Há muito se reconhece que a resposta de cada pessoa aos produtos químicos ambientais é diferente. A recente explosão em biologia molecular e genética trouxe uma compreensão mais clara sobre a base molecular de tal variabilidade. Os principais determinantes da resposta individual a produtos químicos incluem diferenças importantes entre mais de uma dúzia de superfamílias de enzimas, denominadas coletivamente xenobiótico- (estranho para o corpo) ou metabolizador de drogas enzimas. Embora o papel dessas enzimas tenha sido classicamente considerado como desintoxicação, essas mesmas enzimas também convertem vários compostos inertes em intermediários altamente tóxicos. Recentemente, muitas diferenças sutis e grosseiras nos genes que codificam essas enzimas foram identificadas, o que demonstrou resultar em variações marcantes na atividade enzimática. Agora está claro que cada indivíduo possui um complemento distinto de atividades de enzimas metabolizadoras de xenobióticos; essa diversidade pode ser considerada uma “impressão digital metabólica”. É a interação complexa dessas muitas superfamílias de enzimas diferentes que, em última análise, determina não apenas o destino e o potencial de toxicidade de um produto químico em qualquer indivíduo, mas também a avaliação da exposição. Neste artigo, optamos por usar a superfamília de enzimas do citocromo P450 para ilustrar o notável progresso feito na compreensão da resposta individual a produtos químicos. O desenvolvimento de testes baseados em DNA relativamente simples, projetados para identificar alterações genéticas específicas nessas enzimas, agora está fornecendo previsões mais precisas da resposta individual à exposição a produtos químicos. Esperamos que o resultado seja toxicologia preventiva. Em outras palavras, cada indivíduo pode aprender sobre os produtos químicos aos quais é particularmente sensível, evitando assim toxicidade ou câncer anteriormente imprevisíveis.

Embora geralmente não seja apreciado, os seres humanos são expostos diariamente a uma enxurrada de inúmeros produtos químicos diversos. Muitos desses produtos químicos são altamente tóxicos e são derivados de uma ampla variedade de fontes ambientais e alimentares. A relação entre tais exposições e a saúde humana tem sido, e continua sendo, um dos principais focos dos esforços de pesquisa biomédica em todo o mundo.

Quais são alguns exemplos desse bombardeio químico? Mais de 400 produtos químicos do vinho tinto foram isolados e caracterizados. Estima-se que pelo menos 1,000 produtos químicos sejam produzidos por um cigarro aceso. Existem inúmeros produtos químicos em cosméticos e sabonetes perfumados. Outra fonte importante de exposição a produtos químicos é a agricultura: somente nos Estados Unidos, as fazendas recebem mais de 75,000 produtos químicos a cada ano na forma de pesticidas, herbicidas e agentes fertilizantes; após a absorção por plantas e animais de pasto, bem como peixes em cursos de água próximos, os humanos (no final da cadeia alimentar) ingerem esses produtos químicos. Duas outras fontes de grandes concentrações de substâncias químicas ingeridas pelo corpo incluem (a) drogas ingeridas cronicamente e (b) exposição a substâncias perigosas no local de trabalho durante toda a vida de trabalho.

Já está bem estabelecido que a exposição a produtos químicos pode afetar adversamente muitos aspectos da saúde humana, causando doenças crônicas e o desenvolvimento de muitos tipos de câncer. Mais ou menos na última década, a base molecular de muitas dessas relações começou a ser desvendada. Além disso, surgiu a percepção de que os seres humanos diferem acentuadamente em sua suscetibilidade aos efeitos nocivos da exposição a produtos químicos.

Os esforços atuais para prever a resposta humana à exposição química combinam duas abordagens fundamentais (figura 1): monitorar a extensão da exposição humana por meio de marcadores biológicos (biomarcadores) e prever a resposta provável de um indivíduo a um determinado nível de exposição. Embora ambas as abordagens sejam extremamente importantes, deve-se enfatizar que as duas são distintamente diferentes uma da outra. Este artigo se concentrará no fatores genéticos suscetibilidade individual subjacente a qualquer exposição química específica. Este campo de pesquisa é amplamente denominado ecogenéticaou farmacogenética (ver Kalow 1962 e 1992). Muitos dos avanços recentes na determinação da suscetibilidade individual à toxicidade química evoluíram de uma maior apreciação dos processos pelos quais humanos e outros mamíferos desintoxicam produtos químicos e a notável complexidade dos sistemas enzimáticos envolvidos.

Figura 1. As inter-relações entre avaliação de exposição, diferenças étnicas, idade, dieta, nutrição e avaliação de susceptibilidade genética - todos os quais desempenham um papel no risco individual de toxicidade e câncer

Descreveremos primeiro a variabilidade das respostas tóxicas em humanos. Em seguida, apresentaremos algumas das enzimas responsáveis ​​por essa variação na resposta, devido a diferenças no metabolismo de substâncias químicas estranhas. A seguir, será detalhada a história e a nomenclatura da superfamília do citocromo P450. Cinco polimorfismos humanos do P450, bem como vários polimorfismos não-P450, serão brevemente descritos; estes são responsáveis ​​pelas diferenças humanas na resposta tóxica. Em seguida, discutiremos um exemplo para enfatizar que diferenças genéticas em indivíduos podem influenciar a avaliação da exposição, determinada pelo monitoramento ambiental. Por fim, discutiremos o papel dessas enzimas metabolizadoras de xenobióticos em funções críticas da vida.

