Токсикология играет важную роль в разработке правил и другой политики в области гигиены труда. В целях предотвращения производственных травм и профессиональных заболеваний решения все чаще основываются на информации, полученной до или в отсутствие видов воздействия на человека, которая может дать окончательную информацию о риске, например эпидемиологические исследования. Кроме того, токсикологические исследования, описанные в этой главе, могут предоставить точную информацию о дозе и реакции в контролируемых условиях лабораторных исследований; эту информацию часто трудно получить в неконтролируемых условиях профессионального облучения. Однако эта информация должна быть тщательно оценена, чтобы оценить вероятность побочных эффектов у людей, характер этих побочных эффектов и количественную взаимосвязь между воздействием и эффектами.

С 1980-х годов во многих странах значительное внимание уделялось разработке объективных методов использования токсикологической информации при принятии регулирующих решений. Формальные методы, часто называемые оценка риска, были предложены и использованы в этих странах как государственными, так и неправительственными организациями. Оценка риска определяется по-разному; в основном это оценочный процесс, который включает токсикологию, эпидемиологию и информацию о воздействии для выявления и оценки вероятности побочных эффектов, связанных с воздействием опасных веществ или условий. Оценка риска может быть качественной по своему характеру, указывающей на характер неблагоприятного воздействия и общую оценку вероятности, или может быть количественной, с оценками числа затронутых лиц при определенных уровнях воздействия. Во многих системах регулирования оценка риска проводится в четыре этапа: идентификация опасности, описание характера токсического действия; оценка доза-реакция, полуколичественный или количественный анализ взаимосвязи между воздействием (или дозой) и тяжестью или вероятностью токсического эффекта; оценка воздействия, оценка информации о диапазоне воздействий, которые могут иметь место для населения в целом или для подгрупп внутри населения; характеристика риска, компиляция всей вышеуказанной информации в выражение величины риска, ожидаемого при определенных условиях воздействия (см. NRC 1983 г. изложение этих принципов).

В этом разделе в качестве иллюстрации представлены три подхода к оценке риска. Невозможно предоставить исчерпывающий перечень методов оценки риска, используемых во всем мире, и этот выбор не следует воспринимать как предписывающий. Следует отметить, что существуют тенденции к гармонизации методов оценки рисков, отчасти в ответ на положения недавних соглашений ГАТТ. В настоящее время осуществляются два процесса международной гармонизации методов оценки риска в рамках Международной программы химической безопасности (МПХБ) и Организации экономического сотрудничества и развития (ОЭСР). Эти организации также хранят текущую информацию о национальных подходах к оценке рисков.

Назад

Анализ зависимости структура-активность (SAR) представляет собой использование информации о молекулярной структуре химических веществ для прогнозирования важных характеристик, связанных с стойкостью, распределением, поглощением и абсорбцией, а также токсичностью. SAR — это альтернативный метод выявления потенциально опасных химических веществ, который обещает помочь промышленности и правительствам в определении приоритетности веществ для дальнейшей оценки или для принятия решений на ранней стадии в отношении новых химических веществ. Токсикология становится все более дорогостоящим и ресурсоемким направлением. Возросшие опасения по поводу того, что химические вещества могут вызывать неблагоприятные последствия для подвергающихся воздействию людей, побудили регулирующие органы и органы здравоохранения расширить диапазон и чувствительность тестов для выявления токсикологической опасности. В то же время реальное и предполагаемое бремя регулирования, ложащееся на промышленность, вызвало обеспокоенность по поводу практичности методов тестирования токсичности и анализа данных. В настоящее время определение химической канцерогенности зависит от прижизненного тестирования как минимум двух видов животных обоего пола в нескольких дозах с тщательным гистопатологическим анализом нескольких органов, а также выявлением предопухолевых изменений в клетках и органах-мишенях. В Соединенных Штатах стоимость биоанализа рака оценивается более чем в 3 миллиона долларов (в долларах 1995 года).

Даже при неограниченных финансовых ресурсах бремя тестирования примерно 70,000 1984 существующих химических веществ, производимых сегодня в мире, превысило бы доступные ресурсы подготовленных токсикологов. Потребуются столетия, чтобы завершить даже первую оценку этих химических веществ (NRC 1993). Во многих странах возросли этические опасения по поводу использования животных в тестах на токсичность, что создает дополнительные трудности при использовании стандартных методов тестирования на токсичность. SAR широко используется в фармацевтической промышленности для идентификации молекул, потенциально полезных для лечения (Hansch and Zhang, 1979). В политике охраны окружающей среды и гигиены труда SAR используется для прогнозирования дисперсии соединений в физико-химической среде и для проверки новых химических веществ для дальнейшей оценки потенциальной токсичности. В соответствии с Законом США о контроле за токсичными веществами (TSCA) Агентство по охране окружающей среды с 5 года использует подход SAR в качестве «первой проверки» новых химических веществ в процессе уведомления перед производством (PMN); Австралия использует аналогичный подход в рамках своей новой процедуры уведомления о химических веществах (НИКНАС). В SAR США анализ является важной основой для определения наличия разумных оснований для вывода о том, что производство, переработка, распространение, использование или удаление вещества будет представлять необоснованный риск причинения вреда здоровью человека или окружающей среде, как того требует Раздел 6(f) TSCA. На основании этого вывода Агентство по охране окружающей среды может потребовать реальных испытаний вещества в соответствии с разделом XNUMX TSCA.

Обоснование SAR

Научное обоснование SAR основано на предположении, что молекулярная структура химического вещества предсказывает важные аспекты его поведения в физико-химических и биологических системах (Hansch and Leo, 1979).

Процесс SAR

Процесс рассмотрения SAR включает идентификацию химической структуры, включая эмпирические составы, а также чистое соединение; идентификация структурно-аналогичных веществ; поиск в базах данных и литературе информации о структурных аналогах; анализ токсичности и другие данные о структурных аналогах. В некоторых редких случаях информации только о структуре соединения может быть достаточно для проведения анализа SAR, основанного на хорошо изученных механизмах токсичности. Было составлено несколько баз данных по SAR, а также компьютерные методы прогнозирования молекулярной структуры.

С помощью этой информации с помощью SAR можно оценить следующие конечные точки:

• физико-химические параметры: температура кипения, давление паров, растворимость в воде, коэффициент распределения октанол/вода.
• параметры биологической/экологической судьбы: биодеградация, сорбция почвой, фотодеградация, фармакокинетика
• параметры токсичности: токсичность для водных организмов, абсорбция, острая токсичность для млекопитающих (предельный тест или LD₅₀), раздражение кожи, легких и глаз, сенсибилизация, субхроническая токсичность, мутагенность.

Следует отметить, что не существует методов SAR для таких важных конечных точек для здоровья, как канцерогенность, токсичность для развития, репродуктивная токсичность, нейротоксичность, иммунотоксичность или другие воздействия на органы-мишени. Это связано с тремя факторами: отсутствием большой базы данных для проверки гипотез SAR, отсутствием знаний о структурных детерминантах токсического действия и множественностью клеток-мишеней и механизмов, которые вовлечены в эти конечные точки (см. подход к оценке риска репродуктивных токсикантов и нейротоксических агентов»). Некоторые ограниченные попытки использовать SAR для прогнозирования фармакокинетики с использованием информации о коэффициентах распределения и растворимости (Johanson and Naslund 1988). Для предсказания Р450-зависимого метаболизма ряда соединений и связывания диоксино- и ПХБ-подобных молекул с цитозольным «диоксиновым» рецептором был проведен более обширный количественный SAR (Hansch and Zhang 1993).

Было показано, что SAR имеет различную предсказуемость для некоторых из перечисленных выше конечных точек, как показано в таблице 1. В этой таблице представлены данные двух сравнений прогнозируемой активности с фактическими результатами, полученными путем эмпирических измерений или испытаний на токсичность. SAR, проведенный экспертами Агентства по охране окружающей среды США, оказался хуже для предсказания физико-химических свойств, чем для предсказания биологической активности, включая биодеградацию. Что касается конечных точек токсичности, SAR показал лучшие результаты для прогнозирования мутагенности. Ashby и Tennant (1991) в более расширенном исследовании также обнаружили хорошую предсказуемость краткосрочной генотоксичности при анализе химических веществ NTP. Эти результаты не удивительны, учитывая современные представления о молекулярных механизмах генотоксичности (см. «Генетическая токсикология») и роли электрофильности в связывании ДНК. Напротив, SAR имеет тенденцию занижать прогноз системной и субхронической токсичности у млекопитающих и завышать прогноз острой токсичности для водных организмов.

Таблица 1. Сравнение SAR и данных испытаний: анализ ОЭСР/НТП

Источник: Данные ОЭСР, личное сообщение К. Ауэра, Агентство по охране окружающей среды США. В этом анализе использовались только те конечные точки, для которых были доступны сопоставимые прогнозы SAR и фактические данные испытаний. Данные NTP взяты из Ashby and Tennant 1991.

¹ Обеспокоенность вызвала неспособность SAR предсказать острую токсичность 12% протестированных химических веществ.

² Данные ОЭСР, основанные на соответствии теста Эймса SAR.

³ Данные NTP, основанные на анализах генетоксичности, по сравнению с прогнозами SAR для нескольких классов «химических веществ, вызывающих структурную тревогу».

⁴ Согласованность зависит от класса; наибольшая согласованность была с ароматическими амино/нитросоединениями; самый низкий с «разными» структурами.

Для других токсичных конечных точек, как отмечалось выше, SAR имеет менее доказуемую полезность. Прогнозы токсичности для млекопитающих осложняются отсутствием SAR для токсикокинетики сложных молекул. Тем не менее, были предприняты некоторые попытки предложить принципы SAR для сложных конечных точек токсичности млекопитающих (например, см. Bernstein (1984) для SAR-анализа потенциальных токсикантов мужской репродуктивной системы). В большинстве случаев база данных слишком мала, чтобы можно было провести тщательную проверку прогнозов на основе структуры.

На этом этапе можно сделать вывод, что SAR может быть полезен главным образом для определения приоритетности инвестиций в ресурсы для тестирования токсичности или для раннего выявления опасений относительно потенциальной опасности. Только в случае мутагенности вполне вероятно, что анализ SAR сам по себе может быть надежно использован для принятия других решений. Маловероятно, что SAR может предоставить тип количественной информации, необходимой для целей оценки риска, как описано в других разделах этой главы. Энциклопедия.

Назад

Появление сложных технологий в молекулярной и клеточной биологии стимулировало относительно быстрое развитие наук о жизни, включая токсикологию. По сути, фокус токсикологии смещается от целых животных и популяций целых животных к клеткам и молекулам отдельных животных и людей. С середины 1980-х годов токсикологи начали использовать эти новые методологии для оценки воздействия химических веществ на живые системы. В качестве логического развития такие методы адаптируются для целей тестирования на токсичность. Эти научные достижения в сочетании с социальными и экономическими факторами привели к изменениям в оценке безопасности продукции и потенциального риска.

Экономические факторы конкретно связаны с объемом материалов, которые должны быть испытаны. Каждый год на рынок выводится множество новых косметических, фармацевтических препаратов, пестицидов, химикатов и товаров для дома. Все эти продукты должны быть оценены на предмет их потенциальной токсичности. Кроме того, имеется запас уже используемых химикатов, которые не были должным образом протестированы. Колоссальная задача получения подробной информации о безопасности всех этих химических веществ с использованием традиционных методов испытаний на целых животных была бы дорогостоящей с точки зрения денег и времени, если бы ее вообще можно было выполнить.

Существуют также социальные проблемы, связанные со здоровьем и безопасностью населения, а также растущую обеспокоенность общественности по поводу использования животных для проверки безопасности продукции. Что касается безопасности человека, общественные интересы и группы защиты окружающей среды оказали значительное давление на правительственные учреждения, чтобы они применяли более строгие правила в отношении химических веществ. Недавним примером этого стало движение некоторых экологических групп за запрет хлора и хлорсодержащих соединений в Соединенных Штатах. Одна из причин таких экстремальных действий заключается в том, что большинство этих соединений никогда не подвергались адекватным испытаниям. С токсикологической точки зрения концепция запрета целого класса разнообразных химикатов, основанная только на наличии хлора, является научно несостоятельной и безответственной. Тем не менее, понятно, что с точки зрения общественности должны быть определенные гарантии того, что химические вещества, выбрасываемые в окружающую среду, не представляют значительного риска для здоровья. Такая ситуация подчеркивает необходимость более эффективных и быстрых методов оценки токсичности.

Другая общественная проблема, которая повлияла на область тестирования токсичности, - это благополучие животных. Растущее число групп по защите животных во всем мире решительно возражают против использования целых животных для проверки безопасности продукции. Ведутся активные кампании против производителей косметики, товаров для дома и личной гигиены, фармацевтических препаратов в попытках остановить испытания на животных. Такие усилия в Европе привели к принятию Шестой поправки к Директиве 76/768/ЕЕС (Директива о косметике). Следствием этой Директивы является то, что косметические продукты или косметические ингредиенты, которые были протестированы на животных после 1 января 1998 г., не могут продаваться в Европейском Союзе, за исключением случаев, когда альтернативные методы недостаточно проверены. Хотя эта Директива не имеет юрисдикции в отношении продажи таких продуктов в Соединенных Штатах или других странах, она существенно повлияет на те компании, у которых есть международные рынки, включая Европу.

Концепция альтернатив, которая лежит в основе разработки тестов, отличных от тестов на целых животных, определяется тремя Rs: снижение в количестве используемых животных; утонченность протоколов, чтобы животные испытывали меньше стресса или дискомфорта; и замена текущих испытаний на животных с тестами in vitro (т. е. тестами, проводимыми вне живых животных), компьютерными моделями или тестами на низших позвоночных или беспозвоночных. Три Rбыли представлены в книге, опубликованной в 1959 году двумя британскими учеными, У. М. С. Расселом и Рексом Берчем. Принципы гуманной экспериментальной техники. Рассел и Берч утверждали, что единственный способ получить действительные научные результаты - это гуманное обращение с животными, и считали, что следует разработать методы, позволяющие сократить использование животных и, в конечном итоге, заменить его. Интересно, что принципам, изложенным Расселом и Берчем, уделялось мало внимания до возрождения движения за защиту животных в середине 1970-х годов. Сегодня концепция трех Rs занимает лидирующие позиции в области исследований, тестирования и обучения.

Таким образом, на разработку методологий тестирования in vitro повлияло множество факторов, которые сошлись за последние десять-двадцать лет. Трудно установить, оказал ли бы какой-либо из этих факторов столь сильное влияние на стратегии тестирования токсичности.

Концепция испытаний на токсичность in vitro

В этом разделе основное внимание будет уделено исключительно методам оценки токсичности in vitro как одной из альтернатив тестированию на животных. Дополнительные альтернативы, не связанные с животными, такие как компьютерное моделирование и количественные отношения структура-активность, обсуждаются в других статьях этой главы.

Исследования in vitro обычно проводятся на животных или человеческих клетках или тканях вне организма. In vitro буквально означает «в стекле» и относится к процедурам, проводимым с живым материалом или компонентами живого материала, культивируемыми в чашках Петри или в пробирках при определенных условиях. Их можно противопоставить исследованиям in vivo или исследованиям, проведенным «на живых животных». Хотя трудно, если не невозможно, спроецировать воздействие химического вещества на сложный организм, когда наблюдения ограничиваются одним типом клеток в чашке, исследования in vitro также предоставляют значительный объем информации о внутренней токсичности. как клеточные и молекулярные механизмы токсичности. Кроме того, они обладают многими преимуществами по сравнению с исследованиями in vivo, поскольку они, как правило, менее дороги и могут проводиться в более контролируемых условиях. Кроме того, несмотря на то, что для получения клеток для культур in vitro по-прежнему требуется небольшое количество животных, эти методы можно рассматривать как альтернативы сокращения (поскольку по сравнению с исследованиями in vivo используется намного меньше животных) и альтернативы уточнения (поскольку они устраняют необходимость подвергнуть животных неблагоприятным токсическим последствиям, вызванным экспериментами in vivo).

Чтобы интерпретировать результаты тестов на токсичность in vitro, определить их потенциальную полезность при оценке токсичности и связать их с общим токсикологическим процессом in vivo, необходимо понять, какая часть токсикологического процесса исследуется. Весь токсикологический процесс состоит из событий, которые начинаются с воздействия на организм физического или химического агента, развиваются через клеточные и молекулярные взаимодействия и в конечном итоге проявляются в ответной реакции всего организма. Тесты in vitro обычно ограничиваются той частью токсикологического процесса, которая протекает на клеточном и молекулярном уровне. Типы информации, которую можно получить в результате исследований in vitro, включают пути метаболизма, взаимодействие активных метаболитов с клеточными и молекулярными мишенями и потенциально измеримые токсические конечные точки, которые могут служить молекулярными биомаркерами воздействия. В идеальной ситуации был бы известен механизм токсичности каждого химического вещества в результате воздействия на организм, чтобы можно было полностью интерпретировать информацию, полученную в результате испытаний in vitro, и соотнести ее с реакцией всего организма. Однако это практически невозможно, поскольку полных токсикологических механизмов выяснено относительно немного. Таким образом, токсикологи сталкиваются с ситуацией, когда результаты теста in vitro нельзя использовать в качестве абсолютно точного прогноза токсичности in vivo, поскольку механизм неизвестен. Однако часто в процессе разработки теста in vitro выясняются компоненты клеточного и молекулярного механизма(ов) токсичности.

Один из ключевых нерешенных вопросов, связанных с разработкой и внедрением тестов in vitro, связан со следующим соображением: должны ли они быть механистически обоснованы или достаточно, чтобы они были описательными? Бесспорно, с научной точки зрения лучше использовать только механистически обоснованные тесты вместо тестов in vivo. Однако при отсутствии полных механистических знаний перспектива разработки тестов in vitro, которые в ближайшем будущем полностью заменят тесты на целых животных, практически нулевая. Это, однако, не исключает использования более описательных типов анализов в качестве инструментов раннего скрининга, что имеет место в настоящее время. Эти экраны привели к значительному сокращению использования животных. Следовательно, до тех пор, пока не будет получено больше механистической информации, может оказаться необходимым использовать в более ограниченной степени тесты, результаты которых просто хорошо коррелируют с результатами, полученными in vivo.

