Биологический мониторинг человека использует образцы биологических жидкостей или другого легкодоступного биологического материала для измерения воздействия специфических или неспецифических веществ и/или их метаболитов или для измерения биологических эффектов этого воздействия. Биологический мониторинг позволяет оценить общее индивидуальное воздействие через различные пути воздействия (легкие, кожа, желудочно-кишечный тракт) и различные источники воздействия (воздух, питание, образ жизни или род занятий). Также известно, что в сложных ситуациях воздействия, которые очень часто встречаются на рабочих местах, различные агенты воздействия могут взаимодействовать друг с другом, либо усиливая, либо ингибируя действие отдельных соединений. И поскольку люди различаются по своей генетической конституции, они проявляют изменчивость в своей реакции на химическое воздействие. Таким образом, может быть более разумным искать ранние эффекты непосредственно у подвергшихся воздействию отдельных лиц или групп, чем пытаться предсказать потенциальную опасность сложных моделей воздействия на основе данных, относящихся к отдельным соединениям. В этом заключается преимущество генетического биомониторинга ранних эффектов, подхода, использующего методы, фокусирующиеся на цитогенетических повреждениях, точечных мутациях или аддуктах ДНК в суррогатных тканях человека (см. статью «Общие принципы» в этой главе).

Что такое генотоксичность?

Генотоксичность отравляющих веществ представляет собой внутреннюю химическую характеристику, основанную на электрофильной способности вещества связываться с такими нуклеофильными участками клеточных макромолекул, как дезоксирибонуклеиновая кислота, ДНК, носитель наследственной информации. Таким образом, генотоксичность — это токсичность, проявляющаяся в генетическом материале клеток.

Определение генотоксичности, обсуждавшееся в консенсусном отчете (IARC 1992), является широким и включает как прямые, так и косвенные эффекты в ДНК: (1) индукция мутаций (генных, хромосомных, геномных, рекомбинационных), которые на молекулярном уровне сходны с событиями, которые, как известно, участвуют в канцерогенезе, (2) косвенные суррогатные события, связанные с мутагенезом (например, незапланированный синтез ДНК (UDS) и обмен сестринских хроматид (SCE), или (3) повреждение ДНК (например, образование аддуктов ), что в конечном итоге может привести к мутациям.

Генотоксичность, мутагенность и канцерогенность

Мутации представляют собой стойкие наследственные изменения в клеточных линиях либо по горизонтали в соматических клетках, либо по вертикали в зародышевых (половых) клетках организма. То есть мутации могут затрагивать сам организм через изменения в клетках организма или передаваться другим поколениям через изменение половых клеток. Таким образом, генотоксичность предшествует мутагенности, хотя большая часть генотоксичности репарируется и никогда не выражается в виде мутаций. Соматические мутации индуцируются на клеточном уровне и в том случае, если они приводят к гибели клеток или злокачественным новообразованиям, могут проявляться в виде различных нарушений тканей или самого организма. Считается, что соматические мутации связаны с эффектами старения или с образованием атеросклеротических бляшек (см. рис. 1 и главу, посвященную рак).

Рисунок 1. Схематическое представление научной парадигмы генетической токсикологии и воздействия на здоровье человека.

Мутации в зародышевой клеточной линии могут быть перенесены в зиготу — оплодотворенную яйцеклетку — и проявиться в потомстве (см. также главу Репродуктивная система). Наиболее важные мутационные нарушения, обнаруживаемые у новорожденных, индуцируются нарушением сегрегации хромосом во время гаметогенеза (развития зародышевых клеток) и приводят к тяжелым хромосомным синдромам (например, трисомии 21 или синдрому Дауна и моносомии X или синдрому Тернера).

Парадигма генотоксикологии от воздействия до ожидаемых эффектов может быть упрощена, как показано на рисунке 1.

Связь генотоксичности с канцерогенностью хорошо подтверждается различными косвенными исследовательскими фактами, как показано на рисунке 2. 

Рисунок 2. Взаимосвязь генотоксичности и канцерогенности    

Эта корреляция обеспечивает основу для применения биомаркеров генотоксичности в качестве индикаторов канцерогенной опасности при мониторинге человека.

Генетическая токсичность в идентификации опасностей

Роль генетических изменений в канцерогенезе подчеркивает важность тестирования генетической токсичности для идентификации потенциальных канцерогенов. Были разработаны различные краткосрочные тестовые методы, способные выявить некоторые конечные точки генотоксичности, предположительно имеющие отношение к канцерогенезу.