Variação na resposta tóxica entre a população humana

Toxicologistas e farmacologistas comumente falam sobre a dose letal média para 50% da população (LD₅₀), a dose média máxima tolerada para 50% da população (MTD₅₀) e a dose efetiva média de um determinado medicamento para 50% da população (ED₅₀). No entanto, como essas doses afetam cada um de nós individualmente? Em outras palavras, um indivíduo altamente sensível pode ser 500 vezes mais afetado ou 500 vezes mais propenso a ser afetado do que o indivíduo mais resistente em uma população; para essas pessoas, o LD₅₀ (e MTD₅₀ e ED₅₀) os valores teriam pouco significado. LD₅₀, MTD₅₀ e ED₅₀ os valores só são relevantes quando se referem à população como um todo.

Figura 2 ilustra uma relação dose-resposta hipotética para uma resposta tóxica por indivíduos em qualquer população. Este diagrama genérico pode representar carcinoma broncogênico em resposta ao número de cigarros fumados, cloracne em função dos níveis de dioxinas no local de trabalho, asma em função das concentrações de ozônio ou aldeído no ar, queimaduras solares em resposta à luz ultravioleta, diminuição do tempo de coagulação como em função da ingestão de aspirina ou desconforto gastrointestinal em resposta ao número de Pimenta jalapeno pimentão consumido. Geralmente, em cada um desses casos, quanto maior a exposição, maior a resposta tóxica. A maioria da população exibirá a média e o desvio padrão da resposta tóxica em função da dose. O “outlier resistente” (canto inferior direito na figura 2) é um indivíduo com menos resposta a doses ou exposições mais altas. Um “outlier sensível” (canto superior esquerdo) é um indivíduo com uma resposta exagerada a uma dose ou exposição relativamente pequena. Esses outliers, com diferenças extremas na resposta em comparação com a maioria dos indivíduos da população, podem representar variantes genéticas importantes que podem ajudar os cientistas na tentativa de entender os mecanismos moleculares subjacentes de uma resposta tóxica. 

Figura 2. Relação genérica entre qualquer resposta tóxica e a dose de qualquer agente ambiental, químico ou físico

Usando esses valores discrepantes em estudos familiares, cientistas de vários laboratórios começaram a avaliar a importância da herança mendeliana para uma determinada resposta tóxica. Posteriormente, pode-se recorrer à biologia molecular e estudos genéticos para identificar o mecanismo subjacente no nível do gene (genótipo) responsável pela doença causada pelo meio ambiente (fenótipo).

Enzimas metabolizadoras de drogas ou xenobióticos

Como o corpo responde à miríade de produtos químicos exógenos aos quais estamos expostos? Os seres humanos e outros mamíferos desenvolveram sistemas enzimáticos metabólicos altamente complexos compreendendo mais de uma dúzia de superfamílias distintas de enzimas. Quase todos os produtos químicos aos quais os seres humanos são expostos serão modificados por essas enzimas, a fim de facilitar a remoção da substância estranha do corpo. Coletivamente, essas enzimas são frequentemente referidas como enzimas metabolizadoras de drogas or enzimas metabolizadoras de xenobióticos. Na verdade, ambos os termos são nomes impróprios. Em primeiro lugar, muitas dessas enzimas metabolizam não apenas drogas, mas centenas de milhares de substâncias químicas ambientais e dietéticas. Em segundo lugar, todas essas enzimas também têm compostos normais do corpo como substratos; nenhuma dessas enzimas metaboliza apenas substâncias químicas estranhas.

Por mais de quatro décadas, os processos metabólicos mediados por essas enzimas foram comumente classificados como reações de Fase I ou Fase II (figura 3). As reações da Fase I (“funcionalização”) geralmente envolvem modificações estruturais relativamente menores do produto químico original por meio de oxidação, redução ou hidrólise para produzir um metabólito mais solúvel em água. Freqüentemente, as reações da Fase I fornecem um “manipulação” para modificação adicional de um composto pelas reações subsequentes da Fase II. As reações da Fase I são primariamente mediadas por uma superfamília de enzimas altamente versáteis, coletivamente denominadas citocromos P450, embora outras superfamílias enzimáticas também possam estar envolvidas (figura 4).

Figura 3. A designação clássica de enzimas metabolizadoras de drogas ou xenobióticos de Fase I e Fase II

Figura 4. Exemplos de enzimas metabolizadoras de drogas

As reações da Fase II envolvem o acoplamento de uma molécula endógena solúvel em água a um produto químico (produto químico original ou metabólito da Fase I) para facilitar a excreção. As reações da fase II são frequentemente denominadas reações de “conjugação” ou “derivatização”. As superfamílias enzimáticas que catalisam as reações da Fase II são geralmente nomeadas de acordo com a porção conjugadora endógena envolvida: por exemplo, acetilação pelas N-acetiltransferases, sulfatação pelas sulfotransferases, conjugação da glutationa pelas glutationas transferases e glucuronidação pelas UDP glucuronosiltransferases (figura 4). . Embora o principal órgão do metabolismo de drogas seja o fígado, os níveis de algumas enzimas metabolizadoras de drogas são bastante elevados no trato gastrointestinal, nas gônadas, nos pulmões, no cérebro e nos rins, e essas enzimas estão indubitavelmente presentes em alguma extensão em todas as células vivas.

Enzimas metabolizadoras de xenobióticos representam uma faca de dois gumes Espadas

À medida que aprendemos mais sobre os processos biológicos e químicos que levam a aberrações da saúde humana, torna-se cada vez mais evidente que as enzimas metabolizadoras de drogas funcionam de maneira ambivalente (figura 3). Na maioria dos casos, os produtos químicos lipossolúveis são convertidos em metabólitos solúveis em água excretados mais facilmente. No entanto, é claro que muitas vezes as mesmas enzimas são capazes de transformar outros produtos químicos inertes em moléculas altamente reativas. Esses intermediários podem então interagir com macromoléculas celulares, como proteínas e DNA. Assim, para cada produto químico ao qual os seres humanos são expostos, existe o potencial para as vias concorrentes de ativação metabólica e desintoxicação.