Тесты in vitro на цитотоксичность

В этом разделе будет описано несколько тестов in vitro, разработанных для оценки цитотоксического потенциала химического вещества. По большей части эти тесты просты в выполнении, а анализ может быть автоматизирован. Одним из обычно используемых in vitro тестов на цитотоксичность является анализ нейтрального красного. Этот анализ проводится на клетках в культуре, и для большинства применений клетки можно поддерживать в культуральных чашках, которые содержат 96 небольших лунок, каждая диаметром 6.4 мм. Поскольку каждую лунку можно использовать для одного определения, такое расположение позволяет использовать несколько концентраций тестируемого вещества, а также положительные и отрицательные контроли с достаточным количеством повторов для каждого. После обработки клеток различными концентрациями испытуемого химического вещества в диапазоне не менее двух порядков (например, от 0.01 мМ до 1 мМ), а также химическими веществами положительного и отрицательного контроля клетки промывают и обрабатывают нейтральным красным, краситель, который может поглощаться и удерживаться только живыми клетками. Краситель может быть добавлен при удалении испытуемого химического вещества для определения немедленных эффектов или может быть добавлен в разное время после удаления испытуемого химического вещества для определения кумулятивных или отсроченных эффектов. Интенсивность цвета в каждой лунке соответствует количеству живых клеток в этой лунке. Интенсивность окраски измеряют с помощью спектрофотометра, который может быть оснащен планшетным ридером. Считыватель планшетов запрограммирован на выполнение индивидуальных измерений для каждой из 96 лунок чашки для культивирования. Эта автоматизированная методология позволяет исследователю быстро провести эксперимент по зависимости концентрации от реакции и получить статистически полезные данные.

Другим относительно простым тестом на цитотоксичность является МТТ-тест. МТТ (3[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид) представляет собой тетразолиевый краситель, который восстанавливается митохондриальными ферментами до синего цвета. Только клетки с жизнеспособными митохондриями сохранят способность осуществлять эту реакцию; поэтому интенсивность окраски напрямую связана со степенью митохондриальной целостности. Это полезный тест для обнаружения общих цитотоксических соединений, а также тех агентов, которые специально нацелены на митохондрии.

Измерение активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) также используется в качестве универсального анализа цитотоксичности. Этот фермент в норме присутствует в цитоплазме живых клеток и высвобождается в культуральную среду через негерметичные клеточные мембраны мертвых или умирающих клеток, подвергшихся неблагоприятному воздействию токсического агента. Небольшие количества культуральной среды могут быть удалены в разное время после химической обработки клеток для измерения количества высвобождаемой ЛДГ и определения динамики токсичности во времени. Хотя анализ высвобождения ЛДГ является очень общей оценкой цитотоксичности, он полезен, поскольку его легко выполнить и его можно проводить в режиме реального времени.

В настоящее время разрабатывается много новых методов для обнаружения клеточных повреждений. Более сложные методы используют флуоресцентные зонды для измерения различных внутриклеточных параметров, таких как высвобождение кальция и изменения рН и мембранного потенциала. В целом, эти зонды очень чувствительны и могут обнаруживать более тонкие клеточные изменения, тем самым уменьшая необходимость использования гибели клеток в качестве конечной точки. Кроме того, многие из этих флуоресцентных анализов могут быть автоматизированы с использованием 96-луночных планшетов и ридеров для флуоресцентных планшетов.

После сбора данных о ряде химических веществ с использованием одного из этих тестов можно определить относительную токсичность. Относительная токсичность химического вещества, определенная в тесте in vitro, может быть выражена как концентрация, которая оказывает 50%-ное влияние на конечную реакцию необработанных клеток. Это определение упоминается как EC₅₀ (Eрезультативный Cконцентрация на 50% клеток) и может использоваться для сравнения токсичности различных химических веществ in vitro. (Аналогичный термин, используемый при оценке относительной токсичности, — ICXNUMX).₅₀, что указывает на концентрацию химического вещества, вызывающую 50% ингибирование клеточного процесса, например, способность поглощать нейтральный красный цвет.) Нелегко оценить, сопоставима ли относительная токсичность химических веществ in vitro с их относительной токсичностью в лабораторных условиях. токсичности в естественных условиях, поскольку в системе in vivo существует так много смешанных факторов, таких как токсикокинетика, метаболизм, репаративные и защитные механизмы. Кроме того, поскольку большинство этих анализов измеряют конечные точки общей цитотоксичности, они не основаны на механистическом подходе. Таким образом, совпадение относительной токсичности in vitro и in vivo является просто корреляционным. Несмотря на многочисленные сложности и трудности экстраполяции данных in vitro на in vivo, эти тесты in vitro оказались очень ценными, поскольку они просты и недороги в выполнении и могут использоваться в качестве скрининга для выявления высокотоксичных лекарств или химических веществ на ранних стадиях. разработка.

Токсичность органа-мишени

Тесты in vitro также можно использовать для оценки специфической токсичности органов-мишеней. Существует ряд трудностей, связанных с разработкой таких тестов, наиболее заметной из которых является неспособность систем in vitro поддерживать многие характеристики органа in vivo. Часто, когда клетки берут у животных и помещают в культуру, они склонны либо к быстрой дегенерации, либо к дедифференцировке, т. Это представляет собой проблему, заключающуюся в том, что в течение короткого периода времени, обычно нескольких дней, культуры перестают быть полезными для оценки органоспецифических эффектов токсина.

Многие из этих проблем решаются благодаря последним достижениям в области молекулярной и клеточной биологии. Информация, полученная о клеточной среде in vivo, может быть использована для модулирования условий культивирования in vitro. С середины 1980-х годов были открыты новые факторы роста и цитокины, и многие из них в настоящее время коммерчески доступны. Добавление этих факторов к клеткам в культуре помогает сохранить их целостность, а также может способствовать сохранению более дифференцированных функций в течение более длительных периодов времени. Другие фундаментальные исследования расширили знания о пищевых и гормональных потребностях клеток в культуре, так что теперь можно создавать новые среды. Недавние успехи также были достигнуты в идентификации как встречающихся в природе, так и искусственных внеклеточных матриц, на которых можно культивировать клетки. Культивирование клеток на этих различных матрицах может оказывать сильное влияние как на их структуру, так и на функцию. Основным преимуществом, полученным из этих знаний, является возможность сложно контролировать среду клеток в культуре и индивидуально исследовать влияние этих факторов на основные клеточные процессы и на их реакцию на различные химические агенты. Короче говоря, эти системы могут обеспечить глубокое понимание органоспецифических механизмов токсичности.

Многие исследования токсичности для органов-мишеней проводятся на первичных клетках, которые по определению являются свежевыделенными из органа и обычно демонстрируют ограниченное время жизни в культуре. Есть много преимуществ в получении первичных культур одного типа клеток из органа для оценки токсичности. С механистической точки зрения такие культуры полезны для изучения конкретных клеточных мишеней химического вещества. В некоторых случаях два или более типов клеток из органа могут культивироваться вместе, и это дает дополнительное преимущество, заключающееся в возможности изучения межклеточных взаимодействий в ответ на токсин. Некоторые системы совместного культивирования кожи были разработаны таким образом, что они образуют трехмерную структуру, напоминающую кожу in vivo. Также возможно совместное культивирование клеток из разных органов, например печени и почек. Этот тип культуры был бы полезен для оценки эффектов, характерных для клеток почек, химического вещества, которое должно быть биоактивировано в печени.

Молекулярно-биологические инструменты также сыграли важную роль в разработке непрерывных клеточных линий, которые могут быть полезны для тестирования токсичности органов-мишеней. Эти клеточные линии создаются путем трансфекции ДНК в первичные клетки. В процедуре трансфекции клетки и ДНК обрабатывают таким образом, чтобы ДНК могла быть поглощена клетками. ДНК обычно происходит от вируса и содержит ген или гены, экспрессия которых позволяет клеткам стать иммортализованными (т. е. способными жить и расти в течение продолжительных периодов времени в культуре). ДНК также можно сконструировать таким образом, чтобы ген иммортализации контролировался индуцируемым промотором. Преимущество этого типа конструкции состоит в том, что клетки будут делиться только тогда, когда они получат соответствующий химический стимул, позволяющий экспрессировать иммортализующий ген. Примером такой конструкции является большой ген Т-антигена вируса обезьян 40 (SV40) (ген иммортализации), которому предшествует промоторная область гена металлотионеина, который индуцируется присутствием металла в культуральной среде. Таким образом, после трансфекции гена в клетки клетки можно обработать низкими концентрациями цинка для стимуляции промотора МТ и включения экспрессии гена Т-антигена. В этих условиях клетки размножаются. При удалении цинка из среды клетки перестают делиться и в идеальных условиях возвращаются в состояние, в котором они проявляют свои тканеспецифические функции.

Способность генерировать иммортализованные клетки в сочетании с достижениями в технологии культивирования клеток в значительной степени способствовала созданию клеточных линий из многих различных органов, включая мозг, почки и печень. Однако, прежде чем эти клеточные линии можно будет использовать в качестве суррогата для настоящих типов клеток, их необходимо тщательно охарактеризовать, чтобы определить, насколько они «нормальны» на самом деле.

Другие системы in vitro для изучения токсичности органов-мишеней требуют все большей сложности. По мере того, как системы in vitro становятся все более сложными, от одной клетки к культуре целого органа, они становятся более сопоставимыми со средой in vivo, но в то же время их становится гораздо труднее контролировать, учитывая возросшее количество переменных. Следовательно, то, что можно получить при переходе на более высокий уровень организации, может быть потеряно из-за неспособности исследователя контролировать экспериментальную среду. В таблице 1 сравниваются некоторые характеристики различных систем in vitro, которые использовались для изучения гепатотоксичности.

Таблица 1. Сравнение систем in vitro для исследования гепатотоксичности

Прецизионные срезы тканей все шире используются для токсикологических исследований. Доступны новые инструменты, которые позволяют исследователю нарезать однородные срезы ткани в стерильной среде. Срезы ткани имеют некоторое преимущество перед системами культивирования клеток, поскольку присутствуют все типы клеток органа, и они сохраняют свою архитектуру in vivo и межклеточную связь. Таким образом, исследования in vitro могут быть проведены для определения типа клеток-мишеней в органе, а также для изучения специфической токсичности для органа-мишени. Недостатком срезов является то, что они быстро дегенерируют после первых 24 часов культивирования, в основном из-за плохой диффузии кислорода к клеткам внутри срезов. Однако недавние исследования показали, что более эффективная аэрация может быть достигнута за счет мягкого вращения. Это, вместе с использованием более сложной среды, позволяет ломтикам сохраняться до 96 часов.

Тканевые эксплантаты по своей концепции аналогичны срезам тканей и могут также использоваться для определения токсичности химических веществ в определенных органах-мишенях. Тканевые эксплантаты получают путем удаления небольшого кусочка ткани (для исследования тератогенности — интактного эмбриона) и помещения его в культуру для дальнейшего изучения. Культуры эксплантов были полезны для краткосрочных исследований токсичности, включая раздражение и коррозию кожи, исследования асбеста в трахее и исследования нейротоксичности в тканях мозга.

Изолированные перфузируемые органы также могут быть использованы для оценки токсичности органов-мишеней. Эти системы обладают тем же преимуществом, что и срезы тканей и эксплантаты, в том, что присутствуют все типы клеток, но без нагрузки на ткань, вызванной манипуляциями, связанными с приготовлением срезов. Кроме того, они позволяют поддерживать внутриорганные взаимодействия. Основным недостатком является их краткосрочная жизнеспособность, что ограничивает их использование для тестирования токсичности in vitro. В качестве альтернативы эти культуры можно считать усовершенствованием, так как животные не испытывают неблагоприятных последствий обработки токсикантами in vivo. Однако их использование не приводит к значительному уменьшению количества необходимых животных.

Таким образом, существует несколько типов систем in vitro для оценки токсичности органов-мишеней. Можно получить много информации о механизмах токсичности, используя один или несколько из этих методов. Остается трудность в том, чтобы узнать, как экстраполировать систему in vitro, которая представляет собой относительно небольшую часть токсикологического процесса, на весь процесс, происходящий in vivo.

Тесты in vitro на раздражение глаз

Возможно, наиболее спорным тестом на токсичность для целых животных с точки зрения благополучия животных является тест Дрейза на раздражение глаз, который проводится на кроликах. В этом тесте небольшая фиксированная доза химического вещества помещается в один глаз кролика, а другой глаз используется в качестве контроля. Степень раздражения и воспаления оценивают в разное время после воздействия. Предпринимаются серьезные усилия по разработке методологий замены этого теста, который подвергался критике не только из гуманных соображений, но и из-за субъективности наблюдений и изменчивости результатов. Интересно отметить, что, несмотря на резкую критику, которую получил тест Дрейза, он оказался чрезвычайно успешным в прогнозировании раздражителей глаз человека, особенно веществ от слабого до умеренно раздражающего, которые трудно идентифицировать другими методами. Таким образом, спрос на альтернативы in vitro велик.

Поиск альтернатив тесту Дрейза является сложным, хотя и прогнозируется, что он увенчается успехом. Были разработаны многочисленные in vitro и другие альтернативы, а в некоторых случаях они были реализованы. Усовершенствованные альтернативы тесту Дрейза, которые по определению являются менее болезненными или мучительными для животных, включают тест глаза с малым объемом, при котором меньшее количество тестовых материалов помещается в глаза кроликов не только из гуманных соображений, но и для более точно имитировать количество, которому люди могут фактически случайно подвергнуться воздействию. Еще одно уточнение заключается в том, что вещества с рН менее 2 или более 11.5 больше не тестируются на животных, поскольку известно, что они сильно раздражают глаза.

В период с 1980 по 1989 год количество кроликов, используемых для тестирования косметики на раздражение глаз, сократилось примерно на 87%. Тесты in vitro были включены как часть многоуровневого подхода к тестированию, чтобы добиться такого значительного сокращения тестов на целых животных. Этот подход представляет собой многоэтапный процесс, который начинается с тщательного изучения исторических данных о раздражении глаз и физического и химического анализа оцениваемого химического вещества. Если эти два процесса не дают достаточно информации, проводится ряд тестов in vitro. Дополнительные данные, полученные в результате испытаний in vitro, могут быть достаточными для оценки безопасности вещества. Если нет, то последним шагом будет проведение ограниченных тестов in vivo. Легко понять, как этот подход может устранить или, по крайней мере, резко сократить количество животных, необходимых для прогнозирования безопасности тестируемого вещества.

Набор тестов in vitro, который используется как часть этой стратегии многоуровневого тестирования, зависит от потребностей конкретной отрасли. Тесты на раздражение глаз проводятся в самых разных отраслях промышленности, от косметики до фармацевтики и промышленных химикатов. Тип информации, необходимой для каждой отрасли, различается, и поэтому невозможно определить единую группу тестов in vitro. Батарея тестов, как правило, предназначена для оценки пяти параметров: цитотоксичности, изменений в физиологии и биохимии тканей, количественных взаимосвязей между структурой и активностью, медиаторов воспаления, восстановления и репарации. Примером теста на цитотоксичность, которая является одной из возможных причин раздражения, является анализ нейтрального красного с использованием культивируемых клеток (см. выше). Изменения в клеточной физиологии и биохимии, возникающие в результате воздействия химического вещества, можно анализировать в культурах эпителиальных клеток роговицы человека. В качестве альтернативы исследователи также использовали целые или препарированные бычьи или куриные глазные яблоки, полученные на скотобойнях. Многие из конечных точек, измеренных в этих культурах целых органов, такие же, как и измеренные in vivo, такие как помутнение роговицы и отек роговицы.

Воспаление часто является компонентом вызванного химическими веществами поражения глаз, и существует ряд анализов, доступных для изучения этого параметра. Различные биохимические анализы определяют присутствие медиаторов, высвобождаемых во время воспалительного процесса, таких как арахидоновая кислота и цитокины. Хориоаллантоисная мембрана (ХАМ) куриного яйца также может быть использована в качестве индикатора воспаления. В анализе САМ небольшой кусочек скорлупы куриного эмбриона в возрасте от 14 до XNUMX дней удаляют, чтобы обнажить САМ. Затем на САМ наносят химическое вещество, и после этого в разное время оценивают признаки воспаления, такие как сосудистое кровоизлияние.

Одним из самых сложных процессов in vivo для оценки in vitro является восстановление и репарация травмы глаза. Недавно разработанный прибор, кремниевый микрофизиометр, измеряет небольшие изменения внеклеточного pH и может использоваться для мониторинга культивируемых клеток в режиме реального времени. Было показано, что этот анализ довольно хорошо коррелирует с восстановлением in vivo и использовался в качестве теста in vitro для этого процесса. Это был краткий обзор типов тестов, используемых в качестве альтернативы тесту Дрейза на раздражение глаз. Вполне вероятно, что в течение следующих нескольких лет будет определена полная серия наборов тестов in vitro, и каждый из них будет проверен для своей конкретной цели.

Проверка

Ключом к нормативному признанию и внедрению методологий тестирования in vitro является валидация, процесс, посредством которого устанавливается достоверность теста-кандидата для конкретной цели. Усилия по определению и координации процесса валидации были предприняты как в Соединенных Штатах, так и в Европе. Европейский союз учредил Европейский центр проверки альтернативных методов (ECVAM) в 1993 году для координации усилий и взаимодействия с американскими организациями, такими как Центр Джонса Хопкинса по альтернативам испытаниям на животных (CAAT), академический центр в Соединенных Штатах. и Межведомственный координационный комитет по проверке альтернативных методов (ICCVAM), состоящий из представителей Национальных институтов здравоохранения, Агентства по охране окружающей среды США, Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США и Комиссии по безопасности потребительских товаров.

Валидация тестов in vitro требует серьезной организации и планирования. Должен быть консенсус между государственными регулирующими органами, промышленными и академическими учеными в отношении приемлемых процедур, а также достаточный надзор со стороны научного консультативного совета, чтобы обеспечить соответствие протоколов установленным стандартам. Валидационные исследования следует проводить в ряде эталонных лабораторий с использованием калиброванных наборов химических веществ из банка химических веществ и клеток или тканей из одного источника. Должна быть продемонстрирована как внутрилабораторная воспроизводимость, так и межлабораторная воспроизводимость потенциального теста, а результаты должны быть подвергнуты соответствующему статистическому анализу. После того, как результаты различных компонентов валидационных исследований будут собраны, научный консультативный совет может дать рекомендации относительно валидности тестов-кандидатов для конкретной цели. Кроме того, результаты исследований должны быть опубликованы в рецензируемых журналах и помещены в базу данных.