Было проведено несколько обширных исследований для сравнения канцерогенности химических веществ с результатами, полученными при их краткосрочном изучении. Общий вывод заключался в том, что, поскольку ни один валидированный тест не может предоставить информацию обо всех вышеупомянутых генетических конечных точках; необходимо тестировать каждое химическое вещество более чем в одном анализе. Кроме того, значение краткосрочных тестов генетической токсичности для прогнозирования химической канцерогенности неоднократно обсуждалось и пересматривалось. На основе таких обзоров рабочая группа Международного агентства по изучению рака (IARC) пришла к выводу, что большинство канцерогенов человека дают положительные результаты в обычно используемых краткосрочных тестах, таких как Сальмонелла анализ и анализ хромосомных аберраций (таблица 1). Однако следует понимать, что эпигенетические канцерогены, такие как гормонально активные соединения, которые могут повышать генотоксическую активность, не будучи сами генотоксичными, не могут быть обнаружены с помощью краткосрочных тестов, которые измеряют только внутреннюю генотоксическую активность вещества.

Таблица 1. Генотоксичность химических веществ, оцененная в Приложениях 6 и 7 к монографиям МАИР (1986 г.)

Генетический биомониторинг

Генетический мониторинг использует методы генетической токсикологии для биологического мониторинга генетических эффектов или оценки генотоксического воздействия в группе лиц с определенным воздействием на рабочем месте или через окружающую среду или образ жизни. Таким образом, генетический мониторинг имеет потенциал для раннего выявления генотоксического воздействия в группе лиц и позволяет определить группы высокого риска и, следовательно, приоритеты для вмешательства. Использование прогностических биомаркеров в подверженной воздействию популяции гарантирует экономию времени (по сравнению с эпидемиологическими методами) и предотвращение ненужных конечных эффектов, а именно рака (рис. 3).

Рисунок 3. Прогностическая способность биомаркеров позволяет принимать превентивные меры для снижения рисков для здоровья людей.

Методы, используемые в настоящее время для биомониторинга генотоксического воздействия и ранних биологических эффектов, перечислены в таблице 2. Образцы, используемые для биомониторинга, должны соответствовать нескольким критериям, включая необходимость того, чтобы они были легко доступны и сопоставимы с тканью-мишенью.

Таблица 2. Биомаркеры в генетическом мониторинге воздействия генотоксичности и наиболее часто используемые образцы клеток/тканей.

Типы молекулярно распознаваемых повреждений ДНК включают образование аддуктов ДНК и реорганизацию последовательности ДНК. Эти виды повреждений могут быть обнаружены путем измерения аддуктов ДНК с использованием различных методик, например либо 32P-постмечения, либо обнаружения моноклональных антител к аддуктам ДНК. Измерение разрывов цепей ДНК обычно проводят с использованием щелочной элюции или анализа раскручивания. Мутации могут быть обнаружены путем секвенирования ДНК определенного гена, например, гена HPRT.

Появилось несколько методологических отчетов, в которых подробно обсуждаются методы таблицы 2 (CEC 1987; IARC 1987, 1992, 1993).

Генотоксичность также можно контролировать косвенно путем измерения белковых аддуктов, то есть в гемоглобине вместо ДНК, или мониторинга активности репарации ДНК. В качестве стратегии измерения деятельность по мониторингу может быть однократной или непрерывной. Во всех случаях результаты должны применяться для разработки безопасных условий труда.

Цитогенетический биомониторинг

Теоретическое и эмпирическое обоснование связывает рак с повреждением хромосом. Мутационные события, изменяющие активность или экспрессию генов факторов роста, являются ключевыми этапами канцерогенеза. Многие виды рака связаны со специфическими или неспецифическими хромосомными аберрациями. При некоторых наследственных заболеваниях человека нестабильность хромосом связана с повышенной предрасположенностью к раку.

Цитогенетическое наблюдение за людьми, подвергшимися воздействию канцерогенных и/или мутагенных химических веществ или радиации, может выявить воздействие на генетический материал соответствующих лиц. Исследования хромосомных аберраций у людей, подвергшихся воздействию ионизирующего излучения, применялись для биологической дозиметрии в течение десятилетий, но хорошо задокументированные положительные результаты пока доступны только для ограниченного числа химических канцерогенов.

Микроскопически распознаваемые хромосомные повреждения включают как структурные хромосомные аберрации (ХА), при которых произошло грубое изменение морфологии (формы) хромосомы, так и обмены сестринскими хроматидами (СХЭ). SCE представляет собой симметричный обмен хромосомными материалами между двумя сестринскими хроматидами. Микроядра (МЯ) могут возникать как из ацентрических фрагментов хромосом, так и из отстающих целых хромосом. Эти типы изменений показаны на рисунке 4.

Рисунок 4. Хромосомы лимфоцитов человека в метафазе, выявляющие индуцированную хромосомную мутацию (стрелка указывает на ацентрический фрагмент)

Лимфоциты периферической крови человека являются подходящими клетками для использования в исследованиях по наблюдению из-за их легкой доступности и потому, что они могут интегрировать воздействие в течение относительно длительного периода жизни. Воздействие различных химических мутагенов может привести к увеличению частоты КА и/или ГХЭ в лимфоцитах крови подвергшихся воздействию лиц. Кроме того, степень повреждения примерно коррелирует с воздействием, хотя это было показано только для нескольких химических веществ.