Breve Revisão de Genética

Na genética humana, cada gene (loci) está localizado em um dos 23 pares de cromossomos. Os dois alelos (um presente em cada cromossomo do par) podem ser iguais ou diferentes entre si. Por exemplo, o B e b alelos, em que B (olhos castanhos) é dominante sobre b (olhos azuis): indivíduos do fenótipo de olhos castanhos podem ter tanto o BB or Bb genótipos, enquanto os indivíduos do fenótipo de olhos azuis só podem ter o bb genótipo.

A polimorfismo é definido como dois ou mais fenótipos herdados de forma estável (características) - derivados do(s) mesmo(s) gene(s) - que são mantidos na população, muitas vezes por razões não necessariamente óbvias. Para que um gene seja polimórfico, o produto gênico não deve ser essencial para o desenvolvimento, vigor reprodutivo ou outros processos críticos da vida. De fato, um “polimorfismo balanceado”, em que o heterozigoto tem uma vantagem de sobrevivência distinta sobre qualquer um dos homozigotos (por exemplo, resistência à malária e o alelo da hemoglobina falciforme) é uma explicação comum para a manutenção de um alelo na população em níveis elevados inexplicáveis. frequências (ver González e Nebert 1990).

Polimorfismos humanos de enzimas metabolizadoras de xenobióticos

As diferenças genéticas no metabolismo de várias drogas e produtos químicos ambientais são conhecidas há mais de quatro décadas (Kalow 1962 e 1992). Essas diferenças são freqüentemente chamadas de farmacogenético ou, mais amplamente, polimorfismos ecogenéticos. Esses polimorfismos representam alelos variantes que ocorrem em uma frequência relativamente alta na população e geralmente estão associados a aberrações na expressão ou função da enzima. Historicamente, os polimorfismos geralmente eram identificados após respostas inesperadas a agentes terapêuticos. Mais recentemente, a tecnologia do DNA recombinante permitiu aos cientistas identificar as alterações precisas nos genes responsáveis ​​por alguns desses polimorfismos. Os polimorfismos já foram caracterizados em muitas enzimas metabolizadoras de drogas, incluindo as enzimas de Fase I e Fase II. À medida que mais e mais polimorfismos são identificados, torna-se cada vez mais aparente que cada indivíduo pode possuir um complemento distinto de enzimas metabolizadoras de drogas. Essa diversidade pode ser descrita como uma “impressão digital metabólica”. É a complexa interação das várias superfamílias de enzimas metabolizadoras de drogas dentro de qualquer indivíduo que determinará sua resposta particular a uma determinada substância química (Kalow 1962 e 1992; Nebert 1988; Gonzalez e Nebert 1990; Nebert e Weber 1990).

Expressando Enzimas Metabolizadoras de Xenobióticos Humanos em Células Cultura

Como podemos desenvolver melhores preditores de respostas tóxicas humanas a produtos químicos? Avanços na definição da multiplicidade de enzimas metabolizadoras de drogas devem ser acompanhados por um conhecimento preciso de quais enzimas determinam o destino metabólico de substâncias químicas individuais. Dados obtidos de estudos de roedores de laboratório certamente forneceram informações úteis. No entanto, diferenças significativas entre espécies em enzimas metabolizadoras de xenobióticos exigem cautela ao extrapolar dados para populações humanas. Para superar essa dificuldade, muitos laboratórios desenvolveram sistemas nos quais várias linhagens de células em cultura podem ser modificadas para produzir enzimas humanas funcionais que sejam estáveis ​​e em altas concentrações (Gonzalez, Crespi e Gelboin 1991). A produção bem-sucedida de enzimas humanas foi alcançada em uma variedade de diversas linhas celulares de fontes, incluindo bactérias, leveduras, insetos e mamíferos.

Para definir o metabolismo dos produtos químicos com ainda mais precisão, várias enzimas também foram produzidos com sucesso em uma única linha celular (Gonzalez, Crespi e Gelboin 1991). Essas linhas celulares fornecem informações valiosas sobre as enzimas precisas envolvidas no processamento metabólico de qualquer composto e prováveis ​​metabólitos tóxicos. Se essas informações puderem ser combinadas com o conhecimento sobre a presença e o nível de uma enzima nos tecidos humanos, esses dados devem fornecer preditores valiosos de resposta.

Cytochrome P450

História e nomenclatura

A superfamília do citocromo P450 é uma das superfamílias de enzimas metabolizadoras de drogas mais estudadas, tendo uma grande variabilidade individual em resposta a produtos químicos. Citocromo P450 é um termo genérico conveniente usado para descrever uma grande superfamília de enzimas essenciais no metabolismo de inúmeros substratos endógenos e exógenos. O termo citocromo P450 foi cunhado pela primeira vez em 1962 para descrever um desconhecido pigmento em células que, quando reduzidas e ligadas com monóxido de carbono, produziram um pico de absorção característico em 450 nm. Desde o início da década de 1980, a tecnologia de clonagem de cDNA resultou em insights notáveis ​​sobre a multiplicidade de enzimas do citocromo P450. Até o momento, mais de 400 genes distintos do citocromo P450 foram identificados em animais, plantas, bactérias e leveduras. Estima-se que qualquer espécie de mamífero, como os humanos, pode possuir 60 ou mais genes P450 distintos (Nebert e Nelson 1991). A multiplicidade dos genes P450 exigiu o desenvolvimento de um sistema de nomenclatura padronizado (Nebert et al. 1987; Nelson et al. 1993). Proposto pela primeira vez em 1987 e atualizado semestralmente, o sistema de nomenclatura é baseado na evolução divergente das comparações de sequências de aminoácidos entre as proteínas P450. Os genes P450 são divididos em famílias e subfamílias: as enzimas dentro de uma família exibem mais de 40% de similaridade de aminoácidos, e aquelas dentro da mesma subfamília exibem 55% de similaridade. Os genes P450 são nomeados com o símbolo da raiz CYP seguido por um numeral arábico designando a família P450, uma letra denotando a subfamília, e outro numeral arábico designando o gene individual (Nelson et al. 1993; Nebert et al. 1991). Desta forma, CYP1A1 representa o gene P450 1 na família 1 e subfamília A.

