Давно известно, что реакция каждого человека на химические вещества в окружающей среде различна. Недавний взрыв в молекулярной биологии и генетике привел к более ясному пониманию молекулярной основы такой изменчивости. Основные детерминанты индивидуальной реакции на химические вещества включают важные различия между более чем дюжиной суперсемейств ферментов, которые в совокупности называются ксенобиотик- (инородный для тела) или метаболизирующий наркотики ферменты. Хотя роль этих ферментов классически рассматривалась как детоксикация, эти же ферменты также превращают ряд инертных соединений в высокотоксичные промежуточные соединения. Недавно было идентифицировано много тонких, а также грубых различий в генах, кодирующих эти ферменты, которые, как было показано, приводят к заметным изменениям активности ферментов. Теперь ясно, что каждый человек обладает отличным набором активности ферментов, метаболизирующих ксенобиотики; это разнообразие можно рассматривать как «метаболический отпечаток пальца». Именно сложное взаимодействие этих множества различных суперсемейств ферментов в конечном итоге определяет не только судьбу и потенциальную токсичность химического вещества для любого конкретного человека, но и оценку воздействия. В этой статье мы решили использовать надсемейство ферментов цитохрома Р450, чтобы проиллюстрировать замечательный прогресс, достигнутый в понимании индивидуальной реакции на химические вещества. Разработка относительно простых тестов на основе ДНК, предназначенных для выявления специфических изменений генов в этих ферментах, в настоящее время позволяет более точно прогнозировать индивидуальную реакцию на химическое воздействие. Мы надеемся, что результатом станет профилактическая токсикология. Другими словами, каждый человек может узнать о тех химических веществах, к которым он или она особенно чувствителен, тем самым избегая ранее непредсказуемой токсичности или рака.

Хотя это обычно не признается, люди ежедневно подвергаются воздействию бесчисленных разнообразных химических веществ. Многие из этих химических веществ высокотоксичны и поступают из самых разных источников окружающей среды и продуктов питания. Взаимосвязь между такими воздействиями и здоровьем человека была и остается в центре внимания биомедицинских исследований во всем мире.

Каковы некоторые примеры этой химической бомбардировки? Было выделено и охарактеризовано более 400 химических веществ из красного вина. По оценкам, зажженная сигарета вырабатывает не менее 1,000 химических веществ. В косметике и парфюмированном мыле содержится бесчисленное количество химических веществ. Еще одним крупным источником химического воздействия является сельское хозяйство: только в Соединенных Штатах сельскохозяйственные угодья ежегодно получают более 75,000 XNUMX химических веществ в виде пестицидов, гербицидов и удобрений; после поглощения растениями и пастбищными животными, а также рыбой в близлежащих водоемах люди (в конце пищевой цепи) поглощают эти химические вещества. Два других источника высоких концентраций химических веществ, попавших в организм, включают (а) постоянное употребление наркотиков и (б) воздействие опасных веществ на рабочем месте в течение всей жизни.

В настоящее время хорошо известно, что химическое воздействие может отрицательно сказаться на многих аспектах здоровья человека, вызывая хронические заболевания и развитие многих видов рака. В последнее десятилетие или около того молекулярная основа многих из этих взаимосвязей начала раскрываться. Кроме того, появилось осознание того, что люди заметно различаются по своей восприимчивости к вредным последствиям химического воздействия.

Текущие усилия по прогнозированию реакции человека на химическое воздействие объединяют два основных подхода (рис. 1): мониторинг степени воздействия на человека с помощью биологических маркеров (биомаркеров) и прогнозирование вероятной реакции человека на заданный уровень воздействия. Хотя оба эти подхода чрезвычайно важны, следует подчеркнуть, что они существенно отличаются друг от друга. В этой статье речь пойдет о генетические факторы лежащей в основе индивидуальной восприимчивости к любому конкретному химическому воздействию. Эта область исследований широко называется экогенетикаили фармакогенетика (см. Калоу, 1962 и 1992). Многие из недавних достижений в определении индивидуальной восприимчивости к химической токсичности стали результатом более глубокого понимания процессов, посредством которых люди и другие млекопитающие обезвреживают химические вещества, а также удивительной сложности задействованных ферментных систем.

Рисунок 1. Взаимосвязь между оценкой воздействия, этническими различиями, возрастом, диетой, питанием и оценкой генетической предрасположенности — все это играет роль в индивидуальном риске токсичности и рака

Сначала мы опишем изменчивость токсических реакций у людей. Затем мы познакомим вас с некоторыми ферментами, ответственными за такую ​​изменчивость реакции из-за различий в метаболизме чужеродных химических веществ. Далее будут подробно описаны история и номенклатура надсемейства цитохромов Р450. Будут кратко описаны пять полиморфизмов P450 человека, а также несколько полиморфизмов, не относящихся к P450; они ответственны за человеческие различия в токсической реакции. Затем мы обсудим пример, чтобы подчеркнуть тот факт, что генетические различия людей могут влиять на оценку воздействия, определяемую мониторингом окружающей среды. Наконец, мы обсудим роль этих ферментов, метаболизирующих ксенобиотики, в критических жизненных функциях.