Определение процесса проверки в настоящее время находится в стадии разработки. Каждое новое проверочное исследование будет предоставлять информацию, полезную для разработки следующего исследования. Международное общение и сотрудничество необходимы для быстрой разработки широко приемлемой серии протоколов, особенно с учетом повышенной срочности, вызванной принятием Директивы ЕС по косметике. Это законодательство действительно может дать необходимый импульс для проведения серьезной проверки. Только после завершения этого процесса может начаться принятие методов in vitro различными регулирующими органами.

Заключение

В этой статье представлен широкий обзор текущего состояния испытаний на токсичность in vitro. Наука in vitro токсикология относительно молода, но она развивается экспоненциально. Задача на ближайшие годы состоит в том, чтобы включить механистические знания, полученные в результате клеточных и молекулярных исследований, в обширный перечень данных in vivo, чтобы обеспечить более полное описание токсикологических механизмов, а также установить парадигму, с помощью которой можно использовать данные in vitro. для прогнозирования токсичности in vivo. Только совместными усилиями токсикологов и представителей правительства можно будет реализовать неотъемлемую ценность этих методов in vitro.

Назад

Оценка генетической токсичности представляет собой оценку агентов по их способности вызывать любой из трех основных типов изменений (мутаций) в генетическом материале (ДНК): генные, хромосомные и геномные. В таких организмах, как человек, гены состоят из ДНК, которая состоит из отдельных единиц, называемых нуклеотидными основаниями. Гены организованы в дискретные физические структуры, называемые хромосомами. Генотоксичность может привести к значительным и необратимым последствиям для здоровья человека. Генотоксическое повреждение является критическим этапом в индукции рака, а также может быть вовлечено в индукцию врожденных дефектов и гибель плода. Три класса мутаций, упомянутых выше, могут возникать в любом из двух типов тканей, которыми обладают такие организмы, как люди: сперматозоиды или яйцеклетки (зародышевые клетки) и оставшаяся ткань (соматические клетки).

Анализы, которые измеряют мутацию гена, - это те, которые обнаруживают замену, добавление или делецию нуклеотидов в гене. Анализы, которые измеряют хромосомную мутацию, — это те, которые обнаруживают разрывы или хромосомные перестройки, затрагивающие одну или несколько хромосом. Анализы, которые измеряют геномную мутацию, - это те, которые обнаруживают изменения в числе хромосом, состояние, называемое анеуплоидией. Оценка генетической токсичности значительно изменилась с момента разработки Германом Мюллером в 1927 году первого теста для обнаружения генотоксических (мутагенных) агентов. С тех пор было разработано более 200 тестов для измерения мутаций в ДНК; однако сегодня для оценки генетической токсичности обычно используется менее десяти тестов. В этой статье рассматриваются эти анализы, описывается, что они измеряют, и исследуется роль этих анализов в оценке токсичности.

Выявление опасностей рака до разработки Область генетической токсикологии

Генетическая токсикология стала неотъемлемой частью общего процесса оценки риска и в последнее время приобрела статус надежного средства прогнозирования канцерогенной активности. Однако до развития генетической токсикологии (до 1970 г.) другие методы использовались и до сих пор используются для выявления потенциальной опасности рака для человека. Существует шесть основных категорий методов, используемых в настоящее время для выявления рисков рака у человека: эпидемиологические исследования, долгосрочные биоанализы in vivo, среднесрочные биоанализы in vivo, краткосрочные биоанализы in vivo и in vitro, искусственный интеллект (структура-активность), и вывод на основе механизмов.

В таблице 1 приведены преимущества и недостатки этих методов.

Таблица 1. Преимущества и недостатки современных методов определения риска развития рака у человека

Обоснование и концептуальная основа генетических токсикологических анализов

Хотя точные типы и количество анализов, используемых для оценки генетической токсичности, постоянно развиваются и варьируются от страны к стране, наиболее распространенные из них включают анализы (1) генных мутаций в бактериях и/или культивируемых клетках млекопитающих и (2) хромосомных мутаций в клетках млекопитающих. культивированные клетки млекопитающих и/или костный мозг живых мышей. Некоторые анализы из этой второй категории также могут обнаруживать анеуплоидию. Хотя эти анализы не выявляют мутации в зародышевых клетках, они используются главным образом из-за дополнительных затрат и сложности проведения анализов зародышевых клеток. Тем не менее, анализ зародышевых клеток на мышах используется, когда требуется информация об эффектах зародышевых клеток.

Систематические исследования в течение 25-летнего периода (1970-1995 гг.), особенно в рамках Национальной токсикологической программы США в Северной Каролине, привели к использованию дискретного ряда анализов для выявления мутагенной активности агентов. Обоснование оценки полезности анализов основывалось на их способности обнаруживать агенты, вызывающие рак у грызунов и подозреваемые в том, что они вызывают рак у людей (т.е. канцерогены). Это связано с тем, что исследования, проведенные в течение последних нескольких десятилетий, показали, что раковые клетки содержат мутации в определенных генах и что многие канцерогены также являются мутагенами. Таким образом, раковые клетки рассматриваются как содержащие мутации соматических клеток, а канцерогенез рассматривается как тип мутагенеза соматических клеток.

Анализы генетической токсичности, наиболее часто используемые в настоящее время, были выбраны не только из-за их большой базы данных, относительно низкой стоимости и простоты выполнения, но и потому, что было показано, что они обнаруживают многие канцерогены грызунов и, предположительно, человеческие канцерогены. Следовательно, анализы генетической токсичности используются для прогнозирования потенциальной канцерогенности агентов.

Важным концептуальным и практическим достижением в области генетической токсикологии стало признание того факта, что многие канцерогены модифицируются ферментами в организме, создавая измененные формы (метаболиты), которые часто являются конечной канцерогенной и мутагенной формой исходного химического вещества. Чтобы воспроизвести этот метаболизм в чашке Петри, Генрих Маллинг показал, что включение препарата из печени грызунов содержит многие ферменты, необходимые для осуществления этого метаболического преобразования или активации. Таким образом, во многих анализах генетической токсичности, проводимых в чашках или пробирках (in vitro), используется добавление аналогичных ферментных препаратов. Простые препараты называются S9 mix, а очищенные препараты называются микросомами. Некоторые клетки бактерий и млекопитающих теперь были генетически модифицированы, чтобы содержать некоторые гены грызунов или человека, которые производят эти ферменты, что снижает потребность в добавлении смеси S9 или микросом.

Генетические токсикологические анализы и методы

Основными бактериальными системами, используемыми для скрининга генетической токсичности, являются анализ мутагенности Salmonella (Ames) и, в гораздо меньшей степени, штамм WP2 Кишечная палочка. Исследования середины 1980-х показали, что использование только двух штаммов системы сальмонелл (ТА98 и ТА100) было достаточным для обнаружения примерно 90% известных мутагенов сальмонелл. Таким образом, эти два штамма используются для большинства целей скрининга; однако для более обширного тестирования доступны различные другие штаммы.

Эти анализы выполняются различными способами, но двумя общими процедурами являются анализы с включением планшета и анализы с жидкой суспензией. В анализе включения в чашку клетки, тестируемое химическое вещество и (при желании) S9 добавляют вместе в жидкий агар и выливают на поверхность чашки Петри с агаром. Верхний агар затвердевает в течение нескольких минут, и чашки инкубируют в течение двух-трех дней, после чего мутантные клетки вырастают, образуя визуально обнаруживаемые скопления клеток, называемые колониями, которые затем подсчитывают. Агаровая среда содержит селективные агенты или состоит из таких ингредиентов, что только новые мутировавшие клетки будут расти. Анализ с инкубацией в жидкости аналогичен, за исключением того, что клетки, тестируемый агент и S9 инкубируют вместе в жидкости, не содержащей жидкого агара, а затем клетки промывают от тестируемого агента и S9 и высевают на агар.

Мутации в культивируемых клетках млекопитающих обнаруживаются преимущественно в одном из двух генов: хпрт и tk. Подобно бактериальным анализам, клеточные линии млекопитающих (разработанные из клеток грызунов или человека) подвергают воздействию тестируемого агента в пластиковых культуральных чашках или пробирках, а затем высевают в культуральные чашки, содержащие среду с селективным агентом, который позволяет расти только мутантным клеткам. . Анализы, используемые для этой цели, включают CHO/HPRT, TK6 и мышиную лимфому L5178Y/TK.^+/- пробы. Также используются другие клеточные линии, содержащие различные мутации репарации ДНК, а также содержащие некоторые человеческие гены, участвующие в метаболизме. Эти системы позволяют восстанавливать мутации внутри гена (генная мутация), а также мутации, затрагивающие участки хромосомы, фланкирующие ген (хромосомная мутация). Однако этот последний тип мутаций восстанавливается в гораздо большей степени с помощью tk генные системы, чем хпрт генные системы из-за расположения tk ген.

Подобно анализу бактериальной мутагенности в жидкостной инкубации, анализы мутагенности клеток млекопитающих обычно включают экспозицию клеток в культуральных чашках или пробирках в присутствии тестируемого агента и S9 в течение нескольких часов. Затем клетки промывают, культивируют еще несколько дней, чтобы продукты нормальных (дикого типа) генов расщепились, а продукты новых мутантных генов экспрессировались и накапливались, а затем их высевают в среду, содержащую селективный агент, который позволяет растут только мутантные клетки. Как и при бактериальном анализе, мутантные клетки вырастают в визуально обнаруживаемые колонии, которые затем подсчитывают.

Хромосомная мутация идентифицируется в первую очередь с помощью цитогенетических анализов, которые включают воздействие на грызунов и/или клетки грызунов или человека в культуральных чашках тестируемым химическим веществом, позволяя произойти одному или нескольким клеточным делениям, окрашивая хромосомы, а затем визуально исследуя хромосомы под микроскопом. для обнаружения изменений в структуре или числе хромосом. Хотя можно исследовать множество конечных точек, две из них в настоящее время признаны регулирующими органами наиболее значимыми: хромосомные аберрации и подкатегория, называемая микроядрами.

Для оценки клеток на наличие хромосомных аберраций требуется значительная подготовка и опыт, что делает эту процедуру дорогостоящей с точки зрения времени и денег. Напротив, микроядра требуют небольшого обучения, и их обнаружение может быть автоматизировано. Микроядра выглядят как маленькие точки внутри клетки, отличные от ядра, содержащего хромосомы. Микроядра возникают либо в результате поломки хромосом, либо в результате анеуплоидии. Из-за простоты подсчета микроядер по сравнению с хромосомными аберрациями, а также из-за того, что недавние исследования показали, что агенты, вызывающие хромосомные аберрации в костном мозге живых мышей, обычно индуцируют микроядра в этой ткани, микроядра в настоящее время обычно измеряются как показатель способности агент, вызывающий хромосомную мутацию.

Хотя анализы на зародышевые клетки используются гораздо реже, чем другие описанные выше анализы, они необходимы для определения того, представляет ли агент риск для зародышевых клеток, мутации в которых могут привести к последствиям для здоровья в последующих поколениях. Наиболее часто используемые анализы зародышевых клеток проводятся на мышах и включают системы, которые обнаруживают (1) наследуемые транслокации (обмены) между хромосомами (анализ наследуемых транслокаций), (2) генные или хромосомные мутации, затрагивающие определенные гены (видимые или биохимические специфические локусы). анализы) и (3) мутации, влияющие на жизнеспособность (доминантный летальный анализ). Как и в случае анализа соматических клеток, рабочее допущение в отношении анализа зародышевых клеток состоит в том, что агенты, положительные в этих анализах, считаются потенциальными мутагенами зародышевых клеток человека.

Текущее состояние и перспективы на будущее

Недавние исследования показали, что для обнаружения примерно 90% набора из 41 канцерогена для грызунов (т. е. предполагаемых канцерогенов человека и мутагенов соматических клеток) было необходимо всего три элемента информации. К ним относятся (1) знание химической структуры агента, особенно если он содержит электрофильные фрагменты (см. раздел о взаимосвязях структура-активность); (2) данные о мутагенности Salmonella; и (3) данные 90-дневного анализа хронической токсичности на грызунах (мышах и крысах). Действительно, практически все канцерогены человека, объявленные IARC, обнаруживаются как мутагены с использованием только анализа на сальмонеллу и микроядерного анализа костного мозга мыши. Использование этих анализов мутагенности для обнаружения потенциальных канцерогенов человека подтверждается тем фактом, что большинство канцерогенов человека являются канцерогенными как для крыс, так и для мышей (межвидовые канцерогены) и что большинство межвидовых канцерогенов являются мутагенными для сальмонелл и/или индуцируют микроядра. в костном мозге мыши.

Благодаря достижениям в технологии ДНК, проекту генома человека и лучшему пониманию роли мутаций в развитии рака разрабатываются новые анализы генотоксичности, которые, вероятно, будут включены в стандартные процедуры скрининга. Среди них использование трансгенных клеток и грызунов. Трансгенные системы — это системы, в которых ген другого вида был введен в клетку или организм. Например, в настоящее время в экспериментальных целях используются трансгенные мыши, которые позволяют обнаруживать мутацию в любом органе или ткани животного на основе введения бактериального гена в мышь. В настоящее время доступны бактериальные клетки, такие как Salmonella, и клетки млекопитающих (включая линии клеток человека), которые содержат гены, участвующие в метаболизме канцерогенных/мутагенных агентов, такие как гены P450. Молекулярный анализ фактических мутаций, индуцированных в трансгене у трансгенных грызунов или в нативных генах, таких как хпрт, или гены-мишени в пределах сальмонеллы теперь могут быть выполнены, чтобы можно было определить точную природу мутаций, вызванных химическими веществами, что дает представление о механизме действия химического вещества и позволяет сравнивать с мутациями у людей, предположительно подвергшихся воздействию агента. .

Молекулярные достижения в цитогенетике теперь позволяют более детально оценивать хромосомные мутации. К ним относится использование зондов (небольших фрагментов ДНК), которые прикрепляются (гибридизуются) к определенным генам. Затем перестройки генов на хромосоме можно выявить по измененному расположению зондов, которые флуоресцируют и легко визуализируются в виде цветных секторов на хромосомах. Гель-электрофорез отдельных клеток для выявления разрывов ДНК (обычно называемый «кометным» анализом) позволяет обнаруживать разрывы ДНК в отдельных клетках и может стать чрезвычайно полезным инструментом в сочетании с цитогенетическими методами для обнаружения хромосомных повреждений.

После многих лет использования и создания большой и систематически разрабатываемой базы данных оценка генетической токсичности теперь может быть выполнена с помощью всего нескольких анализов при относительно небольших затратах за короткий период времени (несколько недель). Полученные данные можно использовать для прогнозирования способности агента быть грызуном и, предположительно, канцерогеном/мутагеном соматических клеток человека. Такая способность позволяет ограничивать поступление в окружающую среду мутагенных и канцерогенных агентов и разрабатывать альтернативные, немутагенные агенты. Будущие исследования должны привести к еще более совершенным методам с большей предсказуемостью, чем текущие анализы.

Назад

Слово биомаркером сокращение от слова «биологический маркер», термин, который относится к измеримому событию, происходящему в биологической системе, например, в организме человека. Затем это событие интерпретируется как отражение или маркер более общего состояния организма или ожидаемой продолжительности жизни. В гигиене труда биомаркер обычно используется в качестве индикатора состояния здоровья или риска заболевания.

Биомаркеры используются для исследований in vitro, а также in vivo, которые могут включать людей. Обычно выделяют три конкретных типа биологических маркеров. Хотя несколько биомаркеров может быть трудно классифицировать, обычно их делят на биомаркеры воздействия, биомаркеры эффекта или биомаркеры чувствительности (см. таблицу 1).

Таблица 1. Примеры биомаркеров воздействия или биомаркеров эффекта, которые используются в токсикологических исследованиях в области гигиены труда

При приемлемой степени достоверности биомаркеры могут использоваться для нескольких целей. В индивидуальном порядке биомаркер может быть использован для подтверждения или опровержения диагноза определенного типа отравления или других побочных эффектов, вызванных химическими веществами. У здорового человека биомаркер может также отражать индивидуальную гиперчувствительность к определенным химическим воздействиям и, следовательно, может служить основой для прогнозирования риска и консультирования. В группах работников, подвергшихся воздействию, некоторые биомаркеры воздействия могут применяться для оценки степени соблюдения правил по борьбе с загрязнением или эффективности профилактических мер в целом.

Биомаркеры воздействия

Биомаркером воздействия может быть экзогенное соединение (или метаболит) в организме, продукт взаимодействия между соединением (или метаболитом) и эндогенным компонентом или другое событие, связанное с воздействием. Чаще всего биомаркеры воздействия стабильных соединений, таких как металлы, включают измерения концентрации металлов в соответствующих образцах, таких как кровь, сыворотка или моча. В случае летучих химических веществ можно оценить их концентрацию в выдыхаемом воздухе (после вдыхания чистого воздуха). Если соединение метаболизируется в организме, один или несколько метаболитов могут быть выбраны в качестве биомаркера воздействия; метаболиты часто определяются в образцах мочи.

Современные методы анализа могут позволить разделить изомеры или конгенеры органических соединений, а также определить состав соединений металлов или изотопные отношения определенных элементов. Сложные анализы позволяют определять изменения в структуре ДНК или других макромолекул, вызванные связыванием с реактивными химическими веществами. Такие передовые методы, несомненно, приобретут значительно большее значение для применения в исследованиях биомаркеров, а более низкие пределы обнаружения и лучшая аналитическая достоверность, вероятно, сделают эти биомаркеры еще более полезными.

