ser usados ​​para prever a capacidade de um agente ser um roedor e, presumivelmente, carcinógeno humano/mutagênico de células somáticas. Esta capacidade permite limitar a introdução no ambiente de agentes mutagénicos e cancerígenos e desenvolver agentes alternativos não mutagénicos. Estudos futuros devem levar a métodos ainda melhores com maior previsibilidade do que os ensaios atuais.

 

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Domingo, janeiro 16 2011 18: 53

Teste de Toxicidade In Vitro

O surgimento de tecnologias sofisticadas em biologia molecular e celular estimulou uma evolução relativamente rápida nas ciências da vida, incluindo a toxicologia. Com efeito, o foco da toxicologia está mudando de animais inteiros e populações de animais inteiros para as células e moléculas de animais individuais e humanos. Desde meados da década de 1980, os toxicologistas começaram a empregar essas novas metodologias para avaliar os efeitos dos produtos químicos nos sistemas vivos. Como uma progressão lógica, tais métodos estão sendo adaptados para fins de teste de toxicidade. Esses avanços científicos trabalharam em conjunto com fatores sociais e econômicos para efetuar mudanças na avaliação da segurança do produto e do risco potencial.

Os fatores econômicos estão especificamente relacionados ao volume de materiais que devem ser testados. Uma infinidade de novos cosméticos, produtos farmacêuticos, pesticidas, produtos químicos e produtos domésticos é introduzida no mercado todos os anos. Todos esses produtos devem ser avaliados quanto à sua toxicidade potencial. Além disso, há um acúmulo de produtos químicos já em uso que não foram adequadamente testados. A enorme tarefa de obter informações de segurança detalhadas sobre todos esses produtos químicos usando métodos tradicionais de testes em animais inteiros seria dispendiosa em termos de dinheiro e tempo, se ao menos pudesse ser realizada.

Há também questões sociais relacionadas à saúde e segurança pública, bem como a crescente preocupação pública com o uso de animais para testes de segurança de produtos. No que diz respeito à segurança humana, grupos de interesse público e de defesa do meio ambiente exerceram pressão significativa sobre as agências governamentais para aplicar regulamentos mais rigorosos sobre produtos químicos. Um exemplo recente disso foi um movimento de alguns grupos ambientalistas para proibir o cloro e compostos contendo cloro nos Estados Unidos. Uma das motivações para uma ação tão extrema reside no fato de que a maioria desses compostos nunca foi adequadamente testada. Do ponto de vista toxicológico, o conceito de proibir toda uma classe de diversos produtos químicos com base apenas na presença de cloro é cientificamente infundado e irresponsável. No entanto, é compreensível que, do ponto de vista do público, haja alguma garantia de que os produtos químicos liberados no meio ambiente não representam um risco significativo à saúde. Tal situação ressalta a necessidade de métodos mais eficientes e rápidos para avaliar a toxicidade.

A outra preocupação social que impactou a área de testes de toxicidade é o bem-estar animal. O número crescente de grupos de proteção animal em todo o mundo expressou considerável oposição ao uso de animais inteiros para testes de segurança de produtos. Campanhas ativas foram travadas contra fabricantes de cosméticos, produtos domésticos e de cuidados pessoais e farmacêuticos na tentativa de interromper os testes em animais. Tais esforços na Europa resultaram na aprovação da Sexta Emenda à Diretiva 76/768/EEC (Diretiva de Cosméticos). A consequência desta Diretiva é que os produtos cosméticos ou ingredientes cosméticos que foram testados em animais após 1º de janeiro de 1998 não podem ser comercializados na União Européia, a menos que métodos alternativos sejam insuficientemente validados. Embora esta Diretiva não tenha jurisdição sobre a venda de tais produtos nos Estados Unidos ou em outros países, ela afetará significativamente as empresas que possuem mercados internacionais que incluem a Europa.

O conceito de alternativas, que constitui a base para o desenvolvimento de outros testes além dos animais inteiros, é definido pelos três Rs: redução no número de animais utilizados; refinamento de protocolos para que os animais experimentem menos estresse ou desconforto; e substituição dos atuais testes em animais com testes in vitro (ou seja, testes feitos fora do animal vivo), modelos de computador ou teste em vertebrados inferiores ou espécies de invertebrados. Os três Rs foram introduzidos em um livro publicado em 1959 por dois cientistas britânicos, WMS Russell e Rex Burch, Os Princípios da Técnica Experimental Humanitária. Russell e Burch afirmaram que a única maneira pela qual resultados científicos válidos podem ser obtidos é por meio do tratamento humano dos animais, e acreditavam que métodos deveriam ser desenvolvidos para reduzir o uso de animais e, finalmente, substituí-los. Curiosamente, os princípios delineados por Russell e Burch receberam pouca atenção até o ressurgimento do movimento de bem-estar animal em meados da década de 1970. Hoje o conceito dos três Rs está muito na vanguarda no que diz respeito à pesquisa, testes e educação.