Когда цитогенетические тесты лимфоцитов периферической крови показывают, что генетический материал поврежден, результаты можно использовать для оценки риска только на уровне популяции. Повышенную частоту CA в популяции следует рассматривать как показатель повышенного риска рака, но цитогенетические тесты как таковые не позволяют прогнозировать индивидуальный риск рака.

Значение соматических генетических повреждений для здоровья, наблюдаемое через узкое окно образца лимфоцитов периферической крови, не имеет большого значения или не имеет никакого значения для здоровья человека, поскольку большинство лимфоцитов, несущих генетические повреждения, умирают и заменяются.

Проблемы и их контроль в исследованиях биомониторинга человека

Строгий дизайн исследования необходим при применении любого метода биомониторинга человека, поскольку на изучаемые биологические реакции могут влиять многие межиндивидуальные факторы, не связанные с конкретным химическим воздействием(ями). Поскольку исследования биомониторинга человека утомительны и трудны во многих отношениях, очень важно тщательное предварительное планирование. При проведении цитогенетических исследований человека экспериментальное подтверждение потенциала повреждения хромосом агентом(ами) воздействия всегда должно быть экспериментальным предварительным условием.

В исследованиях цитогенетического биомониторинга были задокументированы два основных типа вариаций. Первый включает технические факторы, связанные с расхождениями в показаниях слайдов и условиями культивирования, в частности, с типом среды, температурой и концентрацией химических веществ (таких как бромдезоксиуридин или цитохалазин-В). Кроме того, время выборки может изменить выход хромосомных аберраций и, возможно, также данные о частоте SCE за счет изменений в субпопуляциях T- и B-лимфоцитов. В микроядерном анализе методологические различия (например, использование двуядерных клеток, индуцированных цитохалазином-В) весьма явно влияют на результаты оценки.

Повреждения, вызванные химическим воздействием в ДНК лимфоцитов, которые приводят к образованию структурных аберраций хромосом, обмену сестринских хроматид и микроядер, должны сохраняться. в естественных условиях до забора крови, а затем в пробирке пока культивируемый лимфоцит не начнет синтез ДНК. Поэтому важно подсчитывать клетки сразу после первого деления (в случае хромосомных аберраций или микроядер) или после второго деления (обмен сестринскими хроматидами), чтобы получить наилучшую оценку индуцированного повреждения.

Оценка представляет собой чрезвычайно важный элемент цитогенетического биомониторинга. Слайды должны быть рандомизированы и закодированы, чтобы, насколько это возможно, избежать смещения оценок. Следует поддерживать согласованные критерии оценки, контроль качества и стандартизированный статистический анализ и отчетность. Вторая категория изменчивости связана с условиями, связанными с субъектами, такими как возраст, пол, лекарства и инфекции. Индивидуальные вариации также могут быть вызваны генетической восприимчивостью к факторам окружающей среды.

Крайне важно получить одновременную контрольную группу, которая максимально соответствует внутренним факторам, таким как пол и возраст, а также таким факторам, как курение, вирусные инфекции и прививки, употребление алкоголя и наркотиков, а также воздействие рентгеновских лучей. . Кроме того, необходимо получить качественные (категория работы, годы воздействия) и количественные (например, пробы воздуха в зоне дыхания для химического анализа и, если возможно, конкретные метаболиты) оценки воздействия предполагаемого(ых) генотоксического агента(ов) на рабочем месте. Особое внимание следует уделить надлежащей статистической обработке результатов.

Актуальность генетического биомониторинга для оценки риска рака

Количество агентов, неоднократно показавших, что они вызывают цитогенетические изменения у людей, все еще относительно ограничено, но большинство известных канцерогенов вызывают повреждение хромосом лимфоцитов.

Степень повреждения зависит от уровня воздействия, как было показано, например, в случае с винилхлоридом, бензолом, этиленоксидом и алкилирующими противоопухолевыми агентами. Даже если цитогенетические конечные точки не очень чувствительны или специфичны в отношении обнаружения экспозиций, происходящих в современных профессиональных условиях, положительные результаты таких тестов часто побуждают к проведению гигиенического контроля даже при отсутствии прямых доказательств, касающихся соматических хромосомных повреждений. неблагоприятные последствия для здоровья.