Особенно многообещающие разработки произошли с биомаркерами воздействия мутагенных химических веществ. Эти соединения реакционноспособны и могут образовывать аддукты с макромолекулами, такими как белки или ДНК. Аддукты ДНК могут быть обнаружены в лейкоцитах или биоптатах тканей, а специфические фрагменты ДНК могут выделяться с мочой. Например, воздействие этиленоксида приводит к реакциям с основаниями ДНК, и после удаления поврежденного основания N-7-(2-гидроксиэтил)гуанин выводится с мочой. Некоторые аддукты могут не относиться непосредственно к конкретному воздействию. Например, 8-гидрокси-2'-дезоксигуанозин отражает окислительное повреждение ДНК, и эта реакция может быть вызвана несколькими химическими соединениями, большинство из которых также вызывают перекисное окисление липидов.

Другие макромолекулы также могут быть изменены путем образования аддукта или окисления. Особый интерес представляет то, что такие реактивные соединения могут образовывать аддукты гемоглобина, которые можно определить как биомаркеры воздействия соединений. Преимущество состоит в том, что из образца крови можно получить достаточное количество гемоглобина, и, учитывая четырехмесячное время жизни эритроцитов, аддукты, образующиеся с аминокислотами белка, будут указывать на общее воздействие за этот период.

Аддукты можно определить с помощью чувствительных методов, таких как высокоэффективная липидная хроматография, также доступны некоторые иммунологические методы. В целом аналитические методы являются новыми, дорогими и нуждаются в дальнейшей разработке и валидации. Лучшая чувствительность может быть получена с помощью ³²Анализ P после мечения, который является неспецифическим признаком того, что имело место повреждение ДНК. Все эти методы потенциально полезны для биологического мониторинга и применяются во все большем числе исследований. Однако необходимы более простые и чувствительные аналитические методы. Учитывая ограниченную специфичность некоторых методов при низкоуровневом воздействии, курение табака или другие факторы могут существенно повлиять на результаты измерения, что вызовет трудности в интерпретации.

Воздействие мутагенных соединений или соединений, которые метаболизируются в мутагены, также можно определить путем оценки мутагенности мочи подвергшегося воздействию человека. Образец мочи инкубируют со штаммом бактерий, в котором экспрессируется определенная точечная мутация, которую можно легко измерить. Если в образце мочи присутствуют мутагенные химические вещества, то в бактериях будет происходить повышенная скорость мутаций.

Биомаркеры воздействия необходимо оценивать с точки зрения временных вариаций воздействия и отношения к различным компартментам. Таким образом, временные рамки, представленные биомаркером, то есть степень, в которой измерение биомаркера отражает прошлые воздействия и/или накопленную нагрузку на организм, должны быть определены на основе токсикокинетических данных для интерпретации результата. В частности, следует учитывать степень, в которой биомаркер указывает на задержку в конкретных органах-мишенях. Хотя образцы крови часто используются для исследования биомаркеров, периферическая кровь обычно не рассматривается как компартмент как таковой, хотя она действует как транспортная среда между компартментами. Степень, в которой концентрация в крови отражает уровни в различных органах, широко варьируется в зависимости от различных химических веществ и обычно также зависит от продолжительности воздействия, а также времени, прошедшего после воздействия.

Иногда этот тип доказательств используется для классификации биомаркера как показателя (общей) поглощенной дозы или показателя эффективной дозы (т. е. количества, достигшего ткани-мишени). Например, воздействие определенного растворителя можно оценить по данным о фактической концентрации растворителя в крови в определенное время после воздействия. Это измерение будет отражать количество растворителя, впитавшегося в организм. Часть абсорбированного количества будет выдыхаться из-за давления паров растворителя. Циркулируя в крови, растворитель будет взаимодействовать с различными компонентами организма и в конечном итоге подвергнется расщеплению ферментами. Исход метаболических процессов можно оценить, определяя специфические меркаптуровые кислоты, образующиеся при конъюгации с глутатионом. Кумулятивная экскреция меркаптуровых кислот может лучше отражать эффективную дозу, чем концентрация в крови.

Жизненные события, такие как размножение и старение, могут повлиять на распространение химического вещества. Беременность существенно влияет на распределение химических веществ в организме, и многие химические вещества могут проникать через плацентарный барьер, вызывая воздействие на плод. Лактация может приводить к экскреции жирорастворимых химических веществ, что приводит к уменьшению их удержания в организме матери и повышенному поглощению младенцем. Во время потери веса или развития остеопороза могут высвобождаться накопленные химические вещества, что затем может привести к возобновлению и длительному «эндогенному» воздействию на органы-мишени. Другие факторы могут влиять на индивидуальную абсорбцию, метаболизм, удержание и распределение химических соединений, и доступны некоторые биомаркеры восприимчивости (см. ниже).

Биомаркеры эффекта

Маркером эффекта может быть эндогенный компонент, или мера функциональной способности, или какой-либо другой показатель состояния или баланса организма или системы органов, затронутых воздействием. Такие маркеры эффекта обычно являются доклиническими индикаторами отклонений.

Эти биомаркеры могут быть специфическими или неспецифическими. Конкретные биомаркеры полезны, поскольку они указывают на биологический эффект конкретного воздействия, таким образом предоставляя доказательства, которые потенциально могут быть использованы в профилактических целях. Неспецифические биомаркеры не указывают на индивидуальную причину эффекта, но они могут отражать общий комплексный эффект из-за смешанного воздействия. Таким образом, оба типа биомаркеров могут иметь большое значение для гигиены труда.

Не существует четкого различия между биомаркерами воздействия и биомаркерами эффекта. Например, можно сказать, что образование аддукта отражает эффект, а не воздействие. Однако биомаркеры эффекта обычно указывают на изменения в функциях клеток, тканей или организма в целом. Некоторые исследователи включают грубые изменения, такие как увеличение веса печени лабораторных животных, подвергшихся воздействию, или снижение роста у детей, в качестве биомаркеров эффекта. В целях гигиены труда биомаркеры воздействия должны быть ограничены теми, которые указывают на субклинические или обратимые биохимические изменения, такие как ингибирование ферментов. Наиболее часто используемым биомаркером эффекта, вероятно, является ингибирование холинэстеразы, вызванное некоторыми инсектицидами, то есть органофосфатами и карбаматами. В большинстве случаев этот эффект полностью обратим, а ингибирование фермента отражает общее воздействие данной группы инсектицидов.

Некоторые воздействия приводят не к ингибированию фермента, а к повышению активности фермента. Это касается нескольких ферментов, принадлежащих к семейству Р450 (см. «Генетические детерминанты токсического ответа»). Они могут быть вызваны воздействием определенных растворителей и полиароматических углеводородов (ПАУ). Поскольку эти ферменты в основном экспрессируются в тканях, из которых трудно получить биопсию, активность фермента определяют косвенно in vivo путем введения соединения, которое метаболизируется этим конкретным ферментом, а затем измеряют продукт распада в моче или плазме.

Другие воздействия могут индуцировать синтез защитного белка в организме. Лучшим примером, вероятно, является металлотионеин, который связывает кадмий и способствует выведению этого металла из организма; воздействие кадмия является одним из факторов, приводящих к повышенной экспрессии гена металлотионеина. Подобные защитные белки могут существовать, но они еще недостаточно изучены, чтобы их можно было принять в качестве биомаркеров. Среди кандидатов на возможное использование в качестве биомаркеров есть так называемые белки стресса, первоначально называемые белками теплового шока. Эти белки вырабатываются рядом различных организмов в ответ на различные неблагоприятные воздействия.

Окислительное повреждение можно оценить, определив концентрацию малонового диальдегида в сыворотке крови или выдыхаемый этан. Точно так же экскреция с мочой белков с небольшой молекулярной массой, таких как альбумин, может быть использована в качестве биомаркера раннего повреждения почек. Некоторые параметры, обычно используемые в клинической практике (например, уровни гормонов или ферментов в сыворотке), также могут быть полезны в качестве биомаркеров. Однако многие из этих параметров могут быть недостаточно чувствительными для раннего выявления нарушений.

Другая группа параметров воздействия относится к генотоксическим эффектам (изменениям в структуре хромосом). Такие эффекты могут быть обнаружены при микроскопии лейкоцитов, которые подвергаются клеточному делению. Серьезные повреждения хромосом — хромосомные аберрации или образование микроядер — можно увидеть в микроскоп. Повреждение также может быть обнаружено путем добавления красителя к клеткам во время клеточного деления. Затем воздействие генотоксического агента может быть визуализировано как повышенный обмен красителя между двумя хроматидами каждой хромосомы (обмен сестринскими хроматидами). Хромосомные аберрации связаны с повышенным риском развития рака, но значение повышенной скорости обмена сестринскими хроматидами менее ясно.

Более сложная оценка генотоксичности основана на определенных точечных мутациях в соматических клетках, то есть в лейкоцитах или эпителиальных клетках, полученных из слизистой оболочки полости рта. Мутация в определенном локусе может сделать клетки способными расти в культуре, содержащей химическое вещество, которое в других отношениях является токсичным (например, 6-тиогуанин). В качестве альтернативы можно оценить специфический генный продукт (например, сывороточные или тканевые концентрации онкопротеинов, кодируемых конкретными онкогенами). Очевидно, что эти мутации отражают общее причиненное генотоксическое повреждение и не обязательно указывают на причинное воздействие. Эти методы еще не готовы для практического использования в области гигиены труда, но быстрый прогресс в этом направлении исследований предполагает, что такие методы станут доступными в течение нескольких лет.

Биомаркеры восприимчивости

Маркер восприимчивости, унаследованный или индуцированный, является индикатором того, что человек особенно чувствителен к действию ксенобиотика или к действию группы таких соединений. Наибольшее внимание было сосредоточено на генетической предрасположенности, хотя и другие факторы могут быть не менее важными. Гиперчувствительность может быть связана с унаследованной чертой, конституцией человека или факторами окружающей среды.

Способность метаболизировать определенные химические вещества вариабельна и определяется генетически (см. «Генетические детерминанты токсического ответа»). Несколько соответствующих ферментов, по-видимому, контролируются одним геном. Например, окисление чужеродных химических веществ в основном осуществляется семейством ферментов, принадлежащих к семейству Р450. Другие ферменты делают метаболиты более водорастворимыми за счет конъюгации (например, N-ацетилтрансфераза и μ-глутатион-S-трансфераза). Активность этих ферментов контролируется генетически и значительно варьирует. Как упоминалось выше, активность можно определить, введя небольшую дозу лекарства и затем определив количество метаболита в моче. Некоторые из генов в настоящее время охарактеризованы, и доступны методы определения генотипа. Важные исследования показывают, что риск развития некоторых форм рака связан со способностью метаболизировать чужеродные соединения. Многие вопросы до сих пор остаются без ответа, что в настоящее время ограничивает использование этих биомаркеров потенциальной восприимчивости в гигиене труда.

Другие унаследованные признаки, такие как альфа₁Дефицит антитрипсина или дефицит глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы также приводят к нарушению защитных механизмов в организме, вызывая тем самым повышенную чувствительность к определенным воздействиям.

Большинство исследований, связанных с восприимчивостью, касались генетической предрасположенности. Другие факторы также играют роль, и ими частично пренебрегают. Например, люди с хроническими заболеваниями могут быть более чувствительны к профессиональному воздействию. Кроме того, если патологический процесс или предыдущее воздействие токсичных химикатов вызвало некоторое субклиническое повреждение органов, то способность противостоять новому токсичному воздействию, вероятно, будет меньше. В качестве биомаркеров чувствительности в этом случае можно использовать биохимические показатели функции органов. Возможно, лучший пример гиперчувствительности относится к аллергическим реакциям. Если человек стал сенсибилизированным к определенному воздействию, то в сыворотке могут быть обнаружены специфические антитела. Даже если человек не стал сенсибилизированным, другие текущие или прошлые воздействия могут увеличить риск развития неблагоприятных последствий, связанных с профессиональным воздействием.

Серьезной проблемой является определение совместного действия смешанных экспозиций на рабочем месте. Кроме того, личные привычки и употребление наркотиков могут привести к повышенной восприимчивости. Например, табачный дым обычно содержит значительное количество кадмия. Таким образом, при профессиональном воздействии кадмия заядлый курильщик, накопивший значительное количество этого металла в организме, подвергается повышенному риску развития связанного с кадмием заболевания почек.

Применение в области гигиены труда

Биомаркеры чрезвычайно полезны в токсикологических исследованиях, и многие из них могут быть применимы в биологическом мониторинге. Тем не менее, ограничения также должны быть признаны. Многие биомаркеры до сих пор изучались только на лабораторных животных. Токсикокинетические модели у других видов могут не обязательно отражать ситуацию у людей, и для экстраполяции могут потребоваться подтверждающие исследования на людях-добровольцах. Кроме того, необходимо принимать во внимание индивидуальные вариации, обусловленные генетическими или конституциональными факторами.

В некоторых случаях биомаркеры экспозиции вообще могут оказаться неосуществимыми (например, для химических веществ, которые недолговечны in vivo). Другие химические вещества могут накапливаться или воздействовать на органы, недоступные для обычных процедур, такие как нервная система. Путь воздействия также может влиять на характер распределения и, следовательно, на измерение биомаркеров и их интерпретацию. Например, прямое воздействие на мозг через обонятельный нерв, скорее всего, не будет обнаружено путем измерения биомаркеров воздействия. Что касается биомаркеров влияния, то многие из них вовсе не специфичны, и изменение может быть обусловлено самыми разными причинами, в том числе факторами образа жизни. Возможно, особенно в отношении биомаркеров восприимчивости, интерпретация в настоящее время должна быть очень осторожной, поскольку остается много неопределенностей в отношении общей значимости отдельных генотипов для здоровья.

В области гигиены труда идеальный биомаркер должен удовлетворять нескольким требованиям. Прежде всего, сбор и анализ проб должны быть простыми и надежными. Для оптимального аналитического качества необходима стандартизация, но конкретные требования значительно различаются. К основным областям, вызывающим озабоченность, относятся: подготовка человека, процедура отбора проб и обращение с пробами, а также процедура измерения; последний включает технические факторы, такие как процедуры калибровки и обеспечения качества, а также индивидуальные факторы, такие как образование и обучение операторов.

Для документирования аналитической достоверности и прослеживаемости эталонные материалы должны быть основаны на соответствующих матрицах и с соответствующими концентрациями токсичных веществ или соответствующих метаболитов на соответствующих уровнях. Чтобы биомаркеры можно было использовать для биологического мониторинга или в диагностических целях, ответственные лаборатории должны иметь хорошо документированные аналитические процедуры с определенными рабочими характеристиками и доступными записями, позволяющими проверить результаты. В то же время, тем не менее, необходимо учитывать экономические аспекты характеристики и использования эталонных материалов для дополнения процедур обеспечения качества в целом. Таким образом, достижимое качество результатов и способы их использования должны быть сбалансированы с дополнительными затратами на обеспечение качества, включая справочные материалы, рабочую силу и оборудование.

Еще одно требование состоит в том, что биомаркер должен быть специфичным, по крайней мере в условиях исследования, для определенного типа воздействия с четкой зависимостью от степени воздействия. В противном случае результат измерения биомаркера будет слишком сложно интерпретировать. Для правильной интерпретации результата измерения биомаркера воздействия должна быть известна диагностическая достоверность (т. е. перевод значения биомаркера в величину возможных рисков для здоровья). В этой области металлы служат парадигмой для исследования биомаркеров. Недавние исследования продемонстрировали сложность и тонкость взаимосвязей доза-реакция со значительными трудностями в определении уровней, не вызывающих воздействия, и, следовательно, также в определении переносимых воздействий. Тем не менее, такого рода исследования также продемонстрировали типы исследований и уточнения, которые необходимы для раскрытия соответствующей информации. Для большинства органических соединений количественные связи между воздействием и соответствующими неблагоприятными последствиями для здоровья пока недоступны; во многих случаях даже первичные органы-мишени точно не известны. Кроме того, оценка данных о токсичности и концентрации биомаркеров часто осложняется воздействием смесей веществ, а не воздействием одного соединения в данный момент времени.

Перед применением биомаркера в целях гигиены труда необходимо принять некоторые дополнительные меры. Во-первых, биомаркер должен отражать только субклинические и обратимые изменения. Во-вторых, учитывая, что результаты биомаркеров можно интерпретировать с точки зрения риска для здоровья, должны быть доступны профилактические меры, которые следует считать реалистичными в случае, если данные биомаркеров указывают на необходимость снижения воздействия. В-третьих, практическое использование биомаркера должно в целом рассматриваться как этически приемлемое.

Измерения промышленной гигиены можно сравнить с применимыми пределами воздействия. Точно так же результаты по биомаркерам воздействия или биомаркерам воздействия можно сравнивать с пределами биологического действия, иногда называемыми индексами биологического воздействия. Такие ограничения должны быть основаны на лучших советах клиницистов и ученых из соответствующих дисциплин, а ответственные администраторы в качестве «менеджеров риска» должны учитывать соответствующие этические, социальные, культурные и экономические факторы. Научная основа должна, по возможности, включать зависимости доза-реакция, дополненные информацией о вариациях восприимчивости в группе риска. В некоторых странах работники и представители общественности участвуют в процессе установления стандартов и вносят важный вклад, особенно когда научная неопределенность значительна. Одна из основных неопределенностей заключается в том, как определить неблагоприятное воздействие на здоровье, которое следует предотвратить, например, представляет ли образование аддукта в качестве биомаркера воздействия само по себе неблагоприятное воздействие (т. е. биомаркер воздействия), которое следует предотвратить. Трудные вопросы, вероятно, возникнут при принятии решения о том, является ли этически оправданным для одного и того же соединения разные пределы случайного воздействия, с одной стороны, и профессионального воздействия, с другой.

Информация, полученная при использовании биомаркеров, как правило, должна передаваться лицам, обследуемым в рамках отношений между врачом и пациентом. Этические проблемы должны быть особенно рассмотрены в связи с высоко экспериментальным анализом биомаркеров, который в настоящее время не может быть подробно интерпретирован с точки зрения реальных рисков для здоровья. Например, для населения в целом в настоящее время существует ограниченное руководство в отношении интерпретации биомаркеров воздействия, отличных от концентрации свинца в крови. Также важна уверенность в полученных данных (т.е. был ли сделан соответствующий отбор проб и использовались ли надежные процедуры обеспечения качества в задействованной лаборатории). Дополнительная область особого беспокойства связана с индивидуальной гиперчувствительностью. Эти вопросы необходимо учитывать при предоставлении обратной связи по результатам исследования.