Em resumo, o desenvolvimento de metodologias de testes in vitro foi influenciado por uma variedade de fatores que convergiram nos últimos dez a 20 anos. É difícil determinar se algum desses fatores isoladamente teria um efeito tão profundo nas estratégias de teste de toxicidade.

Conceito de testes de toxicidade in vitro

Esta seção se concentrará apenas nos métodos in vitro para avaliar a toxicidade, como uma das alternativas aos testes em animais inteiros. Alternativas adicionais não animais, como modelagem por computador e relações quantitativas entre estrutura e atividade, são discutidas em outros artigos deste capítulo.

Os estudos in vitro são geralmente conduzidos em células ou tecidos animais ou humanos fora do corpo. In vitro significa literalmente “em vidro” e refere-se a procedimentos realizados em material vivo ou componentes de material vivo cultivados em placas de Petri ou em tubos de ensaio sob condições definidas. Estes podem ser contrastados com estudos in vivo, ou aqueles realizados “no animal vivo”. Embora seja difícil, se não impossível, projetar os efeitos de uma substância química em um organismo complexo quando as observações estão confinadas a um único tipo de células em uma placa, os estudos in vitro fornecem uma quantidade significativa de informações sobre a toxicidade intrínseca também como mecanismos celulares e moleculares de toxicidade. Além disso, eles oferecem muitas vantagens em relação aos estudos in vivo, pois geralmente são menos caros e podem ser conduzidos em condições mais controladas. Além disso, apesar de ainda ser necessário um pequeno número de animais para obter células para culturas in vitro, esses métodos podem ser considerados alternativas de redução (uma vez que são usados ​​muito menos animais em comparação com estudos in vivo) e alternativas de refinamento (porque eliminam a necessidade submeter os animais às consequências tóxicas adversas impostas pelos experimentos in vivo).

Para interpretar os resultados dos testes de toxicidade in vitro, determinar sua utilidade potencial na avaliação da toxicidade e relacioná-los com o processo toxicológico geral in vivo, é necessário entender qual parte do processo toxicológico está sendo examinada. Todo o processo toxicológico consiste em eventos que se iniciam com a exposição do organismo a um agente físico ou químico, progridem por meio de interações celulares e moleculares e, por fim, se manifestam na resposta de todo o organismo. Os testes in vitro são geralmente limitados à parte do processo toxicológico que ocorre no nível celular e molecular. Os tipos de informação que podem ser obtidos a partir de estudos in vitro incluem vias de metabolismo, interação de metabólitos ativos com alvos celulares e moleculares e desfechos tóxicos potencialmente mensuráveis ​​que podem servir como biomarcadores moleculares para exposição. Em uma situação ideal, o mecanismo de toxicidade de cada produto químico decorrente da exposição à manifestação no organismo seria conhecido, de forma que as informações obtidas nos testes in vitro pudessem ser totalmente interpretadas e relacionadas à resposta de todo o organismo. No entanto, isso é virtualmente impossível, uma vez que relativamente poucos mecanismos toxicológicos completos foram elucidados. Assim, os toxicologistas se deparam com uma situação na qual os resultados de um teste in vitro não podem ser usados ​​como uma previsão totalmente precisa da toxicidade in vivo porque o mecanismo é desconhecido. No entanto, frequentemente durante o processo de desenvolvimento de um teste in vitro, componentes do(s) mecanismo(s) celular e molecular de toxicidade são elucidados.

Uma das principais questões não resolvidas em torno do desenvolvimento e implementação de testes in vitro está relacionada à seguinte consideração: eles devem ser mecanicistas ou basta que sejam descritivos? É indiscutivelmente melhor, do ponto de vista científico, utilizar apenas testes baseados em mecanismos como substitutos para testes in vivo. No entanto, na ausência de conhecimento mecanicista completo, a perspectiva de desenvolver testes in vitro para substituir completamente os testes com animais inteiros em um futuro próximo é quase nula. Isso não exclui, no entanto, o uso de tipos de ensaios mais descritivos como ferramentas de triagem precoce, o que é o caso atualmente. Essas telas resultaram em uma redução significativa no uso de animais. Portanto, até que mais informações mecanísticas sejam geradas, pode ser necessário empregar, de forma mais limitada, testes cujos resultados simplesmente se correlacionam bem com os obtidos in vivo.