Em fevereiro de 1995, havia 403 CYP genes no banco de dados, composto por 59 famílias e 105 subfamílias. Estes incluem oito famílias eucarióticas inferiores, 15 famílias de plantas e 19 famílias de bactérias. As 15 famílias de genes P450 humanos compreendem 26 subfamílias, 22 das quais foram mapeadas para localizações cromossômicas na maior parte do genoma. Algumas sequências são claramente ortólogas em muitas espécies - por exemplo, apenas uma CYP17 (esteróide 17α-hidroxilase) gene foi encontrado em todos os vertebrados examinados até o momento; outras sequências dentro de uma subfamília são altamente duplicadas, impossibilitando a identificação de pares ortólogos (por exemplo, o CYP2C subfamília). Curiosamente, humanos e leveduras compartilham um gene ortólogo no CYP51 família. Numerosas revisões abrangentes estão disponíveis para leitores que buscam mais informações sobre a superfamília P450 (Nelson et al. 1993; Nebert et al. 1991; Nebert e McKinnon 1994; Guengerich 1993; Gonzalez 1992).

O sucesso do sistema de nomenclatura P450 resultou no desenvolvimento de sistemas terminológicos semelhantes para UDP glucuronosiltransferases (Burchell et al. 1991) e monooxigenases contendo flavina (Lawton et al. 1994). Sistemas de nomenclatura semelhantes baseados em evolução divergente também estão em desenvolvimento para várias outras superfamílias de enzimas metabolizadoras de drogas (por exemplo, sulfotransferases, epóxido hidrolases e aldeído desidrogenases).

Recentemente, dividimos a superfamília do gene P450 de mamíferos em três grupos (Nebert e McKinnon, 1994) — os envolvidos principalmente com o metabolismo químico estranho, os envolvidos na síntese de vários hormônios esteróides e os que participam de outras importantes funções endógenas. São as enzimas P450 metabolizadoras de xenobióticos que assumem a maior importância para a previsão de toxicidade.

Enzimas P450 metabolizadoras de xenobióticos

Enzimas P450 envolvidas no metabolismo de compostos estranhos e drogas são quase sempre encontradas dentro de famílias CYP1, CYP2, CYP3 e CYP4. Essas enzimas P450 catalisam uma ampla variedade de reações metabólicas, com uma única P450 frequentemente capaz de metabolizar muitos compostos diferentes. Além disso, várias enzimas P450 podem metabolizar um único composto em locais diferentes. Além disso, um composto pode ser metabolizado no mesmo local único por vários P450s, embora em taxas variáveis.

Uma propriedade muito importante das enzimas P450 metabolizadoras de drogas é que muitos desses genes são induzidos pelas próprias substâncias que servem como seus substratos. Por outro lado, outros genes P450 são induzidos por não substratos. Este fenômeno de indução enzimática é a base de muitas interações medicamentosas de importância terapêutica.

Embora presentes em muitos tecidos, essas enzimas P450 específicas são encontradas em níveis relativamente altos no fígado, o principal local de metabolismo de drogas. Algumas das enzimas P450 metabolizadoras de xenobióticos exibem atividade em relação a certos substratos endógenos (por exemplo, ácido araquidônico). No entanto, acredita-se geralmente que a maioria dessas enzimas P450 metabolizadoras de xenobióticos não desempenham papéis fisiológicos importantes - embora isso ainda não tenha sido estabelecido experimentalmente. A interrupção homozigótica seletiva, ou "knock-out", de genes P450 metabolizadores de xenobióticos individuais por meio de metodologias de direcionamento de genes em camundongos provavelmente fornecerá informações inequívocas em breve com relação aos papéis fisiológicos dos P450s metabolizadores de xenobióticos (para uma revisão de direcionamento de genes, ver Capecchi 1994).

Em contraste com as famílias P450 que codificam enzimas envolvidas principalmente em processos fisiológicos, as famílias que codificam enzimas P450 metabolizadoras de xenobióticos exibem marcada especificidade de espécie e frequentemente contêm muitos genes ativos por subfamília (Nelson et al. 1993; Nebert et al. 1991). Dada a aparente falta de substratos fisiológicos, é possível que as enzimas P450 nas famílias CYP1, CYP2, CYP3 e CYP4 que surgiram nas últimas centenas de milhões de anos evoluíram como um meio de desintoxicar substâncias químicas estranhas encontradas no ambiente e na dieta. Claramente, a evolução dos P450 metabolizadores de xenobióticos teria ocorrido em um período de tempo que precede em muito a síntese da maioria dos produtos químicos sintéticos aos quais os humanos estão agora expostos. Os genes nessas quatro famílias de genes podem ter evoluído e divergido em animais devido à sua exposição a metabólitos de plantas durante os últimos 1.2 bilhão de anos – um processo denominado descritivamente “guerra animal-planta” (Gonzalez e Nebert 1990). A guerra animal-planta é o fenômeno no qual as plantas desenvolveram novos produtos químicos (fitoalexinas) como mecanismo de defesa para evitar a ingestão por animais, e os animais, por sua vez, responderam desenvolvendo novos genes P450 para acomodar os substratos diversificados. Fornecendo mais ímpeto a esta proposta estão os exemplos recentemente descritos de guerra química planta-inseto e planta-fungo envolvendo desintoxicação de substratos tóxicos por P450 (Nebert 1994).