Все слои общества, затронутые или заинтересованные в проведении исследования биомаркеров, должны быть вовлечены в процесс принятия решений о том, как обращаться с информацией, полученной в ходе исследования. Конкретные процедуры для предотвращения или преодоления неизбежных этических конфликтов должны быть разработаны в правовых и социальных рамках региона или страны. Однако каждая ситуация представляет собой отдельный набор вопросов и подводных камней, и невозможно разработать единую процедуру участия общественности, которая охватывала бы все области применения биомаркеров воздействия.

Назад

Изучение и характеристика токсических свойств химических и других агентов часто проводится на основе конкретных органов и систем органов. В этой главе для подробного обсуждения были выбраны две мишени: иммунная система и ген. Эти примеры были выбраны для представления сложной системы органов-мишеней и молекулярной мишени внутри клеток. Для более всестороннего обсуждения токсикологии органов-мишеней читатель может обратиться к стандартным текстам по токсикологии, таким как Casarett and Doull и Hayes. Международная программа по химической безопасности (IPCS) также опубликовала несколько документов с критериями по токсикологии органов-мишеней по системам органов.

Токсикологические исследования органов-мишеней обычно проводятся на основе информации, указывающей на потенциальные специфические токсические эффекты вещества, либо из эпидемиологических данных, либо из исследований общей острой или хронической токсичности, либо на основе особых соображений по защите определенных функций органов, таких как как размножение или развитие плода. В некоторых случаях законодательные органы прямо предписывают проводить тесты на токсичность для конкретных органов-мишеней, например, тесты на нейротоксичность в соответствии с законом США о пестицидах (см. Закон о контроле над веществами (см. «Принципы определения опасности: японский подход»).

Как обсуждалось в разделе «Орган-мишень и критические эффекты», идентификация критического органа основана на обнаружении органа или системы органов, которые первыми реагируют неблагоприятно или на самые низкие дозы или воздействия. Эта информация затем используется для разработки конкретных токсикологических исследований или более определенных тестов на токсичность, которые предназначены для выявления более чувствительных признаков интоксикации в органе-мишени. Токсикологические исследования органов-мишеней также могут быть использованы для определения механизмов действия, использования при оценке риска (см. «Подход Соединенных Штатов к оценке риска репродуктивных токсикантов и нейротоксических агентов»).

Методы исследования токсичности органов-мишеней

Органы-мишени можно изучать путем воздействия на интактные организмы и детального анализа функции и гистопатологии в органе-мишени или путем воздействия in vitro на клетки, срезы тканей или целые органы, поддерживаемые в течение короткого или длительного периода времени в культуре (см. токсикология: Введение и понятия»). В некоторых случаях ткани человека также могут быть доступны для изучения токсичности органов-мишеней, что может дать возможность проверить предположения о межвидовой экстраполяции. Однако следует иметь в виду, что такие исследования не дают информации об относительной токсикокинетике.

В целом, исследования токсичности органа-мишени имеют следующие общие характеристики: подробное гистопатологическое исследование органа-мишени, включая патологоанатомическое исследование, массу ткани и исследование фиксированных тканей; биохимические исследования критических путей в органе-мишени, таких как важные ферментные системы; функциональные исследования способности органов и клеточных составляющих выполнять ожидаемые метаболические и другие функции; и анализ биомаркеров воздействия и ранних эффектов в клетках органов-мишеней.

Детальное знание физиологии органов-мишеней, биохимии и молекулярной биологии может быть включено в исследования органов-мишеней. Например, поскольку синтез и секреция низкомолекулярных белков являются важным аспектом почечной функции, исследования нефротоксичности часто уделяют этим параметрам особое внимание (IPCS 1991). Поскольку межклеточная коммуникация является фундаментальным процессом функционирования нервной системы, исследования органов-мишеней при нейротоксичности могут включать подробные нейрохимические и биофизические измерения синтеза, поглощения, хранения, высвобождения и связывания нейротрансмиттеров с рецепторами, а также электрофизиологические измерения изменений в мембранах. потенциал, связанный с этими событиями.

Большое внимание уделяется разработке методов in vitro для определения токсичности органов-мишеней с целью замены или сокращения использования целых животных. Существенные успехи в этих методах были достигнуты в отношении репродуктивных токсикантов (Heindel and Chapin 1993).

Таким образом, исследования токсичности для органов-мишеней обычно проводятся как тест более высокого порядка для определения токсичности. Выбор конкретных органов-мишеней для дальнейшей оценки зависит от результатов скрининговых тестов, таких как острые или субхронические тесты, используемые ОЭСР и Европейским Союзом; некоторые органы-мишени и системы органов могут быть априори кандидатами на специальное исследование из-за опасений по предотвращению определенных типов неблагоприятных последствий для здоровья.

Назад

Функции иммунной системы заключаются в защите организма от вторжения инфекционных агентов и обеспечении иммунного надзора за возникающими опухолевыми клетками. Он имеет неспецифическую первую линию защиты, которая сама может инициировать эффекторные реакции, и приобретенную специфическую ветвь, в которой лимфоциты и антитела несут специфичность распознавания и последующей реактивности по отношению к антигену.

Иммунотоксикология была определена как «дисциплина, занимающаяся изучением событий, которые могут привести к нежелательным эффектам в результате взаимодействия ксенобиотиков с иммунной системой. Эти нежелательные явления могут быть следствием (1) прямого и/или косвенного воздействия ксенобиотика (и/или продукта его биотрансформации) на иммунную систему или (2) иммунологического ответа хозяина на соединение и/или его метаболит(ы) или антигены хозяина, модифицированные соединением или его метаболитами» (Berlin et al., 1987).

Когда иммунная система действует как пассивная мишень для химических воздействий, результатом может быть снижение устойчивости к инфекциям и некоторым формам неоплазии или нарушение регуляции/стимуляции иммунной системы, что может усугубить аллергию или аутоиммунитет. В случае, когда иммунная система реагирует на антигенную специфичность ксенобиотика или антигена хозяина, модифицированного соединением, токсичность может проявляться в виде аллергии или аутоиммунных заболеваний.

Были разработаны животные модели для исследования подавления иммунитета, вызванного химическими веществами, и ряд этих методов прошел валидацию (Burleson, Munson, and Dean, 1995; IPCS, 1996). В целях тестирования применяется многоуровневый подход, позволяющий сделать адекватный выбор из подавляющего числа доступных анализов. Как правило, целью первого уровня является выявление потенциальных иммунотоксикантов. Если выявлена ​​потенциальная иммунотоксичность, проводится второй уровень тестирования для подтверждения и дальнейшей характеристики наблюдаемых изменений. Исследования третьего уровня включают специальные исследования механизма действия соединения. Некоторые ксенобиотики были идентифицированы как иммунотоксиканты, вызывающие иммуносупрессию в таких исследованиях на лабораторных животных.

База данных о нарушениях иммунной функции у человека химическими веществами окружающей среды ограничена (Descotes, 1986; Подкомитет NRC по иммунотоксикологии, 1992). В клинических и эпидемиологических исследованиях по изучению влияния этих химических веществ на здоровье человека использованию маркеров иммунотоксичности уделялось мало внимания. Такие исследования проводились нечасто, и их интерпретация часто не позволяет сделать однозначные выводы, например, из-за неконтролируемого характера воздействия. Поэтому в настоящее время оценка иммунотоксичности у грызунов с последующей экстраполяцией на человека лежит в основе решений относительно опасности и риска.

Реакции гиперчувствительности, особенно аллергическая астма и контактный дерматит, являются серьезной проблемой гигиены труда в промышленно развитых странах (Vos, Younes and Smith 1995). Феномен контактной сенсибилизации впервые был исследован на морской свинке (Andersen and Maibach, 1985). До недавнего времени этот вид был предпочтительным для прогностического тестирования. Доступны многие методы испытаний на морских свинках, наиболее часто используемыми являются тест максимизации на морских свинках и тест Бюлера на окклюзированный пластырь. Тесты на морских свинках и новые подходы, разработанные на мышах, такие как тесты на отек ушей и анализ местных лимфатических узлов, предоставляют токсикологу инструменты для оценки опасности кожной сенсибилизации. Ситуация в отношении сенсибилизации дыхательных путей совершенно иная. До сих пор не существует хорошо проверенных или общепринятых методов идентификации химических респираторных аллергенов, хотя прогресс в разработке животных моделей для исследования химической респираторной аллергии был достигнут на морских свинках и мышах.

Данные о людях показывают, что химические агенты, в частности лекарства, могут вызывать аутоиммунные заболевания (Kammüller, Bloksma and Seinen, 1989). Существует ряд экспериментальных животных моделей аутоиммунных заболеваний человека. Они включают как спонтанную патологию (например, системную красную волчанку у новозеландских черных мышей), так и аутоиммунные явления, индуцированные экспериментальной иммунизацией перекрестно-реактивным аутоантигеном (например, артрит, индуцированный адъювантом H37Ra у крыс линии Lewis). Эти модели применяются при доклинической оценке иммунодепрессантов. Очень немногие исследования рассматривали потенциал этих моделей для оценки того, усугубляет ли ксенобиотик индуцированный или врожденный аутоиммунитет. Животных моделей, пригодных для изучения способности химических веществ вызывать аутоиммунные заболевания, практически не существует. Одной моделью, которая используется в ограниченной степени, является анализ подколенных лимфатических узлов у мышей. Как и у людей, генетические факторы играют решающую роль в развитии аутоиммунных заболеваний (АЗ) у лабораторных животных, что ограничивает прогностическую ценность таких тестов.

Иммунная система

Основной функцией иммунной системы является защита от бактерий, вирусов, паразитов, грибков и неопластических клеток. Это достигается действием различных типов клеток и их растворимых медиаторов в точно настроенном концерте. Защиту хозяина можно условно разделить на неспецифическую или врожденную резистентность и специфический или приобретенный иммунитет, опосредованный лимфоцитами (Roitt, Brostoff and Male 1989).

Компоненты иммунной системы присутствуют во всем организме (Jones et al., 1990). Компартмент лимфоцитов находится в лимфоидных органах (рис. 1). Костный мозг и вилочковая железа классифицируются как первичные или центральные лимфоидные органы; вторичные или периферические лимфоидные органы включают лимфатические узлы, селезенку и лимфоидную ткань вдоль секреторных поверхностей, таких как желудочно-кишечный тракт и дыхательные пути, так называемую лимфоидную ткань, ассоциированную со слизистой оболочкой (MALT). Около половины лимфоцитов организма в любой момент времени находятся в MALT. Кроме того, кожа является важным органом для индукции иммунных ответов на антигены, присутствующие на коже. Важную роль в этом процессе играют эпидермальные клетки Лангерганса, обладающие антигенпрезентирующей функцией.

Рисунок 1. Первичные и вторичные лимфоидные органы и ткани

Фагоцитарные клетки линии моноцитов/макрофагов, называемые системой мононуклеарных фагоцитов (MPS), встречаются в лимфоидных органах, а также в экстранодальных местах; экстранодальные фагоциты включают клетки Купфера в печени, альвеолярные макрофаги в легких, мезангиальные макрофаги в почках и глиальные клетки в головном мозге. Полиморфноядерные лейкоциты (ПЯЛ) присутствуют в основном в крови и костном мозге, но накапливаются в очагах воспаления.

Неспецифическая защита

Первая линия защиты от микроорганизмов осуществляется физическим и химическим барьером, таким как кожа, дыхательные пути и пищеварительный тракт. Этому барьеру помогают неспецифические защитные механизмы, включающие фагоцитарные клетки, такие как макрофаги и полиморфноядерные лейкоциты, которые способны убивать патогены, и естественные клетки-киллеры, которые могут лизировать опухолевые клетки и инфицированные вирусом клетки. Система комплемента и некоторые микробные ингибиторы (например, лизоцим) также принимают участие в неспецифическом ответе.

Специфический иммунитет

После первоначального контакта хозяина с возбудителем индуцируются специфические иммунные реакции. Отличительной чертой этой второй линии защиты является специфическое распознавание детерминант, так называемых антигенов или эпитопов возбудителей, рецепторами на клеточной поверхности В- и Т-лимфоцитов. После взаимодействия со специфическим антигеном клетка, несущая рецептор, стимулируется к пролиферации и дифференцировке с образованием клона клеток-потомков, специфичных для вызывающего антигена. Специфические иммунные реакции помогают неспецифической защите от патогенов, стимулируя эффективность неспецифических реакций. Фундаментальной характеристикой специфического иммунитета является развитие памяти. Вторичный контакт с тем же антигеном вызывает более быструю и сильную, но хорошо регулируемую реакцию.

Геном не обладает способностью нести коды массива антигенных рецепторов, достаточные для распознавания количества антигенов, которые могут встретиться. Репертуар специфичности развивается в процессе генных перестроек. Это случайный процесс, в ходе которого возникают различные особенности. Это включает в себя особенности для собственных компонентов, которые нежелательны. Процесс селекции, происходящий в тимусе (Т-клетках) или костном мозге (В-клетках), устраняет эти нежелательные особенности.

Нормальная иммунная эффекторная функция и гомеостатическая регуляция иммунного ответа зависят от множества растворимых продуктов, известных под общим названием цитокины, которые синтезируются и секретируются лимфоцитами и другими типами клеток. Цитокины оказывают плейотропное действие на иммунные и воспалительные реакции. Кооперация между различными клеточными популяциями необходима для иммунного ответа — регуляции ответов антител, накопления иммунных клеток и молекул в очагах воспаления, инициации ответов острой фазы, контроля цитотоксической функции макрофагов и многих других процессов, играющих ключевую роль в резистентности хозяина. . На них влияют, а во многих случаях и зависят от цитокинов, действующих индивидуально или совместно.

Различают два направления специфического иммунитета — гуморальный иммунитет и клеточно-опосредованный или клеточный иммунитет:

Гуморальный иммунитет. В гуморальном плече В-лимфоциты стимулируются после распознавания антигена рецепторами на поверхности клетки. Рецепторами антигенов на В-лимфоцитах являются иммуноглобулины (Ig). Зрелые В-клетки (плазматические клетки) начинают вырабатывать антиген-специфические иммуноглобулины, которые действуют как антитела в сыворотке или на поверхности слизистых оболочек. Существует пять основных классов иммуноглобулинов: (1) IgM, пентамерный Ig с оптимальной агглютинирующей способностью, который сначала вырабатывается после антигенной стимуляции; (2) IgG, основной Ig в циркуляции, который может проникать через плаценту; (3) IgA, секреторный Ig для защиты поверхностей слизистых оболочек; (4) IgE, Ig, фиксирующийся на тучных клетках или базофильных гранулоцитах, участвующих в реакциях гиперчувствительности немедленного типа, и (5) IgD, чья основная функция заключается в качестве рецептора на В-лимфоцитах.

Клеточный иммунитет. Клеточная часть специфической иммунной системы опосредована Т-лимфоцитами. Эти клетки также имеют антигенные рецепторы на своих мембранах. Они распознают антиген, если он представлен антигенпрезентирующими клетками в контексте антигенов гистосовместимости. Следовательно, эти клетки имеют ограничение в дополнение к антигенной специфичности. Т-клетки функционируют как клетки-хелперы для различных (в том числе гуморальных) иммунных ответов, опосредуют рекрутирование воспалительных клеток и могут, как цитотоксические Т-клетки, убивать клетки-мишени после антиген-специфического распознавания.

Механизмы иммунотоксичности

иммунодепрессия

Эффективная резистентность хозяина зависит от функциональной целостности иммунной системы, которая, в свою очередь, требует, чтобы составляющие клетки и молекулы, управляющие иммунным ответом, были доступны в достаточном количестве и в функциональной форме. Врожденные иммунодефициты у людей часто характеризуются дефектами определенных линий стволовых клеток, что приводит к нарушению или отсутствию продукции иммунных клеток. По аналогии с врожденными и приобретенными иммунодефицитами человека, иммуносупрессия, вызванная химическими препаратами, может быть вызвана просто уменьшением количества функциональных клеток (IPCS 1996). Отсутствие или сниженное количество лимфоцитов может иметь более или менее выраженное влияние на иммунный статус. Некоторые состояния иммунодефицита и тяжелая иммуносупрессия, которые могут возникнуть при трансплантации или цитостатической терапии, были связаны, в частности, с увеличением случаев оппортунистических инфекций и некоторых неопластических заболеваний. Инфекции могут быть бактериальными, вирусными, грибковыми или протозойными, а преобладающий тип инфекции зависит от сопутствующего иммунодефицита. Можно ожидать, что воздействие иммунодепрессивных химических веществ из окружающей среды приведет к более тонким формам иммунодепрессии, которые может быть трудно обнаружить. Это может привести, например, к увеличению числа случаев таких инфекций, как грипп или простуда.

Ввиду сложности иммунной системы с большим разнообразием клеток, медиаторов и функций, образующих сложную и взаимодействующую сеть, иммунотоксические соединения имеют многочисленные возможности для оказания воздействия. Хотя природа начальных поражений, вызванных многими иммунотоксичными химическими веществами, еще не выяснена, появляется все больше доступной информации, в основном полученной в результате исследований на лабораторных животных, относительно иммунобиологических изменений, которые приводят к угнетению иммунной функции (Dean et al., 1994). . Токсические эффекты могут проявляться в следующих критических функциях (и приведены некоторые примеры иммунотоксических соединений, влияющих на эти функции):

•  развитие и экспансия различных популяций стволовых клеток (бензол оказывает иммунотоксическое действие на уровне стволовых клеток, вызывая лимфоцитопению)
•  пролиферация различных лимфоидных и миелоидных клеток, а также поддерживающих тканей, в которых эти клетки созревают и функционируют (иммунотоксические оловоорганические соединения подавляют пролиферативную активность лимфоцитов в коре тимуса за счет прямой цитотоксичности; тимотоксическое действие 2,3,7,8-тетрахлор -дибензо-п-диоксин (ТХДД) и родственные соединения, вероятно, обусловлены нарушением функции эпителиальных клеток тимуса, а не прямой токсичностью для тимоцитов)
•  захват, процессинг и презентация антигена макрофагами и другими антигенпрезентирующими клетками (одной из мишеней 7,12-диметилбенз(а)антрацена (ДМБА) и свинца является презентация антигена макрофагами; мишенью ультрафиолетового излучения является антиген- представляя клетку Лангерганса)
•  регуляторная функция Т-хелперов и Т-супрессоров (функция Т-хелперов нарушается оловоорганическими соединениями, алдикарбом, полихлорированными бифенилами (ПХБ), ТХДД и ДМБА; функция Т-супрессоров снижается при лечении низкими дозами циклофосфамида)
•  продукция различных цитокинов или интерлейкинов (бензо(а)пирен (БП) подавляет продукцию интерлейкина-1; ультрафиолетовое излучение изменяет продукцию цитокинов кератиноцитами)
•  синтез различных классов иммуноглобулинов IgM и IgG подавляется после обработки ПХБ и оксидом трибутилолова (ТБТ) и увеличивается после воздействия гексахлорбензола (ГХБ).
•  регуляция и активация комплемента (под влиянием ТХДД)
•  цитотоксическая функция Т-клеток (3-метилхолантрен (3-MC), ДМБА и ТХДД подавляют активность цитотоксических Т-клеток)
•  функция естественных клеток-киллеров (NK) (активность легочных NK подавляется озоном; активность NK селезенки снижается никелем)
•  хемотаксис макрофагов и полиморфноядерных лейкоцитов и цитотоксические функции (озон и диоксид азота нарушают фагоцитарную активность альвеолярных макрофагов).