Testes in vitro para citotoxicidade

Nesta seção, serão descritos vários testes in vitro que foram desenvolvidos para avaliar o potencial citotóxico de um produto químico. Na maior parte, esses testes são fáceis de realizar e a análise pode ser automatizada. Um teste in vitro comumente usado para citotoxicidade é o ensaio de vermelho neutro. Este ensaio é feito em células em cultura e, para a maioria das aplicações, as células podem ser mantidas em placas de cultura que contêm 96 pequenos poços, cada um com 6.4 mm de diâmetro. Uma vez que cada poço pode ser utilizado para uma única determinação, esta disposição pode acomodar múltiplas concentrações do produto químico em estudo, bem como controlos positivos e negativos com um número suficiente de réplicas para cada um. Após o tratamento das células com várias concentrações do produto químico de teste variando em pelo menos duas ordens de grandeza (por exemplo, de 0.01 mM a 1 mM), bem como produtos químicos de controle positivo e negativo, as células são lavadas e tratadas com vermelho neutro, um corante que pode ser captado e retido apenas por células vivas. O corante pode ser adicionado após a remoção do produto químico em estudo para determinar os efeitos imediatos, ou pode ser adicionado várias vezes após a remoção do produto químico em estudo para determinar os efeitos cumulativos ou retardados. A intensidade da cor em cada poço corresponde ao número de células vivas naquele poço. A intensidade da cor é medida por um espectrofotômetro que pode ser equipado com um leitor de placas. O leitor de placas é programado para fornecer medições individuais para cada um dos 96 poços da placa de cultura. Essa metodologia automatizada permite que o investigador execute rapidamente um experimento de concentração-resposta e obtenha dados estatisticamente úteis.

Outro ensaio relativamente simples para citotoxicidade é o teste MTT. O MTT (brometo de 3[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio) é um corante de tetrazólio que é reduzido por enzimas mitocondriais a uma cor azul. Apenas as células com mitocôndrias viáveis ​​manterão a capacidade de realizar esta reação; portanto, a intensidade da cor está diretamente relacionada ao grau de integridade mitocondrial. Este é um teste útil para detectar compostos citotóxicos gerais, bem como aqueles agentes que visam especificamente as mitocôndrias.

A medição da atividade da lactato desidrogenase (LDH) também é usada como um ensaio de base ampla para citotoxicidade. Esta enzima está normalmente presente no citoplasma de células vivas e é liberada no meio de cultura celular através de membranas celulares permeáveis ​​de células mortas ou moribundas que foram adversamente afetadas por um agente tóxico. Pequenas quantidades de meio de cultura podem ser removidas em vários momentos após o tratamento químico das células para medir a quantidade de LDH liberada e determinar o tempo de toxicidade. Embora o ensaio de liberação de LDH seja uma avaliação muito geral da citotoxicidade, é útil porque é fácil de realizar e pode ser feito em tempo real.

Existem muitos novos métodos sendo desenvolvidos para detectar danos celulares. Métodos mais sofisticados empregam sondas fluorescentes para medir uma variedade de parâmetros intracelulares, como liberação de cálcio e mudanças no pH e potencial de membrana. Em geral, essas sondas são muito sensíveis e podem detectar alterações celulares mais sutis, reduzindo assim a necessidade de usar a morte celular como ponto final. Além disso, muitos desses ensaios fluorescentes podem ser automatizados pelo uso de placas de 96 poços e leitores de placas fluorescentes.

Uma vez que os dados tenham sido coletados em uma série de produtos químicos usando um desses testes, as toxicidades relativas podem ser determinadas. A toxicidade relativa de um produto químico, conforme determinado em um teste in vitro, pode ser expressa como a concentração que exerce um efeito de 50% na resposta final de células não tratadas. Esta determinação é referida como CE50 (Eeficaz Cconcentração para 50% das células) e pode ser usado para comparar toxicidades de diferentes produtos químicos in vitro. (Um termo semelhante usado na avaliação da toxicidade relativa é IC50, indicando a concentração de uma substância química que causa uma inibição de 50% de um processo celular, por exemplo, a capacidade de absorver o vermelho neutro.) Não é fácil avaliar se a toxicidade relativa in vitro das substâncias químicas é comparável à sua relativa em toxicidades in vivo, uma vez que existem muitos fatores de confusão no sistema in vivo, como toxicocinética, metabolismo, reparação e mecanismos de defesa. Além disso, como a maioria desses ensaios mede os pontos finais de citotoxicidade geral, eles não são baseados em mecanismos. Portanto, a concordância entre as toxicidades relativas in vitro e in vivo é simplesmente correlativa. Apesar das inúmeras complexidades e dificuldades em extrapolar de in vitro para in vivo, esses testes in vitro estão se mostrando muito valiosos porque são simples e baratos de realizar e podem ser usados ​​como telas para sinalizar drogas ou produtos químicos altamente tóxicos em estágios iniciais de desenvolvimento.

Toxicidade do Órgão Alvo

Testes in vitro também podem ser usados ​​para avaliar a toxicidade de órgãos-alvo específicos. Há uma série de dificuldades associadas ao planejamento de tais testes, sendo a mais notável a incapacidade dos sistemas in vitro de manter muitas das características do órgão in vivo. Frequentemente, quando as células são retiradas de animais e colocadas em cultura, elas tendem a degenerar rapidamente e/ou a se desdiferenciar, ou seja, perdem suas funções de órgãos e se tornam mais genéricas. Isso representa um problema, pois em um curto período de tempo, geralmente alguns dias, as culturas não são mais úteis para avaliar os efeitos específicos de uma toxina em órgãos.