O que se segue é uma breve introdução a vários dos polimorfismos da enzima P450 metabolizadora de xenobióticos humanos, nos quais se acredita que os determinantes genéticos da resposta tóxica sejam de grande importância. Até recentemente, os polimorfismos do P450 eram geralmente sugeridos por variações inesperadas na resposta do paciente aos agentes terapêuticos administrados. Vários polimorfismos P450 são de fato nomeados de acordo com a droga com a qual o polimorfismo foi identificado pela primeira vez. Mais recentemente, os esforços de pesquisa se concentraram na identificação das enzimas P450 precisas envolvidas no metabolismo de produtos químicos para os quais a variação é observada e na caracterização precisa dos genes P450 envolvidos. Conforme descrito anteriormente, a atividade mensurável de uma enzima P450 em relação a um produto químico modelo pode ser chamada de fenótipo. As diferenças alélicas em um gene P450 para cada indivíduo são denominadas genótipo P450. À medida que mais e mais escrutínio é aplicado à análise dos genes P450, a base molecular precisa da variação fenotípica previamente documentada está se tornando mais clara.

A subfamília CYP1A

A CYP1A A subfamília compreende duas enzimas em humanos e todos os outros mamíferos: estas são designadas CYP1A1 e CYP1A2 sob a nomenclatura padrão P450. Essas enzimas são de considerável interesse, pois estão envolvidas na ativação metabólica de muitos procarcinógenos e também são induzidas por vários compostos de interesse toxicológico, incluindo a dioxina. Por exemplo, CYP1A1 ativa metabolicamente muitos compostos encontrados na fumaça do cigarro. O CYP1A2 ativa metabolicamente muitas arilaminas - associadas ao câncer de bexiga urinária - encontradas na indústria de corantes químicos. O CYP1A2 também ativa metabolicamente a 4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanona (NNK), uma nitrosamina derivada do tabaco. CYP1A1 e CYP1A2 também são encontrados em níveis mais elevados nos pulmões de fumantes de cigarro, devido à indução por hidrocarbonetos policíclicos presentes na fumaça. Os níveis de atividade de CYP1A1 e CYP1A2 são, portanto, considerados determinantes importantes da resposta individual a muitos produtos químicos potencialmente tóxicos.

Interesse toxicológico no CYP1A A subfamília foi bastante intensificada por um relatório de 1973 correlacionando o nível de indutibilidade do CYP1A1 em fumantes com suscetibilidade individual ao câncer de pulmão (Kellermann, Shaw e Luyten-Kellermann 1973). A base molecular da indução de CYP1A1 e CYP1A2 tem sido o foco principal de vários laboratórios. O processo de indução é mediado por uma proteína denominada receptor Ah, ao qual se ligam as dioxinas e os produtos químicos estruturalmente relacionados. O nome Ah é derivado do aril hnatureza de hidrocarbonetos de muitos indutores de CYP1A. Curiosamente, as diferenças no gene que codifica o receptor Ah entre as cepas de camundongos resultam em diferenças marcantes na resposta química e na toxicidade. Um polimorfismo no gene do receptor Ah também parece ocorrer em humanos: aproximadamente um décimo da população exibe alta indução de CYP1A1 e pode estar em maior risco do que os outros nove décimos da população para o desenvolvimento de certos tipos de câncer induzidos quimicamente. O papel do receptor Ah no controle de enzimas no CYP1A subfamília, e seu papel como determinante da resposta humana à exposição química, tem sido objeto de várias revisões recentes (Nebert, Petersen e Puga 1991; Nebert, Puga e Vasiliou 1993).

Existem outros polimorfismos que podem controlar o nível de proteínas CYP1A em uma célula? Um polimorfismo no CYP1A1 gene também foi identificado, e isso parece influenciar o risco de câncer de pulmão entre os fumantes de cigarros japoneses, embora esse mesmo polimorfismo não pareça influenciar o risco em outros grupos étnicos (Nebert e McKinnon 1994).

CYP2C19

Variações na taxa na qual os indivíduos metabolizam a droga anticonvulsivante (S)-mefenitoína foram bem documentadas por muitos anos (Guengerich 1989). Entre 2% e 5% dos caucasianos e até 25% dos asiáticos são deficientes nesta atividade e podem estar em maior risco de toxicidade da droga. Há muito se sabe que esse defeito enzimático envolve um membro do organismo humano CYP2C subfamília, mas a base molecular precisa dessa deficiência tem sido objeto de considerável controvérsia. A principal razão para esta dificuldade foram os seis ou mais genes no ser humano CYP2C subfamília. Foi recentemente demonstrado, no entanto, que uma mutação de base única no CYP2C19 gene é a causa primária desta deficiência (Goldstein e de Morais 1994). Um teste simples de DNA, baseado na reação em cadeia da polimerase (PCR), também foi desenvolvido para identificar essa mutação rapidamente em populações humanas (Goldstein e de Morais 1994).