Различия в токсической реакции среди населения

Токсикологи и фармакологи обычно говорят о средней летальной дозе для 50% населения (LD₅₀), средняя максимально переносимая доза для 50% населения (MTD₅₀), и средняя эффективная доза того или иного препарата для 50% населения (ЭД₅₀). Однако как эти дозы влияют на каждого из нас в отдельности? Другими словами, высокочувствительный человек может быть в 500 раз более подвержен воздействию или в 500 раз более подвержен воздействию, чем наиболее устойчивый индивидуум в популяции; для этих людей ЛД₅₀ (и МПД₅₀ и ЭД₅₀) значения не имели бы большого значения. ЛД₅₀, МТД₅₀ и ЭД₅₀ значения имеют значение только применительно к населению в целом.

Рисунок 2 иллюстрирует гипотетическую зависимость доза-реакция для токсической реакции у людей в любой данной популяции. Эта общая диаграмма может представлять бронхогенную карциному в ответ на количество выкуренных сигарет, хлоракне в зависимости от уровня диоксина на рабочем месте, астму в зависимости от концентрации озона или альдегида в воздухе, солнечные ожоги в ответ на воздействие ультрафиолетового света, снижение времени свертывания крови в зависимости от количества выкуренных сигарет. функция приема аспирина или желудочно-кишечные расстройства в ответ на количество халапеньо перец потребляется. Как правило, в каждом из этих случаев, чем больше воздействие, тем сильнее токсическая реакция. У большей части населения среднее значение и стандартное отклонение токсической реакции зависят от дозы. «Устойчивый выброс» (внизу справа на рисунке 2) — это человек с меньшей реакцией на более высокие дозы или воздействия. «Чувствительный выброс» (вверху слева) — это человек с преувеличенной реакцией на относительно небольшую дозу или воздействие. Эти выбросы с резкими различиями в реакции по сравнению с большинством людей в популяции могут представлять собой важные генетические варианты, которые могут помочь ученым в попытке понять основные молекулярные механизмы токсической реакции. 

Рисунок 2. Общая взаимосвязь между любой токсической реакцией и дозой любого экологического, химического или физического агента.

Используя эти выбросы в семейных исследованиях, ученые в ряде лабораторий начали понимать важность менделевской наследственности для данной токсической реакции. Впоследствии можно обратиться к молекулярной биологии и генетическим исследованиям, чтобы точно определить лежащий в основе механизм на генном уровне.генотип) ответственный за экологически обусловленное заболевание (фенотип).

Ферменты, метаболизирующие ксенобиотики или лекарства

Как организм реагирует на множество экзогенных химических веществ, которым мы подвергаемся? Люди и другие млекопитающие развили очень сложные системы метаболических ферментов, включающие более дюжины различных надсемейств ферментов. Эти ферменты модифицируют почти все химические вещества, которым подвергаются люди, чтобы облегчить удаление инородного вещества из организма. В совокупности эти ферменты часто называют ферменты, метаболизирующие лекарственные средства or ферменты, метаболизирующие ксенобиотики. На самом деле, оба термина являются неправильными. Во-первых, многие из этих ферментов не только метаболизируют лекарства, но и сотни тысяч экологических и диетических химических веществ. Во-вторых, все эти ферменты также имеют в качестве субстрата нормальные соединения организма; ни один из этих ферментов не метаболизирует только чужеродные химические вещества.

На протяжении более четырех десятилетий метаболические процессы, опосредованные этими ферментами, обычно классифицировались как реакции Фазы I или Фазы II (рис. 3).). Реакции фазы I («функционализация») обычно включают относительно незначительные структурные модификации исходного химического вещества посредством окисления, восстановления или гидролиза с целью получения более водорастворимого метаболита. Часто реакции Фазы I обеспечивают «ручку» для дальнейшей модификации соединения последующими реакциями Фазы II. Реакции фазы I в основном опосредованы надсемейством высокоуниверсальных ферментов, которые в совокупности называются цитохромами Р450, хотя могут быть вовлечены и другие надсемейства ферментов (рис. 4).

Рисунок 3. Классическое обозначение ферментов фазы I и фазы II, метаболизирующих ксенобиотики или лекарственные препараты.

Рисунок 4. Примеры ферментов, метаболизирующих лекарственные средства.