Muitos desses problemas estão sendo superados por causa dos recentes avanços na biologia molecular e celular. A informação que é obtida sobre o ambiente celular in vivo pode ser utilizada na modulação das condições de cultura in vitro. Desde meados da década de 1980, novos fatores de crescimento e citocinas foram descobertos, e muitos deles estão agora disponíveis comercialmente. A adição desses fatores às células em cultura ajuda a preservar sua integridade e também pode ajudar a reter funções mais diferenciadas por períodos de tempo mais longos. Outros estudos básicos ampliaram o conhecimento das necessidades nutricionais e hormonais das células em cultura, para que novos meios possam ser formulados. Avanços recentes também foram feitos na identificação de matrizes extracelulares naturais e artificiais nas quais as células podem ser cultivadas. A cultura de células nessas diferentes matrizes pode ter efeitos profundos em sua estrutura e função. Uma grande vantagem derivada desse conhecimento é a capacidade de controlar intrincadamente o ambiente das células em cultura e examinar individualmente os efeitos desses fatores nos processos celulares básicos e em suas respostas a diferentes agentes químicos. Em suma, esses sistemas podem fornecer uma grande visão sobre os mecanismos de toxicidade específicos do órgão.

Muitos estudos de toxicidade de órgãos-alvo são conduzidos em células primárias, que por definição são isoladas recentemente de um órgão e geralmente exibem um tempo de vida finito em cultura. Existem muitas vantagens em ter culturas primárias de um único tipo de célula de um órgão para avaliação de toxicidade. De uma perspectiva mecanicista, tais culturas são úteis para estudar alvos celulares específicos de uma substância química. Em alguns casos, dois ou mais tipos de células de um órgão podem ser cultivados juntos, e isso oferece uma vantagem adicional de poder observar as interações célula-célula em resposta a uma toxina. Alguns sistemas de co-cultura para pele foram projetados de modo que formem uma estrutura tridimensional semelhante à pele in vivo. Também é possível co-cultivar células de diferentes órgãos – por exemplo, fígado e rim. Esse tipo de cultura seria útil para avaliar os efeitos específicos das células renais de uma substância química que deve ser bioativada no fígado.

As ferramentas biológicas moleculares também desempenharam um papel importante no desenvolvimento de linhagens celulares contínuas que podem ser úteis para testes de toxicidade de órgãos-alvo. Estas linhas celulares são geradas por transfecção de ADN em células primárias. No procedimento de transfecção, as células e o DNA são tratados de forma que o DNA possa ser absorvido pelas células. O DNA geralmente é de um vírus e contém um gene ou genes que, quando expressos, permitem que as células se tornem imortalizadas (ou seja, capazes de viver e crescer por longos períodos de tempo em cultura). O DNA também pode ser manipulado de modo que o gene imortalizador seja controlado por um promotor induzível. A vantagem desse tipo de construção é que as células se dividirão apenas quando receberem o estímulo químico apropriado para permitir a expressão do gene imortalizador. Um exemplo dessa construção é o grande gene do antígeno T do Simian Virus 40 (SV40) (o gene da imortalização), precedido pela região promotora do gene da metalotioneína, que é induzido pela presença de um metal no meio de cultura. Assim, após o gene ser transfectado nas células, as células podem ser tratadas com baixas concentrações de zinco para estimular o promotor MT e ativar a expressão do gene do antígeno T. Nessas condições, as células proliferam. Quando o zinco é removido do meio, as células param de se dividir e, em condições ideais, retornam a um estado em que expressam suas funções específicas do tecido.

A capacidade de gerar células imortalizadas combinada com os avanços na tecnologia de cultura de células contribuíram muito para a criação de linhagens de células de vários órgãos diferentes, incluindo cérebro, rim e fígado. No entanto, antes que essas linhagens celulares possam ser usadas como substitutas para os tipos celulares genuínos, elas devem ser cuidadosamente caracterizadas para determinar o quão “normais” elas realmente são.

Outros sistemas in vitro para estudar a toxicidade de órgãos-alvo envolvem complexidade crescente. À medida que os sistemas in vitro progridem em complexidade de uma única célula para cultura de órgão inteiro, eles se tornam mais comparáveis ​​ao meio in vivo, mas ao mesmo tempo tornam-se muito mais difíceis de controlar devido ao aumento do número de variáveis. Portanto, o que pode ser ganho ao passar para um nível mais alto de organização pode ser perdido na incapacidade do pesquisador de controlar o ambiente experimental. A Tabela 1 compara algumas das características de vários sistemas in vitro que têm sido usados ​​para estudar a hepatotoxicidade.