Большая часть опыта применения цитогенетического биомониторинга связана с профессиональными ситуациями с «высоким уровнем воздействия». Очень небольшое количество экспозиций было подтверждено несколькими независимыми исследованиями, и большинство из них было выполнено с использованием биомониторинга хромосомных аберраций. База данных Международного агентства по изучению рака перечисляет в своих обновленных томах 43–50 монографий IARC в общей сложности 14 профессиональных канцерогенов в группах 1, 2A или 2B, для которых имеются положительные цитогенетические данные человека, которые в большинстве случаев подтверждается соответствующей цитогенетикой животных (таблица 3). Эта ограниченная база данных позволяет предположить, что канцерогенные химические вещества имеют тенденцию быть кластогенными и что кластогенность обычно связана с известными человеческими канцерогенами. Однако совершенно очевидно, что не все канцерогены вызывают цитогенетические повреждения у людей или экспериментальных животных. в естественных условиях. Случаи, когда данные для животных положительные, а данные для человека отрицательные, могут свидетельствовать о различиях в уровнях воздействия. Кроме того, сложные и длительные воздействия на человека на работе могут быть несопоставимы с краткосрочными экспериментами на животных.

Таблица 3. Доказанные, вероятные и возможные канцерогены для человека, для которых существует профессиональное воздействие и для которых были измерены цитогенетические конечные точки как у людей, так и у экспериментальных животных

¹ СА, хромосомная аберрация; SCE, обмен сестринских хроматид; МЯ, микроядра.
(-) = отрицательная связь для одного исследования; – = отрицательная связь;
(+) = положительная связь для одного исследования; + = положительная связь;
? = неубедительный; пустая область = не изучено

Источник: МАИР, 1987 г.; обновлено в томах 43–50 монографий IARC.

Исследования генотоксичности у подвергшихся воздействию людей включают различные конечные точки, отличные от хромосомных конечных точек, такие как повреждение ДНК, активность репарации ДНК и аддукты в ДНК и белках. Некоторые из этих конечных точек могут иметь большее значение, чем другие, для прогнозирования канцерогенной опасности. Стабильные генетические изменения (например, хромосомные перестройки, делеции и точечные мутации) имеют большое значение, поскольку известно, что эти типы повреждений связаны с канцерогенезом. Значение аддуктов ДНК зависит от их химической идентификации и доказательств того, что они являются результатом воздействия. Некоторые конечные точки, такие как SCE, UDS, SSB, разрыв цепи ДНК, являются потенциальными индикаторами и/или маркерами генетических событий; однако их ценность снижается из-за отсутствия механистического понимания их способности приводить к генетическим событиям. Очевидно, что наиболее значимым генетическим маркером у людей будет индукция специфической мутации, которая непосредственно связана с раком у грызунов, подвергшихся воздействию изучаемого агента (рис. 5).

Рисунок 5. Актуальность различных эффектов генетического биомониторинга для потенциального риска рака

Этические аспекты генетического биомониторинга

Быстрый прогресс в молекулярно-генетических методах, увеличение скорости секвенирования генома человека и выявление роли генов-супрессоров опухолей и протоонкогенов в канцерогенезе человека поднимают этические проблемы при интерпретации, передаче и использовании такого рода данных. персональная информация. Быстро совершенствующиеся методы анализа генов человека скоро позволят идентифицировать еще больше унаследованных генов восприимчивости у здоровых людей без симптомов (US Office of Technology Assessment 1990), которые можно использовать в генетическом скрининге.

Если вскоре применение генетического скрининга станет реальностью, возникнет много вопросов социального и этического характера. Уже в настоящее время примерно 50 генетических признаков метаболизма, полиморфизма ферментов и репарации ДНК подозреваются в чувствительности к специфическим заболеваниям, а диагностический тест ДНК доступен примерно для 300 генетических заболеваний. Следует ли вообще проводить генетический скрининг на рабочем месте? Кто должен решать, кто будет проходить тестирование, и как эта информация будет использоваться при принятии решений о приеме на работу? Кто будет иметь доступ к информации, полученной в результате генетического скрининга, и как результаты будут доведены до сведения вовлеченных лиц? Многие из этих вопросов тесно связаны с социальными нормами и преобладающими этическими ценностями. Главной целью должно быть предотвращение болезней и человеческих страданий, но необходимо уважать собственную волю человека и этические принципы. Некоторые соответствующие этические вопросы, на которые необходимо ответить задолго до начала любого исследования по биомониторингу на рабочем месте, приведены в таблице 4, а также обсуждаются в главе Этические вопросы.

Таблица 4. Некоторые этические принципы, касающиеся необходимости знать в исследованиях профессионального генетического биомониторинга

Время и усилия должны быть затрачены на фазу планирования любого генетического биомониторингового исследования, и все необходимые стороны — сотрудники, работодатели и медицинский персонал сотрудничающего рабочего места — должны быть хорошо информированы до начала исследования, а результаты должны быть известны их и после учебы. При надлежащем уходе и надежных результатах генетический биомониторинг может помочь обеспечить более безопасные рабочие места и улучшить здоровье работников.

Назад