CYP2D6

Talvez a variação mais extensivamente caracterizada em um gene P450 seja aquela que envolve o CYP2D6 gene. Mais de uma dúzia de exemplos de mutações, rearranjos e deleções afetando esse gene foram descritos (Meyer 1994). Esse polimorfismo foi sugerido pela primeira vez há 20 anos pela variabilidade clínica na resposta dos pacientes ao agente anti-hipertensivo detrissoquina. Alterações no CYP2D6 gene que dá origem à atividade enzimática alterada são, portanto, denominados coletivamente de polimorfismo de debrisoquina.

Antes do advento dos estudos baseados em DNA, os indivíduos eram classificados como metabolizadores fracos ou extensos (PMs, EMs) de detritosquina com base nas concentrações de metabólitos em amostras de urina. Agora está claro que as alterações na CYP2D6 gene pode resultar em indivíduos exibindo não apenas metabolismo pobre ou extenso da debrisoquina, mas também metabolismo ultrarrápido. A maioria das alterações no CYP2D6 gene estão associados com deficiência parcial ou total da função enzimática; no entanto, recentemente foram descritos indivíduos em duas famílias que possuem múltiplas cópias funcionais do CYP2D6 gene, dando origem ao metabolismo ultrarrápido de substratos CYP2D6 (Meyer 1994). Esta observação notável fornece novos insights sobre o amplo espectro da atividade do CYP2D6 previamente observado em estudos populacionais. Alterações na função do CYP2D6 são de particular importância, dados os mais de 30 medicamentos comumente prescritos metabolizados por esta enzima. A função do CYP2D6 de um indivíduo é, portanto, um determinante importante da resposta terapêutica e tóxica à terapia administrada. De fato, recentemente foi argumentado que a consideração do status de CYP2D6 de um paciente é necessária para o uso seguro de drogas psiquiátricas e cardiovasculares.

O papel do CYP2D6 o polimorfismo como um determinante da suscetibilidade individual a doenças humanas, como câncer de pulmão e doença de Parkinson, também tem sido objeto de intenso estudo (Nebert e McKinnon 1994; Meyer 1994). Embora as conclusões sejam difíceis de definir dada a natureza diversa dos protocolos de estudo utilizados, a maioria dos estudos parece indicar uma associação entre metabolizadores extensos de detritosquina (fenótipo EM) e câncer de pulmão. As razões para tal associação ainda não estão claras. No entanto, foi demonstrado que a enzima CYP2D6 metaboliza a NNK, uma nitrosamina derivada do tabaco.

À medida que os ensaios baseados em DNA melhoram, permitindo uma avaliação ainda mais precisa do status do CYP2D6, espera-se que a relação precisa do CYP2D6 com o risco de doenças seja esclarecida. Enquanto o metabolizador extenso pode estar associado à suscetibilidade ao câncer de pulmão, o metabolizador fraco (fenótipo PM) parece estar associado à doença de Parkinson de causa desconhecida. Embora esses estudos também sejam difíceis de comparar, parece que os indivíduos com PM com uma capacidade diminuída de metabolizar substratos do CYP2D6 (por exemplo, debrisoquina) têm um risco 2 a 2.5 vezes maior de desenvolver a doença de Parkinson.

CYP2E1

A CYP2E1 O gene codifica uma enzima que metaboliza muitos produtos químicos, incluindo drogas e muitos carcinógenos de baixo peso molecular. Essa enzima também é de interesse porque é altamente induzível pelo álcool e pode desempenhar um papel na lesão hepática induzida por produtos químicos como clorofórmio, cloreto de vinila e tetracloreto de carbono. A enzima é encontrada principalmente no fígado, e o nível da enzima varia acentuadamente entre os indivíduos. Exame minucioso do CYP2E1 gene resultou na identificação de vários polimorfismos (Nebert e McKinnon 1994). Foi relatada uma relação entre a presença de certas variações estruturais no CYP2E1 gene e aparente risco reduzido de câncer de pulmão em alguns estudos; no entanto, existem claras diferenças interétnicas que requerem esclarecimentos sobre essa possível relação.

A subfamília CYP3A

Em humanos, quatro enzimas foram identificadas como membros do CYP3A subfamília devido à sua semelhança na sequência de aminoácidos. As enzimas CYP3A metabolizam muitos medicamentos comumente prescritos, como eritromicina e ciclosporina. O contaminante alimentar cancerígeno aflatoxina B₁ também é um substrato CYP3A. Um membro do ser humano CYP3A subfamília, designada CYP3A4, é o principal P450 no fígado humano, além de estar presente no trato gastrointestinal. Como acontece com muitas outras enzimas P450, o nível de CYP3A4 é altamente variável entre os indivíduos. Uma segunda enzima, designada CYP3A5, é encontrada em apenas aproximadamente 25% dos fígados; a base genética desse achado não foi elucidada. A importância da variabilidade CYP3A4 ou CYP3A5 como um fator nos determinantes genéticos da resposta tóxica ainda não foi estabelecida (Nebert e McKinnon 1994).

Polimorfismos Não-P450

Numerosos polimorfismos também existem dentro de outras superfamílias de enzimas metabolizadoras de xenobióticos (por exemplo, glutationa transferases, UDP glucuronosiltransferases, para-oxonases, desidrogenases, N-acetiltransferases e monooxigenases contendo flavina). Como a toxicidade final de qualquer intermediário gerado pelo P450 depende da eficiência das reações subsequentes de desintoxicação da Fase II, o papel combinado de múltiplos polimorfismos enzimáticos é importante na determinação da suscetibilidade a doenças induzidas quimicamente. O equilíbrio metabólico entre as reações de Fase I e Fase II (figura 3) é, portanto, provavelmente um fator importante em doenças humanas induzidas quimicamente e determinantes genéticos de resposta tóxica.