Tabela 1. Comparação de sistemas in vitro para estudos de hepatotoxicidade

System Complexidade
(nível de interação)
Capacidade de reter funções específicas do fígado Duração potencial da cultura Capacidade de controlar o ambiente
Linhagens celulares imortalizadas alguma célula para célula (varia com a linha celular) pobre a bom (varia de acordo com a linha celular) indeterminado excelente
Culturas primárias de hepatócitos célula a célula regular a excelente (varia de acordo com as condições da cultura) dias a semanas excelente
Co-culturas de células hepáticas célula a célula (entre os mesmos e diferentes tipos de células) bom a ótimo semanas excelente
fatias de fígado célula a célula (entre todos os tipos de células) bom a ótimo horas a dias Bom estado, com sinais de uso
Fígado isolado e perfundido célula a célula (entre todos os tipos de células) e intra-órgão excelente horas feira

 

Fatias de tecido cortadas com precisão estão sendo usadas mais extensivamente para estudos toxicológicos. Existem novos instrumentos disponíveis que permitem ao pesquisador cortar fatias de tecido uniformes em um ambiente estéril. As fatias de tecido oferecem alguma vantagem sobre os sistemas de cultura de células, pois todos os tipos de células do órgão estão presentes e mantêm sua arquitetura in vivo e comunicação intercelular. Assim, estudos in vitro podem ser conduzidos para determinar o tipo de célula-alvo dentro de um órgão, bem como para investigar a toxicidade específica do órgão-alvo. Uma desvantagem das fatias é que elas degeneram rapidamente após as primeiras 24 horas de cultivo, principalmente devido à má difusão de oxigênio para as células no interior das fatias. No entanto, estudos recentes indicaram que uma aeração mais eficiente pode ser alcançada por meio de uma rotação suave. Isso, junto com o uso de um meio mais complexo, permite que as fatias sobrevivam por até 96 horas.

Os explantes de tecido são semelhantes em conceito às fatias de tecido e também podem ser usados ​​para determinar a toxicidade de produtos químicos em órgãos-alvo específicos. Os explantes de tecido são estabelecidos removendo um pequeno pedaço de tecido (para estudos de teratogenicidade, um embrião intacto) e colocando-o em cultura para estudo posterior. As culturas de explantes têm sido úteis para estudos de toxicidade de curto prazo, incluindo irritação e corrosividade na pele, estudos de amianto na traqueia e estudos de neurotoxicidade no tecido cerebral.

Órgãos perfundidos isolados também podem ser usados ​​para avaliar a toxicidade do órgão-alvo. Esses sistemas oferecem uma vantagem semelhante à das fatias de tecido e explantes, pois todos os tipos de células estão presentes, mas sem o estresse ao tecido introduzido pelas manipulações envolvidas na preparação das fatias. Além disso, permitem a manutenção das interações intra-órgãos. Uma grande desvantagem é sua viabilidade a curto prazo, o que limita seu uso para testes de toxicidade in vitro. Em termos de alternativa, essas culturas podem ser consideradas um refinamento, uma vez que os animais não sofrem as consequências adversas do tratamento in vivo com tóxicos. No entanto, seu uso não diminui significativamente o número de animais necessários.

Em resumo, existem vários tipos de sistemas in vitro disponíveis para avaliar a toxicidade do órgão-alvo. É possível obter muitas informações sobre os mecanismos de toxicidade usando uma ou mais dessas técnicas. A dificuldade permanece em saber como extrapolar de um sistema in vitro, que representa uma parte relativamente pequena do processo toxicológico, para todo o processo que ocorre in vivo.

Testes in vitro para irritação ocular

Talvez o teste de toxicidade de animal inteiro mais controverso do ponto de vista do bem-estar animal seja o teste de Draize para irritação ocular, realizado em coelhos. Neste teste, uma pequena dose fixa de uma substância química é colocada em um dos olhos do coelho enquanto o outro olho é usado como controle. O grau de irritação e inflamação é pontuado em vários momentos após a exposição. Um grande esforço está sendo feito para desenvolver metodologias para substituir este teste, que tem sido criticado não apenas por razões humanas, mas também pela subjetividade das observações e variabilidade dos resultados. É interessante notar que, apesar das duras críticas que o teste de Draize recebeu, ele provou ser notavelmente bem-sucedido em prever irritantes oculares humanos, particularmente substâncias levemente a moderadamente irritantes, que são difíceis de identificar por outros métodos. Assim, as demandas por alternativas in vitro são grandes.

A busca por alternativas ao teste de Draize é complicada, embora se preveja um sucesso. Numerosas alternativas in vitro e outras alternativas foram desenvolvidas e, em alguns casos, implementadas. Alternativas de refinamento ao teste de Draize, que por definição são menos dolorosas ou angustiantes para os animais, incluem o Teste do Olho de Baixo Volume, no qual quantidades menores de materiais de teste são colocadas nos olhos dos coelhos, não apenas por razões humanas, mas para imitam mais de perto as quantidades às quais as pessoas podem realmente ser acidentalmente expostas. Outro refinamento é que as substâncias com pH menor que 2 ou maior que 11.5 não são mais testadas em animais, pois são conhecidas por serem severamente irritantes para os olhos.

Entre 1980 e 1989, houve um declínio estimado de 87% no número de coelhos usados ​​para testes de irritação ocular de cosméticos. Testes in vitro foram incorporados como parte de uma abordagem de teste de nível para trazer essa grande redução em testes com animais inteiros. Essa abordagem é um processo de várias etapas que começa com um exame minucioso dos dados históricos de irritação ocular e análises físicas e químicas do produto químico a ser avaliado. Se esses dois processos não fornecerem informações suficientes, uma bateria de testes in vitro é realizada. Os dados adicionais obtidos nos testes in vitro podem então ser suficientes para avaliar a segurança da substância. Caso contrário, a etapa final seria realizar testes in vivo limitados. É fácil ver como esta abordagem pode eliminar ou pelo menos reduzir drasticamente o número de animais necessários para prever a segurança de uma substância de teste.