Аллергия

Аллергия можно определить как неблагоприятные последствия для здоровья, возникающие в результате индукции и вызывания специфических иммунных реакций. Когда реакции гиперчувствительности развиваются без участия иммунной системы, термин псевдоаллергия используется. В контексте иммунотоксикологии аллергия возникает в результате специфического иммунного ответа на представляющие интерес химические вещества и лекарства. Способность химического вещества повышать чувствительность людей обычно связана с его способностью ковалентно связываться с белками организма. Аллергические реакции могут принимать различные формы, и они различаются как лежащими в их основе иммунологическими механизмами, так и скоростью реакции. Выделяют четыре основных типа аллергических реакций: Реакции гиперчувствительности I типа, которые вызываются антителами IgE и симптомы которых проявляются в течение нескольких минут после воздействия на сенсибилизированного человека. Реакции гиперчувствительности типа II возникают в результате повреждения или разрушения клеток-хозяев антителами. В этом случае симптомы проявляются в течение нескольких часов. Реакции гиперчувствительности типа III, или реакции Артюса, также опосредованы антителами, но против растворимого антигена, и являются результатом местного или системного действия иммунных комплексов. Реакции гиперчувствительности типа IV или замедленного типа вызываются Т-лимфоцитами, и обычно симптомы развиваются через 24–48 часов после воздействия на сенсибилизированного человека.

Двумя типами химической аллергии, наиболее важными для гигиены труда, являются контактная чувствительность или кожная аллергия и аллергия дыхательных путей.

Контактная гиперчувствительность. Большое количество химических веществ способно вызвать сенсибилизацию кожи. После местного воздействия химического аллергена на восприимчивого человека в дренирующих лимфатических узлах индуцируется ответ Т-лимфоцитов. В коже аллерген прямо или косвенно взаимодействует с эпидермальными клетками Лангерганса, которые переносят химическое вещество в лимфатические узлы и представляют его в иммуногенной форме чувствительным Т-лимфоцитам. Активированные аллергеном Т-лимфоциты пролиферируют, что приводит к клональной экспансии. Человек теперь сенсибилизирован и будет реагировать на повторное воздействие на кожу того же химического вещества более агрессивным иммунным ответом, что приводит к аллергическому контактному дерматиту. Кожная воспалительная реакция, характерная для аллергического контактного дерматита, является вторичной по отношению к распознаванию аллергена в коже специфическими Т-лимфоцитами. Эти лимфоциты активируются, выделяют цитокины и вызывают локальное накопление других мононуклеарных лейкоцитов. Симптомы развиваются примерно через 24–48 часов после воздействия на сенсибилизированного человека, поэтому аллергический контактный дерматит представляет собой форму гиперчувствительности замедленного типа. Общие причины аллергического контактного дерматита включают органические химические вещества (такие как 2,4-динитрохлорбензол), металлы (такие как никель и хром) и растительные продукты (такие как урушиол из ядовитого плюща).

Респираторная гиперчувствительность. Респираторная гиперчувствительность обычно считается реакцией гиперчувствительности I типа. Однако реакции поздней фазы и более хронические симптомы, связанные с астмой, могут включать клеточно-опосредованные (тип IV) иммунные процессы. На острые симптомы, связанные с респираторной аллергией, влияют антитела IgE, выработка которых провоцируется воздействием на восприимчивого человека индуцирующего химического аллергена. Антитело IgE распределяется системно и связывается через мембранные рецепторы с тучными клетками, которые находятся в васкуляризированных тканях, включая дыхательные пути. После вдыхания того же химического вещества будет вызвана реакция гиперчувствительности дыхательных путей. Аллерген связывается с белком и связывается и образует перекрестные связи с IgE-антителом, связанным с тучными клетками. Это, в свою очередь, вызывает дегрануляцию тучных клеток и высвобождение медиаторов воспаления, таких как гистамин и лейкотриены. Такие медиаторы вызывают бронхоконстрикцию и вазодилатацию, что приводит к симптомам респираторной аллергии; астма и/или ринит. Известно, что химические вещества, вызывающие респираторную гиперчувствительность у человека, включают ангидриды кислот (такие как тримеллитовый ангидрид), некоторые диизоцианаты (такие как толуолдиизоцианат), соли платины и некоторые реактивные красители. Кроме того, известно, что хроническое воздействие бериллия вызывает гиперчувствительность легких.

аутоиммунная реакция

аутоиммунная реакция можно определить как стимуляцию специфических иммунных ответов, направленных против эндогенных «собственных» антигенов. Индуцированный аутоиммунитет может быть результатом либо изменения баланса регуляторных Т-лимфоцитов, либо ассоциации ксенобиотика с нормальными тканевыми компонентами, что делает их иммуногенными («измененное самоощущение»). Лекарства и химические вещества, которые, как известно, случайно вызывают или усугубляют эффекты, такие как эффекты аутоиммунного заболевания (AD) у восприимчивых людей, представляют собой соединения с низкой молекулярной массой (молекулярная масса от 100 до 500), которые, как правило, сами по себе считаются неиммуногенными. Механизм БА при химическом воздействии в основном неизвестен. Заболевание может быть вызвано непосредственно посредством циркулирующих антител, косвенно через образование иммунных комплексов или как следствие клеточно-опосредованного иммунитета, но, вероятно, происходит за счет комбинации механизмов. Патогенез наиболее известен при иммунных гемолитических расстройствах, вызванных лекарствами:

•  Лекарство может прикрепляться к мембране эритроцитов и взаимодействовать со специфическими антителами.
•  Лекарство может изменить мембрану эритроцита, так что иммунная система расценивает клетку как чужеродную.
•  Лекарство и его специфическое антитело образуют иммунные комплексы, которые прикрепляются к мембране эритроцитов, вызывая повреждение.
•  Сенсибилизация эритроцитов происходит за счет продукции аутоантител к эритроцитам.

Было обнаружено, что различные химические вещества и лекарства, особенно последние, вызывают аутоиммунные реакции (Kamüller, Bloksma and Seinen, 1989). Профессиональное воздействие химических веществ может случайно привести к синдромам, подобным БА. Воздействие мономерного винилхлорида, трихлорэтилена, перхлорэтилена, эпоксидных смол и кварцевой пыли может вызвать склеродермоподобные синдромы. Синдром, подобный системной красной волчанке (СКВ), был описан после воздействия гидразина. Воздействие толуолдиизоцианата было связано с индукцией тромбоцитопенической пурпуры. Тяжелые металлы, такие как ртуть, вызывают некоторые случаи иммунокомплексного гломерулонефрита.

Оценка человеческого риска

Оценка иммунного статуса человека проводится в основном с использованием периферической крови для анализа гуморальных веществ, таких как иммуноглобулины и комплемент, и лейкоцитов крови для определения состава субпопуляций и функциональности субпопуляций. Эти методы обычно аналогичны тем, которые используются для исследования гуморального и клеточного иммунитета, а также неспецифической резистентности у больных с подозрением на врожденный иммунодефицит. Для эпидемиологических исследований (например, групп населения, подвергающихся профессиональному воздействию) параметры следует выбирать на основе их прогностической ценности в популяциях людей, подтвержденных животных моделях и лежащей в основе биологии маркеров (см. таблицу 1). Стратегия скрининга иммунотоксических эффектов после (случайного) воздействия загрязнителей окружающей среды или других токсикантов во многом зависит от обстоятельств, таких как тип ожидаемого иммунодефицита, время между воздействием и оценкой иммунного статуса, степень воздействия и количество подвергшихся воздействию лиц. Процесс оценки иммунотоксического риска того или иного ксенобиотика у человека крайне сложен, а часто и невозможен, во многом из-за наличия различных мешающих факторов эндогенного или экзогенного происхождения, влияющих на реакцию индивидов на токсическое поражение. Это особенно верно для исследований, изучающих роль химического воздействия при аутоиммунных заболеваниях, где решающую роль играют генетические факторы.

Таблица 1. Классификация тестов на иммунные маркеры

Поскольку адекватные данные о людях редко доступны, оценка риска химической иммуносупрессии у людей в большинстве случаев основана на исследованиях на животных. Идентификация потенциальных иммунотоксичных ксенобиотиков проводится главным образом в контролируемых исследованиях на грызунах. В этом отношении исследования воздействия in vivo представляют собой оптимальный подход к оценке иммунотоксического потенциала соединения. Это связано с многофакторной и сложной природой иммунной системы и иммунных реакций. Исследования in vitro приобретают все большее значение для выяснения механизмов иммунотоксичности. Кроме того, исследуя эффекты соединения с использованием клеток животного и человеческого происхождения, можно получить данные для сравнения видов, которые можно использовать в подходе «параллелограмм» для улучшения процесса оценки риска. Если доступны данные по трем краеугольным камням параллелограмма (животное in vivo, а также животное и человек in vitro), может быть легче предсказать результат для оставшегося краеугольного камня, то есть риск для человека.

Когда оценка риска индуцированной химическими препаратами иммуносупрессии должна основываться исключительно на данных исследований на животных, можно применить подход при экстраполяции на человека путем применения факторов неопределенности к уровню отсутствия наблюдаемых побочных эффектов (NOAEL). Этот уровень может быть основан на параметрах, определенных в соответствующих моделях, таких как анализ устойчивости хозяина и оценка реакций гиперчувствительности и выработки антител in vivo. В идеале актуальность этого подхода к оценке риска требует подтверждения исследованиями на людях. Такие исследования должны сочетать идентификацию и измерение токсиканта, эпидемиологические данные и оценку иммунного статуса.

Для прогнозирования контактной гиперчувствительности доступны модели морских свинок, которые используются для оценки риска с 1970-х годов. Хотя эти тесты чувствительны и воспроизводимы, они имеют ограничения, поскольку они зависят от субъективной оценки; это можно преодолеть с помощью новых и более количественных методов, разработанных на мышах. Что касается химической гиперчувствительности, вызванной вдыханием или приемом внутрь аллергенов, следует разработать и оценить тесты с точки зрения их прогностической ценности у человека. Когда дело доходит до установления безопасных уровней профессионального воздействия потенциальных аллергенов, необходимо учитывать двухфазную природу аллергии: фазу сенсибилизации и фазу возбуждения. Концентрация, необходимая для того, чтобы вызвать аллергическую реакцию у ранее сенсибилизированного человека, значительно ниже, чем концентрация, необходимая для того, чтобы вызвать сенсибилизацию у иммунологически наивного, но восприимчивого человека.

Поскольку животных моделей для прогнозирования аутоиммунитета, индуцированного химическими веществами, практически не существует, следует уделить особое внимание разработке таких моделей. Для разработки таких моделей наши знания о аутоиммунитете, вызванном химическими веществами у людей, должны быть расширены, включая изучение генетических маркеров и маркеров иммунной системы для выявления восприимчивых людей. У людей, подвергшихся воздействию препаратов, вызывающих аутоиммунитет, есть такая возможность.

Назад

Генетическая токсикология, по определению, является изучением того, как химические или физические агенты влияют на сложный процесс наследственности. Генотоксичные химические вещества определяются как соединения, способные модифицировать наследственный материал живых клеток. Вероятность того, что конкретное химическое вещество вызовет генетическое повреждение, неизбежно зависит от нескольких переменных, включая уровень воздействия химического вещества на организм, распределение и удержание химического вещества после его поступления в организм, эффективность систем метаболической активации и/или детоксикации в организме. ткани-мишени и реактивность химического вещества или его метаболитов с критическими макромолекулами внутри клеток. Вероятность того, что генетическое повреждение вызовет заболевание, в конечном счете зависит от характера повреждения, способности клетки восстанавливать или усиливать генетическое повреждение, возможности выражения любого вызванного изменения и способности организма распознавать и подавлять размножение аберрантные клетки.

У высших организмов наследственная информация организована в хромосомах. Хромосомы состоят из плотно сжатых нитей ДНК, связанных с белками. Внутри одной хромосомы каждая молекула ДНК существует в виде пары длинных неразветвленных цепей нуклеотидных субъединиц, соединенных вместе фосфодиэфирными связями, соединяющими 5-углеродный фрагмент одной дезоксирибозы с 3-м углеродом следующего (рис. 1). Кроме того, к каждой субъединице дезоксирибозы присоединено одно из четырех различных нуклеотидных оснований (аденин, цитозин, гуанин или тимин), как бусинки на нитке. В трехмерном пространстве каждая пара нитей ДНК образует двойную спираль, все основания которой ориентированы внутрь спирали. Внутри спирали каждое основание связано с комплементарным ему основанием на противоположной цепи ДНК; водородная связь диктует прочное нековалентное соединение аденина с тимином и гуанина с цитозином (рис. 1). Поскольку последовательность нуклеотидных оснований комплементарна по всей длине дуплексной молекулы ДНК, обе нити несут по существу одинаковую генетическую информацию. Фактически, во время репликации ДНК каждая цепь служит шаблоном для производства новой партнерской цепи.

Рис. 1. Первичная (а), вторичная (б) и третичная (в) организация наследственной информации человека

Используя РНК и набор различных белков, клетка в конечном итоге расшифровывает информацию, закодированную линейной последовательностью оснований в определенных областях ДНК (генах), и производит белки, которые необходимы для основного выживания клетки, а также для нормального роста и дифференцировки. По сути, нуклеотиды функционируют как биологический алфавит, который используется для кодирования аминокислот, строительных блоков белков.

Когда вставляются неправильные нуклеотиды или нуклеотиды теряются, или когда во время синтеза ДНК добавляются ненужные нуклеотиды, такая ошибка называется мутацией. Подсчитано, что менее одной мутации происходит на каждые 10⁹ нуклеотидов, включенных в ходе нормальной репликации клеток. Хотя мутации не обязательно вредны, изменения, вызывающие инактивацию или сверхэкспрессию важных генов, могут приводить к различным нарушениям, включая рак, наследственные заболевания, аномалии развития, бесплодие и эмбриональную или перинатальную смерть. Очень редко мутация может привести к увеличению выживаемости; такие случаи лежат в основе естественного отбора.

Хотя некоторые химические вещества реагируют непосредственно с ДНК, для большинства требуется метаболическая активация. В последнем случае электрофильные интермедиаты, такие как эпоксиды или ионы карбония, в конечном счете ответственны за индукцию повреждений в различных нуклеофильных участках генетического материала (рис. 2). В других случаях генотоксичность опосредуется побочными продуктами взаимодействия соединений с внутриклеточными липидами, белками или кислородом.

Рис. 2. Биоактивация: а) бенз(а)пирена; и б) N-нитрозодиметиламин

Из-за их относительной распространенности в клетках белки являются наиболее частой мишенью взаимодействия токсикантов. Однако модификация ДНК вызывает большую озабоченность из-за центральной роли этой молекулы в регуляции роста и дифференцировки через несколько поколений клеток.

На молекулярном уровне электрофильные соединения имеют тенденцию атаковать кислород и азот в ДНК. Сайты, наиболее подверженные модификации, показаны на рис. 3. Хотя атомы кислорода в фосфатных группах в остове ДНК также являются мишенями для химической модификации, считается, что повреждение оснований имеет большее значение с биологической точки зрения, поскольку эти группы считаются основными информационными. элементов в молекуле ДНК.

Рисунок 3. Первичные участки химически индуцированного повреждения ДНК.

Соединения, содержащие один электрофильный фрагмент, обычно проявляют генотоксичность, образуя моноаддукты в ДНК. Точно так же соединения, которые содержат два или более реактивных фрагмента, могут реагировать с двумя разными нуклеофильными центрами и тем самым образовывать внутри- или межмолекулярные поперечные связи в генетическом материале (рис. 4). Межцепочечные сшивки ДНК-ДНК и ДНК-белки могут быть особенно цитотоксическими, поскольку они могут образовывать полные блоки репликации ДНК. По понятным причинам смерть клетки исключает возможность ее мутации или неопластической трансформации. Генотоксические агенты также могут действовать, вызывая разрывы в фосфодиэфирном остове или между основаниями и сахарами (с образованием базовых участков) в ДНК. Такие разрывы могут быть прямым результатом химической реактивности в месте повреждения или могут возникать во время репарации одного из вышеупомянутых типов повреждения ДНК.

Рисунок 4. Различные типы повреждений комплекса белок-ДНК

За последние тридцать-сорок лет было разработано множество методов для мониторинга типа генетического повреждения, вызванного различными химическими веществами. Такие анализы подробно описаны в других разделах этой главы. Энциклопедия.

Неправильная репликация «микроповреждений», таких как моноаддукты, абазические сайты или одноцепочечные разрывы, может в конечном итоге привести к заменам пар нуклеотидных оснований или вставкам или делециям коротких полинуклеотидных фрагментов в хромосомной ДНК. Напротив, «макропоражения», такие как объемные аддукты, перекрестные связи или двухцепочечные разрывы, могут вызывать увеличение, потерю или перестройку относительно больших фрагментов хромосом. В любом случае последствия могут быть разрушительными для организма, поскольку любое из этих событий может привести к гибели клеток, потере функции или злокачественному перерождению клеток. Как именно повреждение ДНК вызывает рак, в значительной степени неизвестно. В настоящее время считается, что этот процесс может включать неадекватную активацию протоонкогенов, таких как мой с и РАНи/или инактивация недавно идентифицированных генов-супрессоров опухолей, таких как р53. Аномальная экспрессия любого типа гена нарушает нормальные клеточные механизмы контроля клеточной пролиферации и/или дифференцировки.