O polimorfismo do gene GSTM1

Um exemplo bem estudado de um polimorfismo em uma enzima de Fase II é o que envolve um membro da superfamília da enzima glutationa S-transferase, designada GST mu ou GSTM1. Esta enzima particular é de considerável interesse toxicológico porque parece estar envolvida na desintoxicação subsequente de metabólitos tóxicos produzidos a partir de produtos químicos na fumaça do cigarro pela enzima CYP1A1. O polimorfismo identificado neste gene da glutationa transferase envolve uma total ausência de enzima funcional em até metade de todos os caucasianos estudados. Essa falta de uma enzima de fase II parece estar associada ao aumento da suscetibilidade ao câncer de pulmão. Ao agrupar os indivíduos com base em ambas as variantes CYP1A1 genes e a deleção ou presença de um GSTM1 gene, foi demonstrado que o risco de desenvolver câncer de pulmão induzido pelo fumo varia significativamente (Kawajiri, Watanabe e Hayashi 1994). Em particular, indivíduos exibindo um raro CYP1A1 alteração genética, em combinação com a ausência do GSTM1 gene, apresentavam maior risco (até nove vezes) de desenvolver câncer de pulmão quando expostos a um nível relativamente baixo de fumaça de cigarro. Curiosamente, parece haver diferenças interétnicas no significado de genes variantes que necessitam de mais estudos para elucidar o papel preciso de tais alterações na suscetibilidade à doença (Kalow 1962; Nebert e McKinnon 1994; Kawajiri, Watanabe e Hayashi 1994).

Efeito sinérgico de dois ou mais polimorfismos na toxicidade resposta

Uma resposta tóxica a um agente ambiental pode ser muito exagerada pela combinação de dois defeitos farmacogenéticos no mesmo indivíduo, por exemplo, os efeitos combinados do polimorfismo N-acetiltransferase (NAT2) e do polimorfismo glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD). .

A exposição ocupacional a arilaminas constitui um grave risco de câncer de bexiga. Desde os elegantes estudos de Cartwright em 1954, tornou-se claro que o status do N-acetilador é um determinante do câncer de bexiga induzido por corante azo. Existe uma correlação altamente significativa entre o fenótipo do acetilador lento e a ocorrência de câncer de bexiga, bem como o grau de invasividade desse câncer na parede da bexiga. Pelo contrário, existe uma associação significativa entre o fenótipo de acetilação rápida e a incidência de carcinoma colorretal. A N-acetiltransferase (NAT1, NAT2) os genes foram clonados e sequenciados, e os ensaios baseados em DNA agora são capazes de detectar mais de uma dúzia de variantes alélicas que representam o fenótipo de acetilação lenta. o NAT2 O gene é polimórfico e responsável pela maior parte da variabilidade na resposta tóxica a produtos químicos ambientais (Weber 1987; Grant 1993).

A glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD) é uma enzima crítica na geração e manutenção de NADPH. A atividade G6PD baixa ou ausente pode levar a hemólise grave induzida por drogas ou xenobióticos, devido à ausência de níveis normais de glutationa reduzida (GSH) nos glóbulos vermelhos. A deficiência de G6PD afeta pelo menos 300 milhões de pessoas em todo o mundo. Mais de 10% dos homens afro-americanos exibem o fenótipo menos grave, enquanto certas comunidades da Sardenha exibem o “tipo mediterrâneo” mais grave em frequências tão altas quanto uma em cada três pessoas. o G6PD gene foi clonado e localizado no cromossomo X, e numerosas mutações pontuais diversas são responsáveis ​​pelo grande grau de heterogeneidade fenotípica observada em indivíduos deficientes em G6PD (Beutler 1992).

Descobriu-se que a tiozalsulfona, uma droga arilamina sulfa, causa uma distribuição bimodal de anemia hemolítica na população tratada. Quando tratados com certos medicamentos, os indivíduos com a combinação de deficiência de G6PD mais o fenótipo de acetilador lento são mais afetados do que aqueles com deficiência de G6PD isolada ou fenótipo de acetilação lenta isoladamente. Os acetiladores lentos deficientes em G6PD são pelo menos 40 vezes mais suscetíveis do que os acetiladores rápidos de G6PD normais à hemólise induzida por tiozalsulfona.

Efeito de polimorfismos genéticos na avaliação da exposição

A avaliação da exposição e o biomonitoramento (figura 1) também requerem informações sobre a composição genética de cada indivíduo. Dada a exposição idêntica a um produto químico perigoso, o nível de adutos de hemoglobina (ou outros biomarcadores) pode variar em duas ou três ordens de magnitude entre os indivíduos, dependendo da impressão digital metabólica de cada pessoa.

A mesma farmacogenética combinada foi estudada em trabalhadores de fábricas de produtos químicos na Alemanha (tabela 1). Os adutos de hemoglobina entre trabalhadores expostos a anilina e acetanilida são de longe os mais altos em acetiladores lentos deficientes em G6PD, em comparação com os outros possíveis fenótipos farmacogenéticos combinados. Este estudo tem implicações importantes para a avaliação da exposição. Esses dados demonstram que, embora dois indivíduos possam estar expostos ao mesmo nível ambiental de produtos químicos perigosos no local de trabalho, a quantidade de exposição (através de biomarcadores como adutos de hemoglobina) pode ser estimada em duas ou mais ordens de magnitude menor, devido à predisposição genética subjacente do indivíduo. Da mesma forma, o risco resultante de um efeito adverso à saúde pode variar em duas ou mais ordens de grandeza.