A bateria de testes in vitro usada como parte dessa estratégia de teste de nível depende das necessidades da indústria em particular. O teste de irritação ocular é feito por uma ampla variedade de indústrias, de cosméticos a produtos farmacêuticos e produtos químicos industriais. O tipo de informação exigida por cada setor varia e, portanto, não é possível definir uma única bateria de testes in vitro. Uma bateria de testes geralmente é projetada para avaliar cinco parâmetros: citotoxicidade, alterações na fisiologia e bioquímica do tecido, relações quantitativas entre estrutura e atividade, mediadores de inflamação e recuperação e reparo. Um exemplo de teste de citotoxicidade, que é uma possível causa de irritação, é o ensaio de vermelho neutro usando células cultivadas (ver acima). Alterações na fisiologia celular e bioquímica resultantes da exposição a um produto químico podem ser analisadas em culturas de células epiteliais da córnea humana. Alternativamente, os investigadores também usaram globos oculares intactos ou dissecados de bovinos ou de galinhas obtidos de matadouros. Muitos dos parâmetros medidos nessas culturas de órgãos inteiros são os mesmos medidos in vivo, como a opacidade da córnea e o inchaço da córnea.

A inflamação é frequentemente um componente da lesão ocular induzida por produtos químicos, e há vários ensaios disponíveis para examinar esse parâmetro. Vários ensaios bioquímicos detectam a presença de mediadores liberados durante o processo inflamatório, como ácido araquidônico e citocinas. A membrana corioalantóide (CAM) do ovo de galinha também pode ser usada como um indicador de inflamação. No ensaio CAM, um pequeno pedaço da casca de um embrião de galinha de dez a 14 dias é removido para expor o CAM. O produto químico é então aplicado ao CAM e os sinais de inflamação, como hemorragia vascular, são pontuados em vários momentos a partir de então.

Um dos processos in vivo mais difíceis de avaliar in vitro é a recuperação e reparação de lesões oculares. Um instrumento recém-desenvolvido, o microfisiômetro de silício, mede pequenas mudanças no pH extracelular e pode ser usado para monitorar células cultivadas em tempo real. Esta análise demonstrou correlacionar-se razoavelmente bem com a recuperação in vivo e tem sido usada como um teste in vitro para este processo. Esta foi uma breve visão geral dos tipos de testes empregados como alternativas ao teste de Draize para irritação ocular. É provável que nos próximos anos uma série completa de baterias de teste in vitro seja definida e cada uma seja validada para sua finalidade específica.

Validação

A chave para a aceitação regulatória e implementação de metodologias de teste in vitro é a validação, o processo pelo qual a credibilidade de um teste candidato é estabelecida para uma finalidade específica. Esforços para definir e coordenar o processo de validação foram feitos tanto nos Estados Unidos quanto na Europa. A União Européia estabeleceu o Centro Europeu para a Validação de Métodos Alternativos (ECVAM) em 1993 para coordenar esforços e interagir com organizações americanas como o Johns Hopkins Center for Alternatives to Animal Testing (CAAT), um centro acadêmico nos Estados Unidos , e o Comitê de Coordenação Interagencial para a Validação de Métodos Alternativos (ICCVAM), composto por representantes dos Institutos Nacionais de Saúde, da Agência de Proteção Ambiental dos EUA, da Administração de Alimentos e Medicamentos dos EUA e da Comissão de Segurança de Produtos de Consumo.

A validação de testes in vitro requer organização e planejamento substanciais. Deve haver consenso entre reguladores do governo e cientistas industriais e acadêmicos sobre procedimentos aceitáveis ​​e supervisão suficiente por um conselho consultivo científico para garantir que os protocolos atendam aos padrões estabelecidos. Os estudos de validação devem ser realizados em uma série de laboratórios de referência usando conjuntos calibrados de produtos químicos de um banco químico e células ou tecidos de uma única fonte. Tanto a repetibilidade intralaboratorial quanto a reprodutibilidade interlaboratorial de um teste candidato devem ser demonstradas e os resultados submetidos à análise estatística apropriada. Uma vez compilados os resultados dos diferentes componentes dos estudos de validação, o conselho científico pode fazer recomendações sobre a validade do(s) teste(s) candidato(s) para uma finalidade específica. Além disso, os resultados dos estudos devem ser publicados em periódicos revisados ​​por pares e colocados em um banco de dados.

A definição do processo de validação é atualmente um trabalho em andamento. Cada novo estudo de validação fornecerá informações úteis para o desenho do próximo estudo. A comunicação e a cooperação internacional são essenciais para o desenvolvimento rápido de uma série de protocolos amplamente aceitáveis, especialmente devido à crescente urgência imposta pela aprovação da Diretiva de Cosméticos da CE. Esta legislação pode, de fato, fornecer o ímpeto necessário para um esforço sério de validação a ser realizado. É somente com a conclusão deste processo que a aceitação dos métodos in vitro pelas várias comunidades reguladoras pode começar.