Преобладание экспериментальных данных указывает на то, что развитие рака после воздействия электрофильных соединений является относительно редким событием. Частично это можно объяснить внутренней способностью клетки распознавать и восстанавливать поврежденную ДНК или неспособностью клеток с поврежденной ДНК выжить. Во время восстановления поврежденное основание, нуклеотид или короткий участок нуклеотидов, окружающих место повреждения, удаляются, и (используя противоположную цепь в качестве матрицы) синтезируется и сплайсируется новый фрагмент ДНК. Чтобы быть эффективной, репарация ДНК должна происходить с большой точностью до клеточного деления, до возможности распространения мутации.

Клинические исследования показали, что у людей с наследственными дефектами в способности восстанавливать поврежденную ДНК часто развивается рак и/или аномалии развития в раннем возрасте (таблица 1). Такие примеры дают убедительные доказательства связи накопления повреждений ДНК с болезнями человека. Точно так же агенты, которые способствуют пролиферации клеток (такие как ацетат тетрадеканоилфорбола), часто усиливают канцерогенез. Для этих соединений повышенная вероятность неопластической трансформации может быть прямым следствием уменьшения времени, доступного клетке для адекватной репарации ДНК.

Таблица 1. Наследственные, склонные к раку заболевания, которые, по-видимому, связаны с дефектами репарации ДНК

Самые ранние теории о том, как химические вещества взаимодействуют с ДНК, восходят к исследованиям, проведенным во время разработки горчичного газа для использования в войне. Дальнейшее понимание возникло благодаря усилиям по выявлению противоопухолевых агентов, которые могли бы избирательно останавливать репликацию быстро делящихся опухолевых клеток. Возросшее общественное беспокойство по поводу опасностей в окружающей среде побудило к дополнительным исследованиям механизмов и последствий химического взаимодействия с генетическим материалом. Примеры различных типов химических веществ, обладающих генотоксичностью, представлены в таблице 2.

Таблица 2. Примеры химических веществ, проявляющих генотоксичность в клетках человека

Назад

Практически вся медицина посвящена либо предотвращению гибели клеток при таких заболеваниях, как инфаркт миокарда, инсульт, травма и шок, либо ее вызыванию, как в случае инфекционных заболеваний и рака. Поэтому важно понимать природу и механизмы вовлечения. Гибель клеток классифицируется как «случайная», то есть вызванная токсическими агентами, ишемией и т. д., или «запрограммированная», происходящая во время эмбриологического развития, включая формирование пальцев и резорбцию хвоста головастика.

Таким образом, повреждение клеток и их гибель важны как в физиологии, так и в патофизиологии. Физиологическая гибель клеток чрезвычайно важна во время эмбриогенеза и эмбрионального развития. Изучение гибели клеток во время развития привело к получению важной и новой информации о задействованной молекулярной генетике, особенно благодаря изучению развития беспозвоночных животных. У этих животных было тщательно изучено точное расположение и значение клеток, которым суждено подвергнуться клеточной гибели, и с использованием классических методов мутагенеза в настоящее время идентифицировано несколько задействованных генов. Во взрослых органах баланс между клеточной гибелью и клеточной пролиферацией контролирует размер органа. В некоторых органах, таких как кожа и кишечник, происходит постоянный обмен клеток. В коже, например, клетки дифференцируются, достигая поверхности, и, наконец, претерпевают терминальную дифференциацию и гибель клеток по мере того, как происходит ороговение с образованием сшитых оболочек.

Многие классы токсичных химических веществ способны вызывать острое повреждение клеток с последующей смертью. К ним относятся аноксия и ишемия, а также их химические аналоги, такие как цианистый калий; химические канцерогены, образующие электрофилы, ковалентно связывающиеся с белками в нуклеиновых кислотах; химические вещества-окислители, приводящие к образованию свободных радикалов и окислительному повреждению; активация комплемента; и различные ионофоры кальция. Гибель клеток также является важным компонентом химического канцерогенеза; многие полные химические канцерогены в канцерогенных дозах вызывают острый некроз и воспаление с последующей регенерацией и пренеоплазией.

Определения

Повреждение клеток

Повреждение клетки определяется как событие или стимул, такой как токсичное химическое вещество, которое нарушает нормальный гомеостаз клетки, вызывая, таким образом, ряд событий (рис. 1). Основными мишенями проиллюстрированных смертельных повреждений являются ингибирование синтеза АТФ, нарушение целостности плазматической мембраны или изъятие основных факторов роста.

Рисунок 1. Повреждение клеток

Смертельные травмы приводят к гибели клетки через разный период времени, в зависимости от температуры, типа клетки и раздражителя; или они могут быть сублетальными или хроническими, то есть повреждение приводит к изменению гомеостатического состояния, которое, хотя и ненормально, не приводит к гибели клеток (Trump and Arstila, 1971; Trump and Berezesky, 1992; Trump and Berezesky, 1995; Trump, Berezesky and Осорнио-Варгас 1981). В случае летального повреждения существует фаза, предшествующая моменту гибели клетки.

за это время клетка восстановится; однако после определенного момента времени («точки невозврата» или точки гибели клетки) устранение повреждения не приводит к выздоровлению, а вместо этого клетка подвергается деградации и гидролизу, в конечном итоге достигая физико-химического равновесия с среда. Это фаза, известная как некроз. Во время предлетальной фазы происходит несколько основных типов изменений в зависимости от клетки и типа повреждения. Они известны как апоптоз и онкоз.

Апоптоз

Апоптоз происходит от греческих слов апо, то есть вдали от и птоз, то есть упасть. Срок отпадение от происходит от того факта, что во время этого типа предлетальных изменений клетки сморщиваются и на их периферии появляются заметные вздутия. Затем пузырьки отделяются и уплывают. Апоптоз происходит в различных типах клеток после различных типов токсического повреждения (Wyllie, Kerr and Currie, 1980). Это особенно заметно в лимфоцитах, где он является преобладающим механизмом оборота клонов лимфоцитов. Полученные фрагменты приводят к базофильным тельцам, наблюдаемым внутри макрофагов в лимфатических узлах. В других органах апоптоз обычно происходит в одиночных клетках, которые быстро удаляются до и после гибели путем фагоцитоза фрагментов соседними паренхиматозными клетками или макрофагами. Апоптоз, происходящий в одиночных клетках с последующим фагоцитозом, обычно не приводит к воспалению. Перед смертью апоптотические клетки имеют очень плотный цитозоль с нормальными или конденсированными митохондриями. Эндоплазматический ретикулум (ЭР) нормальный или лишь слегка расширен. Ядерный хроматин заметно скоплен вдоль ядерной оболочки и вокруг ядрышка. Контур ядра также неправильный, и происходит фрагментация ядра. Конденсация хроматина связана с фрагментацией ДНК, которая во многих случаях происходит между нуклеосомами, что дает характерный вид лестницы при электрофорезе.

При апоптозе увеличивается [Ca²⁺]_i может стимулировать К⁺ отток приводит к усадке клеток, что, вероятно, требует АТФ. Таким образом, повреждения, которые полностью подавляют синтез АТФ, с большей вероятностью приведут к апоптозу. Устойчивое увеличение [Ca²⁺]_i имеет ряд вредных эффектов, включая активацию протеаз, эндонуклеаз и фосфолипаз. Активация эндонуклеазы приводит к одно- и двухцепочечному разрыву ДНК, что, в свою очередь, стимулирует повышение уровня p53 и рибозилирования поли-АДФ, а также ядерных белков, необходимых для репарации ДНК. Активация протеаз модифицирует ряд субстратов, включая актин и родственные белки, что приводит к образованию пузырьков. Другим важным субстратом является поли(АДФ-рибозо)полимераза (PARP), которая ингибирует репарацию ДНК. Повышенный [Са²⁺]_i также связано с активацией ряда протеинкиназ, таких как МАР-киназа, кальмодулинкиназа и др. Такие киназы участвуют в активации факторов транскрипции, которые инициируют транскрипцию непосредственно-ранних генов, например, c-fos, c-jun и c-myc, а также в активации фосфолипазы А.₂ что приводит к пермеабилизации плазматической мембраны и внутриклеточных мембран, таких как внутренняя мембрана митохондрий.

Онкоз

Онкоз, производное от греческого слова онкосНабухание названо так потому, что при этом типе предлетального изменения клетка начинает набухать почти сразу после травмы (Majno and Joris, 1995). Причиной набухания является увеличение содержания катионов в воде внутри клетки. Основным ответственным катионом является натрий, содержание которого обычно регулируется для поддержания объема клетки. Однако в отсутствие АТФ или при ингибировании Na-АТФазы плазмалеммы контроль объема теряется из-за внутриклеточного белка, а содержание натрия в воде продолжает увеличиваться. Таким образом, среди ранних событий при онкозах повышенное [Na⁺]_i что приводит к набуханию клеток и увеличению [Ca²⁺]_i в результате притока из внеклеточного пространства или высвобождения из внутриклеточных запасов. Это приводит к набуханию цитозоля, набуханию эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи, а также к образованию водянистых пузырьков вокруг клеточной поверхности. Митохондрии сначала подвергаются конденсации, но позже и они обнаруживают высокоамплитудное набухание из-за повреждения внутренней митохондриальной мембраны. При этом типе предлетальных изменений хроматин подвергается конденсации и, в конечном счете, деградации; однако характерная лестница апоптоза не видна.

Некроз

Некроз относится к ряду изменений, которые происходят после гибели клетки, когда клетка превращается в дебрис, который обычно удаляется в результате воспалительной реакции. Различают два типа: онкотический некроз и апоптотический некроз. Онкотический некроз обычно возникает в больших зонах, например, при инфаркте миокарда или регионарно в органе после химической токсичности, например, в проксимальных канальцах почек после введения HgCl.₂. Поражаются обширные зоны органа, и некротические клетки быстро вызывают воспалительную реакцию, сначала острую, а затем хроническую. В случае выживания организма во многих органах некроз сменяется отмиранием мертвых клеток и регенерацией, например, в печени или почках после химической токсичности. Напротив, апоптотический некроз обычно возникает на основе одной клетки, а некротический дебрис образуется внутри фагоцитов макрофагов или соседних паренхиматозных клеток. Самые ранние характеристики некротических клеток включают нарушения непрерывности плазматической мембраны и появление хлопьевидных уплотнений, представляющих собой денатурированные белки в митохондриальном матриксе. При некоторых формах повреждения, которые изначально не препятствуют накоплению кальция в митохондриях, в митохондриях можно увидеть отложения фосфата кальция. Аналогичным образом фрагментируются и другие мембранные системы, такие как ЭПР, лизосомы и аппарат Гольджи. В конечном итоге ядерный хроматин подвергается лизису в результате атаки лизосомальных гидролаз. После гибели клеток лизосомальные гидролазы играют важную роль в удалении дебриса с помощью катепсинов, нуклеолаз и липаз, поскольку они имеют оптимальный кислый рН и могут выживать при низком рН некротических клеток, в то время как другие клеточные ферменты денатурируются и инактивируются.

Механизмы

Начальный стимул

В случае смертельных травм наиболее распространенными начальными взаимодействиями, приводящими к повреждению, ведущему к гибели клеток, являются нарушение энергетического обмена, такое как аноксия, ишемия или ингибиторы дыхания, и гликолиз, такой как цианид калия, окись углерода, йодацетат и скоро. Как упоминалось выше, высокие дозы соединений, подавляющих энергетический обмен, обычно приводят к онкозам. Другим распространенным типом начального повреждения, приводящего к острой гибели клеток, является изменение функции плазматической мембраны (Trump and Arstila, 1971; Trump, Berezesky and Osornio-Vargas, 1981). Это может быть как прямое повреждение и пермеабилизация, как в случае травмы, так и активация комплекса С5b-С9 комплемента, механическое повреждение клеточной мембраны или ингибирование натрий-калиевого (Na⁺-K⁺) насос с гликозидами, такими как уабаин. Ионофоры кальция, такие как иономицин или A23187, которые быстро переносят [Ca²⁺] вниз по градиенту в клетку, также вызывают острую смертельную травму. В некоторых случаях паттерном предлетальных изменений является апоптоз; в других случаях это онкоз.

Сигнальные пути

При многих типах повреждений быстро нарушаются митохондриальное дыхание и окислительное фосфорилирование. В некоторых клетках это стимулирует анаэробный гликолиз, способный поддерживать АТФ, но при многих повреждениях он подавляется. Недостаток АТФ приводит к неспособности активизировать ряд важных гомеостатических процессов, в частности, контроль гомеостаза внутриклеточных ионов (Trump and Berezesky 1992; Trump, Berezesky and Osornio-Vargas 1981). Это приводит к быстрому увеличению [Ca²⁺]_i, и увеличилась [Na⁺] и [Cl^-] приводит к набуханию клеток. Увеличение [Ca²⁺]_i приводят к активации ряда других сигнальных механизмов, обсуждаемых ниже, включая ряд киназ, которые могут приводить к усилению экспрессии гена непосредственно на раннем этапе. Повышенный [Са²⁺]_i также изменяет функцию цитоскелета, частично приводя к образованию пузырьков и активации эндонуклеаз, протеаз и фосфолипаз. Они, по-видимому, запускают многие важные эффекты, описанные выше, такие как повреждение мембран за счет активации протеазы и липазы, прямую деградацию ДНК в результате активации эндонуклеазы и активацию киназ, таких как MAP-киназа и кальмодулинкиназа, которые действуют как факторы транскрипции.

Благодаря обширной работе по развитию беспозвоночных C. Элеганс и Дрозофила, а также в клетках человека и животных идентифицирован ряд предсмертных генов. Было обнаружено, что некоторые из этих генов беспозвоночных имеют аналоги у млекопитающих. Например, ген ced-3, необходимый для запрограммированной гибели клеток у С. Элеганс, обладает протеазной активностью и сильной гомологией с ферментом, превращающим интерлейкин млекопитающих (ICE). Близкородственный ген, названный apopain или prICE, недавно был идентифицирован с еще более близкой гомологией (Nicholson et al. 1995). В Дрозофила, ген жнеца, по-видимому, участвует в сигнале, который приводит к запрограммированной гибели клеток. Другие гены, способствующие смерти, включают мембранный белок Fas и важный ген-супрессор опухоли p53, который широко консервативен. p53 индуцируется на уровне белка после повреждения ДНК и при фосфорилировании действует как фактор транскрипции для других генов, таких как gadd45 и waf-1, которые участвуют в передаче сигналов гибели клеток. Другие непосредственные ранние гены, такие как c-fos, c-jun и c-myc, по-видимому, также вовлечены в некоторые системы.

В то же время существуют гены антисмерти, которые противодействуют генам смерти. Первым из них, который был идентифицирован, был ced-9 из C. Элеганс, который гомологичен bcl-2 у человека. Эти гены действуют пока неизвестным образом, предотвращая гибель клеток генетическими или химическими токсинами. Некоторые недавние данные указывают на то, что bcl-2 может действовать как антиоксидант. В настоящее время предпринимаются большие усилия для понимания задействованных генов и разработки способов активации или ингибирования этих генов в зависимости от ситуации.

Назад

Механистическая токсикология - это изучение того, как химические или физические агенты взаимодействуют с живыми организмами, вызывая токсичность. Знание механизма токсичности вещества повышает способность предотвращать токсичность и разрабатывать более желательные химические вещества; он составляет основу терапии при чрезмерном воздействии и часто позволяет глубже понять фундаментальные биологические процессы. Для целей этого Энциклопедия акцент будет сделан на животных для прогнозирования токсичности для человека. Различные области токсикологии включают механистическую, описательную, нормативную, судебную и экологическую токсикологию (Klaassen, Amdur and Doull, 1991). Все они выигрывают от понимания фундаментальных механизмов токсичности.

Зачем понимать механизмы токсичности?

Понимание механизма, посредством которого вещество вызывает токсичность, по-разному расширяет возможности различных областей токсикологии. Понимание механизмов помогает государственному регулирующему органу установить юридически обязывающие безопасные пределы воздействия на человека. Он помогает токсикологам рекомендовать порядок действий по очистке или восстановлению загрязненных участков и, наряду с физическими и химическими свойствами вещества или смеси, может использоваться для выбора степени необходимого защитного оборудования. Механистические знания также полезны для формирования основы терапии и разработки новых лекарств для лечения болезней человека. Для судебного токсиколога механизм токсичности часто дает представление о том, как химический или физический агент может вызвать смерть или потерю трудоспособности.

Если механизм токсичности понятен, описательная токсикология становится полезной для прогнозирования токсического действия родственных химических веществ. Однако важно понимать, что отсутствие механистической информации не мешает специалистам в области здравоохранения защищать здоровье человека. Для установления безопасных уровней воздействия используются разумные решения, основанные на исследованиях на животных и опыте людей. Традиционно предел безопасности устанавливался путем использования «уровня отсутствия неблагоприятного воздействия» или «наименьшего уровня неблагоприятного воздействия» из исследований на животных (с использованием планов многократного воздействия) и деления этого уровня на коэффициент 100 для профессионального воздействия или 1,000 для другие воздействия окружающей среды на человека. Успех этого процесса очевиден из нескольких случаев неблагоприятных последствий для здоровья, связанных с химическим воздействием на рабочих, где в прошлом были установлены и соблюдались соответствующие пределы воздействия. Кроме того, продолжительность жизни человека продолжает увеличиваться, как и качество жизни. В целом использование данных о токсичности привело к эффективному нормативному и добровольному контролю. Подробное знание токсических механизмов повысит предсказуемость новых моделей риска, разрабатываемых в настоящее время, и приведет к постоянному совершенствованию.

Понимание экологических механизмов является сложным и предполагает знание разрушения экосистемы и гомеостаза (баланса). Хотя это и не обсуждается в этой статье, более глубокое понимание механизмов токсичности и их конечных последствий в экосистеме поможет ученым принимать взвешенные решения в отношении обращения с бытовыми и промышленными отходами. Управление отходами является растущей областью исследований, и в будущем она будет оставаться очень важной.