Tabela 1: Adutos de hemoglobina em trabalhadores expostos a anilina e acetanilida

Fonte: Adaptado de Lewalter e Korallus 1985.

Diferenças genéticas na ligação, bem como no metabolismo

Deve-se enfatizar que o mesmo caso feito aqui para o metabolismo também pode ser feito para a ligação. Diferenças hereditárias na ligação de agentes ambientais afetarão muito a resposta tóxica. Por exemplo, diferenças no mouse MDL gene pode afetar profundamente a sensibilidade individual à necrose testicular induzida por cádmio (Taylor, Heiniger e Meier 1973). Diferenças na afinidade de ligação do receptor Ah provavelmente afetam a toxicidade induzida por dioxinas e o câncer (Nebert, Petersen e Puga 1991; Nebert, Puga e Vasiliou 1993).

A Figura 5 resume o papel do metabolismo e da ligação na toxicidade e no câncer. Os agentes tóxicos, como existem no ambiente ou após o metabolismo ou ligação, provocam seus efeitos por uma via genotóxica (na qual ocorre dano ao DNA) ou uma via não genotóxica (na qual o dano ao DNA e a mutagênese não precisam ocorrer). Curiosamente, recentemente ficou claro que os agentes “clássicos” que danificam o DNA podem operar por meio de uma via de transdução de sinal não genotóxica dependente de glutationa reduzida (GSH), que é iniciada na superfície celular ou próximo a ela na ausência de DNA e fora do núcleo celular. (Devary et al. 1993). As diferenças genéticas no metabolismo e na ligação permanecem, no entanto, como os principais determinantes no controle de diferentes respostas tóxicas individuais.

Figura 5. Os meios gerais pelos quais a toxicidade ocorre

Papel da Função Celular da Enzima Metabolizadora de Drogas

A variação de base genética na função da enzima metabolizadora de drogas é de grande importância na determinação da resposta individual a produtos químicos. Essas enzimas são essenciais para determinar o destino e o curso do tempo de uma substância química estranha após a exposição.

Conforme ilustrado na figura 5, a importância das enzimas metabolizadoras de drogas na suscetibilidade individual à exposição química pode, de fato, apresentar uma questão muito mais complexa do que é evidente a partir desta simples discussão do metabolismo xenobiótico. Em outras palavras, durante as últimas duas décadas, os mecanismos genotóxicos (medidas de adutos de DNA e adutos de proteínas) têm sido muito enfatizados. No entanto, e se os mecanismos não genotóxicos forem pelo menos tão importantes quanto os mecanismos genotóxicos em causar respostas tóxicas?

Como mencionado anteriormente, os papéis fisiológicos de muitas enzimas metabolizadoras de drogas envolvidas no metabolismo xenobiótico não foram definidos com precisão. Nebert (1994) propôs que, devido à sua presença neste planeta por mais de 3.5 bilhões de anos, as enzimas metabolizadoras de drogas foram originalmente (e agora ainda são principalmente) responsáveis ​​por regular os níveis celulares de muitos ligantes não peptídicos importantes na ativação transcricional. de genes que afetam o crescimento, diferenciação, apoptose, homeostase e funções neuroendócrinas. Além disso, a toxicidade da maioria, se não de todos, os agentes ambientais ocorre por meio de Agonista or antagonista ação nessas vias de transdução de sinal (Nebert 1994). Com base nessa hipótese, a variabilidade genética nas enzimas metabolizadoras de drogas pode ter efeitos bastante dramáticos em muitos processos bioquímicos críticos dentro da célula, levando assim a diferenças importantes na resposta tóxica. É realmente possível que tal cenário também esteja por trás de muitas reações adversas idiossincráticas encontradas em pacientes que usam medicamentos comumente prescritos.

Conclusões

A última década assistiu a um progresso notável em nossa compreensão da base genética da resposta diferencial a produtos químicos em drogas, alimentos e poluentes ambientais. As enzimas metabolizadoras de drogas têm uma profunda influência na forma como os seres humanos respondem aos produtos químicos. À medida que nossa consciência da multiplicidade de enzimas metabolizadoras de drogas continua a evoluir, somos cada vez mais capazes de fazer avaliações aprimoradas do risco tóxico de muitas drogas e produtos químicos ambientais. Isso talvez seja mais claramente ilustrado no caso da enzima CYP2D6 citocromo P450. Usando testes relativamente simples baseados em DNA, é possível prever a resposta provável de qualquer droga predominantemente metabolizada por essa enzima; essa previsão garantirá o uso mais seguro de medicamentos valiosos, mas potencialmente tóxicos.

Sem dúvida, o futuro verá uma explosão na identificação de outros polimorfismos (fenótipos) envolvendo enzimas metabolizadoras de drogas. Essas informações serão acompanhadas por testes baseados em DNA minimamente invasivos para identificar genótipos em populações humanas.

Tais estudos devem ser particularmente informativos na avaliação do papel dos produtos químicos nas muitas doenças ambientais de origem atualmente desconhecida. A consideração de múltiplos polimorfismos de enzimas metabolizadoras de drogas, em combinação (por exemplo, tabela 1), provavelmente também representa uma área de pesquisa particularmente fértil. Esses estudos esclarecerão o papel dos produtos químicos na causa dos cânceres. Coletivamente, essas informações devem permitir a formulação de conselhos cada vez mais individualizados sobre como evitar produtos químicos que possam ser uma preocupação individual. Este é o campo da toxicologia preventiva. Tal conselho, sem dúvida, ajudará muito todos os indivíduos a lidar com a carga química cada vez maior a que estamos expostos.

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