Conclusão

Este artigo forneceu uma ampla visão geral do status atual dos testes de toxicidade in vitro. A ciência da toxicologia in vitro é relativamente jovem, mas está crescendo exponencialmente. O desafio para os próximos anos é incorporar o conhecimento mecanístico gerado por estudos celulares e moleculares no vasto inventário de dados in vivo para fornecer uma descrição mais completa dos mecanismos toxicológicos, bem como estabelecer um paradigma pelo qual os dados in vitro possam ser usados para prever a toxicidade in vivo. Somente por meio dos esforços conjuntos de toxicologistas e representantes do governo é que o valor inerente desses métodos in vitro poderá ser realizado.

 

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Domingo, janeiro 16 2011 18: 56

Relacionamentos de atividade de estrutura

A análise de relações de atividade de estrutura (SAR) é a utilização de informações sobre a estrutura molecular de produtos químicos para prever características importantes relacionadas à persistência, distribuição, captação e absorção e toxicidade. SAR é um método alternativo de identificação de produtos químicos potencialmente perigosos, que promete ajudar indústrias e governos a priorizar substâncias para avaliação posterior ou para tomada de decisões em estágio inicial para novos produtos químicos. A toxicologia é um empreendimento cada vez mais caro e com uso intensivo de recursos. As crescentes preocupações sobre o potencial de produtos químicos causarem efeitos adversos em populações humanas expostas levaram as agências reguladoras e de saúde a expandir o alcance e a sensibilidade dos testes para detectar perigos toxicológicos. Ao mesmo tempo, os encargos reais e percebidos da regulamentação sobre a indústria provocaram preocupações quanto à praticidade dos métodos de teste de toxicidade e análise de dados. Atualmente, a determinação da carcinogenicidade química depende de testes de vida de pelo menos duas espécies, ambos os sexos, em várias doses, com análise histopatológica cuidadosa de múltiplos órgãos, bem como detecção de alterações pré-neoplásicas em células e órgãos-alvo. Nos Estados Unidos, estima-se que o bioensaio do câncer custe mais de US$ 3 milhões (dólares de 1995).

Mesmo com recursos financeiros ilimitados, o ônus de testar os cerca de 70,000 produtos químicos existentes hoje no mundo excederia os recursos disponíveis de toxicologistas treinados. Séculos seriam necessários para concluir até mesmo uma avaliação de primeiro nível desses produtos químicos (NRC 1984). Em muitos países, as preocupações éticas sobre o uso de animais em testes de toxicidade aumentaram, trazendo pressões adicionais sobre o uso de métodos padrão de teste de toxicidade. A SAR tem sido amplamente utilizada na indústria farmacêutica para identificar moléculas com potencial para uso benéfico no tratamento (Hansch e Zhang 1993). Na política ambiental e de saúde ocupacional, o SAR é usado para prever a dispersão de compostos no ambiente físico-químico e para rastrear novos produtos químicos para avaliação adicional de toxicidade potencial. Sob a Lei de Controle de Substâncias Tóxicas dos EUA (TSCA), a EPA tem usado desde 1979 uma abordagem SAR como uma “primeira triagem” de novos produtos químicos no processo de notificação pré-fabricação (PMN); A Austrália usa uma abordagem semelhante como parte de seu procedimento de notificação de novos produtos químicos (NICNAS). Nos EUA, a análise SAR é uma base importante para determinar se há uma base razoável para concluir que a fabricação, processamento, distribuição, uso ou descarte da substância apresentará um risco não razoável de danos à saúde humana ou ao meio ambiente, conforme exigido pela Seção 5(f) do TSCA. Com base nessa descoberta, a EPA pode exigir testes reais da substância sob a Seção 6 da TSCA.

Justificativa para SAR

A justificativa científica para SAR é baseada na suposição de que a estrutura molecular de um produto químico irá prever aspectos importantes de seu comportamento em sistemas físico-químicos e biológicos (Hansch e Leo 1979).

Processo SAR

O processo de revisão SAR inclui a identificação da estrutura química, incluindo formulações empíricas, bem como o composto puro; identificação de substâncias estruturalmente análogas; pesquisar bancos de dados e literatura para obter informações sobre análogos estruturais; e análise de toxicidade e outros dados sobre análogos estruturais. Em alguns casos raros, informações apenas sobre a estrutura do composto podem ser suficientes para apoiar algumas análises de SAR, com base em mecanismos de toxicidade bem compreendidos. Vários bancos de dados sobre SAR foram compilados, bem como métodos baseados em computador para previsão de estruturas moleculares.