Методы изучения механизмов токсичности

Большинство механистических исследований начинаются с описательных токсикологических исследований на животных или клинических наблюдений на людях. В идеале исследования на животных включают тщательное поведенческое и клиническое наблюдение, тщательное биохимическое исследование элементов крови и мочи на наличие признаков неблагоприятного функционирования основных биологических систем организма и посмертную оценку всех систем органов путем микроскопического исследования для выявления травмы (см. руководящие принципы испытаний ОЭСР; директивы ЕС по химической оценке; правила испытаний Агентства по охране окружающей среды США; правила Японии по химическим веществам). Это аналогично тщательному медицинскому обследованию человека, которое проводится в больнице в течение двух-трех дней, за исключением вскрытия.

Понимание механизмов токсичности — это искусство и наука наблюдения, творческий подход к выбору методов проверки различных гипотез и инновационная интеграция признаков и симптомов в причинно-следственную связь. Механистические исследования начинаются с воздействия, следят за распределением во времени и поведением в организме (фармакокинетика) и измеряют результирующий токсический эффект на определенном уровне системы и при некотором уровне дозы. Различные вещества могут действовать на разных уровнях биологической системы, вызывая токсичность.

Экспозиция

Путь воздействия в механистических исследованиях обычно такой же, как и при воздействии на человека. Путь важен, потому что могут быть эффекты, которые возникают локально в месте воздействия в дополнение к системным эффектам после того, как химическое вещество впитается в кровь и распространится по всему телу. Простым, но убедительным примером местного эффекта может быть раздражение и возможное разъедание кожи после применения сильных кислотных или щелочных растворов, предназначенных для очистки твердых поверхностей. Точно так же раздражение и гибель клеток могут возникать в клетках, выстилающих нос и/или легкие, после воздействия раздражающих паров или газов, таких как оксиды азота или озон. (Оба являются составляющими загрязнения воздуха или смога). После всасывания химического вещества в кровь через кожу, легкие или желудочно-кишечный тракт его концентрация в любом органе или ткани регулируется многими факторами, определяющими фармакокинетику химического вещества в организме. Организм обладает способностью активировать, а также детоксицировать различные химические вещества, как указано ниже.

Роль фармакокинетики в токсичности

Фармакокинетика описывает временные отношения для химической абсорбции, распределения, метаболизма (биохимических изменений в организме) и элиминации или выведения из организма. По отношению к механизмам токсичности эти фармакокинетические переменные могут быть очень важными и в некоторых случаях определять, будет или не будет токсичность. Например, если материал не абсорбируется в достаточном количестве, системная токсичность (внутри тела) не возникает. И наоборот, высокореактивное химическое вещество, которое быстро (секунды или минуты) обезвреживается пищеварительными или печеночными ферментами, может не успеть вызвать токсичность. Некоторые полициклические галогенсодержащие вещества и их смеси, а также некоторые металлы, такие как свинец, не вызывали бы значительной токсичности, если бы экскреция была бы быстрой; но накопление до достаточно высоких уровней определяет их токсичность, поскольку экскреция не является быстрой (иногда измеряется годами). К счастью, большинство химических веществ не задерживаются в организме так долго. Накопление безвредного материала все равно не вызовет токсичности. Скорость выведения из организма и детоксикации часто называют периодом полураспада химического вещества, то есть временем, в течение которого 50% химического вещества выводится из организма или преобразуется в нетоксичную форму.

Однако, если химическое вещество накапливается в определенной клетке или органе, это может стать причиной для дальнейшего изучения его потенциальной токсичности в этом органе. Совсем недавно были разработаны математические модели для экстраполяции фармакокинетических переменных от животных к человеку. Эти фармакокинетические модели чрезвычайно полезны для выдвижения гипотез и проверки того, может ли экспериментальное животное быть хорошим представителем для людей. На эту тему написано множество глав и текстов (Gehring et al., 1976; Reitz et al., 1987; Nolan et al., 1995). Упрощенный пример физиологической модели изображен на рисунке 1.

Рисунок 1. Упрощенная фармакокинетическая модель

Различные уровни и системы могут быть затронуты неблагоприятным образом

Токсичность может быть описана на разных биологических уровнях. Травма может быть оценена у человека (или животного), системы органов, клетки или молекулы. Системы органов включают иммунную, дыхательную, сердечно-сосудистую, почечную, эндокринную, пищеварительную, костно-мышечную, кровеносную, репродуктивную и центральную нервную системы. Некоторые ключевые органы включают печень, почки, легкие, мозг, кожу, глаза, сердце, яички или яичники и другие основные органы. На клеточном/биохимическом уровне побочные эффекты включают нарушение нормальной функции белка, функции эндокринных рецепторов, ингибирование метаболической энергии или ингибирование или индукцию ферментов ксенобиотиков (чужеродных веществ). Побочные эффекты на молекулярном уровне включают изменение нормальной функции транскрипции ДНК-РНК, специфического связывания цитоплазматических и ядерных рецепторов, а также генов или генных продуктов. В конечном счете, дисфункция в основной системе органов, вероятно, вызвана молекулярным изменением в конкретной клетке-мишени внутри этого органа. Однако не всегда возможно проследить механизм до молекулярного происхождения причинно-следственной связи, да это и не необходимо. Вмешательство и терапия могут быть разработаны без полного понимания молекулярной мишени. Однако знание конкретного механизма токсичности повышает прогностическую ценность и точность экстраполяции на другие химические вещества. Рисунок 2 представляет собой схематическое изображение различных уровней, на которых могут быть обнаружены помехи нормальным физиологическим процессам. Стрелки указывают, что последствия для человека могут быть определены сверху вниз (воздействие, фармакокинетика до системной/органной токсичности) или снизу вверх (молекулярные изменения, клеточный/биохимический эффект до системной/органной токсичности).

Рисунок 2. Репрезентация механизмов токсичности

Примеры механизмов токсичности

Механизмы токсичности могут быть простыми или очень сложными. Часто существует разница между типом токсичности, механизмом токсичности и уровнем воздействия, связанная с тем, вызваны ли побочные эффекты однократной, острой высокой дозой (например, случайное отравление) или более низкой дозой. повторное воздействие (в результате профессионального или экологического воздействия). Классически, в целях тестирования, острая однократная высокая доза вводится путем прямой интубации в желудок грызуна или воздействия атмосферы газа или пара в течение двух-четырех часов, в зависимости от того, что лучше всего напоминает воздействие на человека. За животными наблюдают в течение двухнедельного периода после воздействия, а затем исследуют основные внешние и внутренние органы на наличие повреждений. Тестирование с повторными дозами длится от месяцев до лет. Для видов грызунов два года считаются хроническим (пожизненным) исследованием, достаточным для оценки токсичности и канцерогенности, тогда как для нечеловеческих приматов два года будут считаться субхроническим (менее пожизненного) исследованием для оценки токсичности повторных доз. После воздействия проводится полное обследование всех тканей, органов и жидкостей для выявления любых побочных эффектов.

Механизмы острой токсичности

Следующие примеры относятся к острым эффектам высоких доз, которые могут привести к смерти или тяжелой инвалидности. Однако в некоторых случаях вмешательство приводит к преходящим и полностью обратимым последствиям. Доза или тяжесть воздействия будут определять результат.

Простые удушающие вещества. Механизм токсичности инертных газов и некоторых других нереакционноспособных веществ заключается в недостатке кислорода (аноксия). Эти химические вещества, вызывающие недостаток кислорода в центральной нервной системе (ЦНС), называются простые удушающие. Если человек входит в замкнутое пространство, содержащее азот без достаточного количества кислорода, в мозгу происходит немедленное истощение кислорода, что приводит к потере сознания и, в конечном итоге, к смерти, если человека не удалить быстро. В крайних случаях (почти нулевой уровень кислорода) потеря сознания может наступить через несколько секунд. Спасение зависит от быстрого перемещения в насыщенную кислородом среду. Выживание с необратимым повреждением головного мозга может быть достигнуто за счет отсрочки спасения из-за гибели нейронов, которые не могут регенерировать.

Химические удушающие средства. Угарный газ (СО) конкурирует с кислородом за связывание с гемоглобином (в красных кровяных тельцах) и поэтому лишает ткани кислорода для энергетического обмена; может наступить гибель клеток. Вмешательство включает удаление из источника CO и обработку кислородом. Прямое использование кислорода основано на токсическом действии CO. Другим сильнодействующим химическим удушающим средством является цианид. Ион цианида препятствует клеточному метаболизму и использованию кислорода для получения энергии. Лечение нитритом натрия вызывает превращение гемоглобина в эритроцитах в метгемоглобин. Метгемоглобин имеет большее сродство связывания с ионом цианида, чем клеточная мишень цианида. Следовательно, метгемоглобин связывает цианид и удерживает цианид на расстоянии от клеток-мишеней. На этом основывается антидотная терапия.

Депрессанты центральной нервной системы (ЦНС). Острая токсичность характеризуется седативным эффектом или потерей сознания для ряда материалов, таких как растворители, которые не вступают в реакцию или превращаются в реакционноспособные промежуточные соединения. Предполагается, что седативный эффект/анестезия обусловлены взаимодействием растворителя с мембранами клеток ЦНС, что ухудшает их способность передавать электрические и химические сигналы. Хотя седация может показаться легкой формой токсичности и была основой для разработки ранних анестетиков, «доза по-прежнему делает яд». При приеме внутрь или вдыхании достаточной дозы животное может погибнуть из-за остановки дыхания. Если смерть от анестезии не наступает, этот тип токсичности обычно легко обратим, когда субъект удаляется из окружающей среды или химическое вещество перераспределяется или выводится из организма.

Кожные эффекты. Неблагоприятное воздействие на кожу может варьироваться от раздражения до коррозии, в зависимости от встречающегося вещества. Сильные кислоты и щелочные растворы несовместимы с живыми тканями и вызывают коррозию, вызывая химические ожоги и возможное рубцевание. Рубцевание происходит из-за гибели дермальных, глубоких клеток кожи, ответственных за регенерацию. Более низкие концентрации могут просто вызвать раздражение первого слоя кожи.

Другим специфическим механизмом токсического действия на кожу является химическая сенсибилизация. Например, сенсибилизация возникает, когда 2,4-динитрохлорбензол связывается с естественными белками кожи, и иммунная система распознает измененный комплекс, связанный с белком, как чужеродный материал. В ответ на этот чужеродный материал иммунная система активирует специальные клетки для устранения чужеродного вещества путем высвобождения медиаторов (цитокинов), которые вызывают сыпь или дерматит (см. «Иммунотоксикология»). Это та же самая реакция иммунной системы, когда происходит воздействие ядовитого плюща. Иммунная сенсибилизация очень специфична для конкретного химического вещества и требует не менее двух воздействий, прежде чем будет вызвана реакция. Первое воздействие вызывает сенсибилизацию (настраивает клетки на распознавание химического вещества), а последующие воздействия вызывают реакцию иммунной системы. Отказ от контакта и симптоматическая терапия стероидсодержащими противовоспалительными кремами обычно эффективны при лечении сенсибилизированных лиц. В серьезных или рефрактерных случаях иммунодепрессанты системного действия, такие как преднизолон, используются в сочетании с местным лечением.

Сенсибилизация легких. Реакция иммунной сенсибилизации вызывается толуолдиизоцианатом (ТДИ), но мишенью являются легкие. Чрезмерное воздействие ТДИ у восприимчивых людей вызывает отек легких (скопление жидкости), сужение бронхов и нарушение дыхания. Это серьезное состояние, требующее удаления человека от потенциального последующего воздействия. Лечение преимущественно симптоматическое. Сенсибилизация кожи и легких зависит от дозы. Превышение уровня, установленного для профессионального воздействия, может привести к неблагоприятным последствиям.

Глазные эффекты. Повреждение глаза варьируется от покраснения наружного слоя (покраснение в бассейне) до образования катаракты роговицы и повреждения радужной оболочки (окрашенной части глаза). Тесты на раздражение глаз проводятся, когда предполагается, что серьезной травмы не произойдет. Многие из механизмов, вызывающих коррозию кожи, могут также привести к повреждению глаз. Материалы, вызывающие коррозию кожи, такие как сильные кислоты (pH менее 2) и щелочи (pH более 11.5), не тестируются на глазах у животных, поскольку большинство из них вызывают коррозию и слепоту из-за механизма, сходного с тем, который вызывает коррозию кожи. . Кроме того, поверхностно-активные вещества, такие как детергенты и поверхностно-активные вещества, могут вызывать повреждения глаз, начиная от раздражения и заканчивая коррозией. Группа материалов, требующая осторожности, — это положительно заряженные (катионные) поверхностно-активные вещества, которые могут вызывать ожоги, стойкое помутнение роговицы и васкуляризацию (образование кровеносных сосудов). Другое химическое вещество, динитрофенол, оказывает специфическое воздействие на образование катаракты. По-видимому, это связано с концентрацией этого химического вещества в глазу, что является примером специфичности фармакокинетического распределения.

Хотя приведенный выше список далеко не исчерпывающий, он предназначен для того, чтобы дать читателю представление о различных механизмах острой токсичности.

Механизмы субхронической и хронической токсичности

При введении в виде однократной высокой дозы некоторые химические вещества не обладают таким же механизмом токсичности, как при повторном введении в виде более низкой, но все же токсичной дозы. Когда вводится однократная высокая доза, всегда существует возможность превышения способности человека детоксицировать или выводить из организма химическое вещество, и это может привести к другой токсической реакции, чем при введении более низких повторяющихся доз. Алкоголь является хорошим примером. Высокие дозы алкоголя приводят к первичным воздействиям на центральную нервную систему, в то время как более низкие повторяющиеся дозы приводят к повреждению печени.

Ингибирование антихолинэстеразы. Например, большинство фосфорорганических пестицидов малотоксичны для млекопитающих до тех пор, пока они не будут метаболически активированы, прежде всего в печени. Основным механизмом действия фосфорорганических соединений является ингибирование ацетилхолинэстеразы (АХЭ) в головном мозге и периферической нервной системе. АХЭ является нормальным ферментом, который прекращает стимуляцию нейротрансмиттера ацетилхолина. Незначительное ингибирование АХЭ в течение длительного периода времени не было связано с побочными эффектами. При высоких уровнях воздействия неспособность прекратить стимуляцию нейронов приводит к чрезмерной стимуляции холинергической нервной системы. Холинергическая чрезмерная стимуляция в конечном итоге приводит к множеству симптомов, включая остановку дыхания, за которой следует смерть, если ее не лечить. Основным лечением является введение атропина, который блокирует эффекты ацетилхолина, и введение хлорида пралидоксима, который реактивирует ингибированную АХЭ. Следовательно, как причина, так и лечение токсичности фосфорорганических соединений решаются путем понимания биохимической основы токсичности.

Метаболическая активация. Многие химические вещества, включая четыреххлористый углерод, хлороформ, ацетиламинофлуорен, нитрозамины и паракват, метаболически активируются с образованием свободных радикалов или других реакционноспособных промежуточных соединений, которые ингибируют нормальную клеточную функцию и мешают ей. При высоких уровнях воздействия это приводит к гибели клеток (см. «Клеточное повреждение и гибель клеток»). Хотя конкретные взаимодействия и клеточные мишени остаются неизвестными, системы органов, которые способны активировать эти химические вещества, такие как печень, почки и легкие, являются потенциальными мишенями для повреждения. В частности, определенные клетки внутри органа обладают большей или меньшей способностью активировать или детоксицировать эти промежуточные соединения, и эта способность определяет внутриклеточную восприимчивость внутри органа. Метаболизм является одной из причин, по которой понимание фармакокинетики, описывающей эти типы превращений, а также распределение и элиминацию этих промежуточных соединений, важно для понимания механизма действия этих химических веществ.

Механизмы рака. Рак — это множество заболеваний, и хотя понимание некоторых видов рака быстро растет благодаря множеству молекулярно-биологических методов, разработанных с 1980 года, еще многое предстоит узнать. Однако ясно, что развитие рака представляет собой многоэтапный процесс, и критические гены являются ключевыми для различных типов рака. Изменения в ДНК (соматические мутации) в ряде этих критических генов могут вызывать повышенную восприимчивость или раковые поражения (см. «Генетическая токсикология»). Воздействие природных химических веществ (в приготовленных пищевых продуктах, таких как говядина и рыба) или синтетических химических веществ (таких как бензидин, используемый в качестве красителя) или физических факторов (ультрафиолетовый свет от солнца, радон из почвы, гамма-излучение от медицинских процедур или производственной деятельности) способствуют соматическим генным мутациям. Однако существуют природные и синтетические вещества (такие как антиоксиданты) и процессы репарации ДНК, которые защищают и поддерживают гомеостаз. Ясно, что генетика является важным фактором в развитии рака, поскольку синдромы генетических заболеваний, такие как пигментная ксеродермия, при которых отсутствует нормальная репарация ДНК, резко повышают восприимчивость к раку кожи из-за воздействия ультрафиолетового излучения солнца.

Репродуктивные механизмы. Как и в случае с раком, известны многие механизмы токсичности для репродуктивной системы и/или развития, но многое еще предстоит изучить. Известно, что некоторые вирусы (такие как краснуха), бактериальные инфекции и лекарственные препараты (такие как талидомид и витамин А) отрицательно влияют на развитие. Недавняя работа Khera (1991), рассмотренная Carney (1994), демонстрирует убедительные доказательства того, что аномальные эффекты развития в тестах на животных с этиленгликолем связаны с кислыми метаболитами материнского метаболизма. Это происходит, когда этиленгликоль метаболизируется до кислых метаболитов, включая гликолевую и щавелевую кислоты. Последующее воздействие на плаценту и плод, по-видимому, связано с этим процессом метаболической токсичности.

Заключение

Цель этой статьи - дать представление о нескольких известных механизмах токсичности и необходимости будущих исследований. Важно понимать, что механистические знания не являются абсолютно необходимыми для защиты здоровья человека или окружающей среды. Эти знания повысят способность профессионала лучше прогнозировать токсичность и управлять ею. Фактические методы, используемые для объяснения любого конкретного механизма, зависят от коллективных знаний ученых и мышления тех, кто принимает решения относительно здоровья человека.

Назад