Com esta informação, os seguintes endpoints podem ser estimados com SAR:

  • parâmetros físico-químicos: ponto de ebulição, pressão de vapor, solubilidade em água, coeficiente de partição octanol/água
  • parâmetros de destino biológico/ambiental: biodegradação, sorção do solo, fotodegradação, farmacocinética
  • parâmetros de toxicidade: toxicidade para organismos aquáticos, absorção, toxicidade aguda para mamíferos (teste de limite ou LD50), irritação dérmica, pulmonar e ocular, sensibilização, toxicidade subcrônica, mutagenicidade.

 

Deve-se observar que não existem métodos SAR para parâmetros de saúde importantes como carcinogenicidade, toxicidade para o desenvolvimento, toxicidade reprodutiva, neurotoxicidade, imunotoxicidade ou outros efeitos em órgãos-alvo. Isso se deve a três fatores: a falta de um grande banco de dados para testar as hipóteses de SAR, a falta de conhecimento dos determinantes estruturais da ação tóxica e a multiplicidade de células-alvo e mecanismos envolvidos nesses parâmetros (consulte “The United States abordagem para avaliação de risco de tóxicos reprodutivos e agentes neurotóxicos”). Algumas tentativas limitadas de utilizar o SAR para prever a farmacocinética usando informações sobre coeficientes de partição e solubilidade (Johanson e Naslund 1988). SAR quantitativo mais extenso foi feito para prever o metabolismo dependente de P450 de uma variedade de compostos e a ligação de moléculas semelhantes a dioxina e PCB ao receptor citosólico de “dioxina” (Hansch e Zhang 1993).

A SAR mostrou ter previsibilidade variável para alguns dos parâmetros listados acima, conforme mostrado na tabela 1. Esta tabela apresenta dados de duas comparações de atividade prevista com resultados reais obtidos por medição empírica ou teste de toxicidade. O SAR conduzido por especialistas da EPA dos EUA teve um desempenho pior para prever propriedades físico-químicas do que para prever atividades biológicas, incluindo biodegradação. Para endpoints de toxicidade, o SAR teve o melhor desempenho para prever a mutagenicidade. Ashby e Tennant (1991), em um estudo mais extenso, também encontraram boa previsibilidade de genotoxicidade de curto prazo em sua análise de produtos químicos NTP. Essas descobertas não são surpreendentes, dada a compreensão atual dos mecanismos moleculares de genotoxicidade (consulte “Toxicologia genética”) e o papel da eletrofilicidade na ligação do DNA. Em contraste, a SAR tendeu a subestimar a toxicidade sistêmica e subcrônica em mamíferos e superestimar a toxicidade aguda para organismos aquáticos.

Tabela 1. Comparação de SAR e dados de teste: análises OCDE/NTP

Ponto final Acordo (%) Discordância (%) Sessão
Ponto de ebulição 50 50 30
Pressão de vapor 63 37 113
Solubilidade em água 68 32 133
Coeficiente de partição 61 39 82
Biodegradação 93 7 107
Toxicidade dos peixes 77 22 130
Toxicidade Daphnia 67 33 127
Toxicidade aguda em mamíferos (LD50 ) 80 201 142
Irritação na pele 82 18 144
Irritação ocular 78 22 144
Sensibilização da pele 84 16 144
Toxicidade subcrônica 57 32 143
Mutagenicidade2 88 12 139
Mutagenicidade3 82-944 1-10 301
Carcinogenicidade3 : Bioensaio de dois anos 72-954 - 301

Fonte: Dados da OCDE, comunicação pessoal C. Auer, US EPA. Somente os endpoints para os quais previsões de SAR comparáveis ​​e dados de teste reais estavam disponíveis foram usados ​​nesta análise. Os dados NTP são de Ashby e Tennant 1991.

1 Preocupante foi a falha do SAR em prever a toxicidade aguda em 12% dos produtos químicos testados.

2 Dados da OCDE, com base na concordância do teste Ames com SAR

3 Dados de NTP, baseados em ensaios de genetox em comparação com previsões de SAR para várias classes de “produtos químicos de alerta estrutural”.

4 A concordância varia com a classe; maior concordância foi com compostos amino/nitro aromáticos; mais baixo com estruturas “miscelâneas”.

Para outros endpoints tóxicos, conforme observado acima, o SAR tem utilidade menos demonstrável. As previsões de toxicidade em mamíferos são complicadas pela falta de SAR para toxicocinética de moléculas complexas. No entanto, algumas tentativas foram feitas para propor princípios SAR para parâmetros complexos de toxicidade em mamíferos (por exemplo, ver Bernstein (1984) para uma análise SAR de potenciais tóxicos reprodutivos masculinos). Na maioria dos casos, o banco de dados é muito pequeno para permitir testes rigorosos de previsões baseadas em estrutura.

Neste ponto, pode-se concluir que o SAR pode ser útil principalmente para priorizar o investimento em recursos de teste de toxicidade ou para levantar preocupações iniciais sobre perigo potencial. Somente no caso de mutagenicidade é provável que a análise SAR por si só possa ser utilizada com confiabilidade para informar outras decisões. Para nenhum parâmetro, é provável que o SAR possa fornecer o tipo de informação quantitativa necessária para fins de avaliação de risco, conforme discutido em outra parte deste capítulo e enciclopédia.

 

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