Реакции фазы II включают соединение водорастворимой эндогенной молекулы с химическим веществом (исходным химическим веществом или метаболитом фазы I) для облегчения экскреции. Реакции фазы II часто называют реакциями «конъюгации» или «дериватизации». Ферментные суперсемейства, катализирующие реакции Фазы II, обычно называют в соответствии с участвующим эндогенным конъюгирующим фрагментом: например, ацетилирование N-ацетилтрансферазами, сульфатирование сульфотрансферазами, конъюгирование глутатиона глутатионтрансферазами и глюкуронидирование глюкуронозилтрансферазами UDP (рис. 4). . Хотя основным органом метаболизма лекарственных средств является печень, уровни некоторых ферментов, метаболизирующих лекарственные средства, довольно высоки в желудочно-кишечном тракте, гонадах, легких, головном мозге и почках, и такие ферменты, несомненно, в той или иной степени присутствуют в каждой живой клетке.

Ферменты, метаболизирующие ксенобиотики, представляют собой обоюдоострые Мечи

По мере того, как мы узнаем больше о биологических и химических процессах, ведущих к нарушениям здоровья человека, становится все более очевидным, что ферменты, метаболизирующие лекарства, функционируют двойственным образом (рис. 3). В большинстве случаев жирорастворимые химические вещества превращаются в более легко выводимые из организма водорастворимые метаболиты. Однако ясно, что во многих случаях одни и те же ферменты способны превращать другие инертные химические вещества в высокореакционноспособные молекулы. Затем эти промежуточные соединения могут взаимодействовать с клеточными макромолекулами, такими как белки и ДНК. Таким образом, для каждого химического вещества, воздействию которого подвергаются люди, существует потенциал для конкурирующих путей проникновения. метаболическая активация и детоксификация.

Краткий обзор генетики

В генетике человека каждый ген (локусы) расположен на одной из 23 пар хромосом. Два аллели (по одной на каждой хромосоме пары) могут быть одинаковыми, а могут отличаться друг от друга. Например, B и b аллели, в которых B (карие глаза) доминирует над b (голубые глаза): лица с кареглазым фенотипом могут иметь либо BB or Bb генотипы, тогда как особи голубоглазого фенотипа могут иметь только bb генотип.

A полиморфизм определяется как два или более стабильно наследуемых фенотипа (признака), происходящих от одного и того же гена (генов), которые сохраняются в популяции, часто по причинам, не обязательно очевидным. Чтобы ген был полиморфным, продукт гена не должен быть необходим для развития, репродуктивной силы или других важных жизненных процессов. На самом деле, «сбалансированный полиморфизм», при котором гетерозигота имеет явное преимущество в выживании по сравнению с гомозиготой (например, устойчивость к малярии и аллель серповидноклеточного гемоглобина), является распространенным объяснением сохранения аллеля в популяции на необъяснимо высоком уровне. частоты (см. Гонсалес и Неберт, 1990).

Человеческий полиморфизм ферментов, метаболизирующих ксенобиотики

Генетические различия в метаболизме различных лекарств и химических веществ окружающей среды известны уже более четырех десятилетий (Kalow, 1962 и 1992). Эти различия часто называют фармакогенетический или, в более широком смысле, экогенетические полиморфизмы. Эти полиморфизмы представляют собой вариантные аллели, которые встречаются с относительно высокой частотой в популяции и обычно связаны с аберрациями в экспрессии или функции фермента. Исторически сложилось так, что полиморфизмы обычно выявляли после неожиданных ответов на терапевтические агенты. Совсем недавно технология рекомбинантной ДНК позволила ученым определить точные изменения в генах, ответственных за некоторые из этих полиморфизмов. В настоящее время полиморфизмы охарактеризованы во многих ферментах, метаболизирующих лекарственные средства, включая ферменты фазы I и фазы II. По мере того, как выявляется все больше и больше полиморфизмов, становится все более очевидным, что каждый человек может обладать отличным набором ферментов, метаболизирующих лекарственные средства. Это разнообразие можно описать как «метаболический отпечаток пальца». Именно сложное взаимодействие различных суперсемейств ферментов, метаболизирующих лекарство, внутри любого человека в конечном итоге определяет его или ее особую реакцию на данное химическое вещество (Kalow, 1962 и 1992; Nebert, 1988; Gonzalez and Nebert, 1990; Nebert and Weber, 1990).

Экспрессия ферментов, метаболизирующих ксенобиотики человека, в клетке Культура

Как мы можем разработать более совершенные предикторы токсической реакции человека на химические вещества? Успехи в определении множества ферментов, метаболизирующих лекарства, должны сопровождаться точными знаниями о том, какие ферменты определяют метаболическую судьбу отдельных химических веществ. Данные, полученные в результате лабораторных исследований на грызунах, безусловно, дали полезную информацию. Однако значительные межвидовые различия в ферментах, метаболизирующих ксенобиотики, требуют осторожности при экстраполяции данных на человеческие популяции. Чтобы преодолеть эту трудность, многие лаборатории разработали системы, в которых различные клеточные линии в культуре могут быть сконструированы для производства функциональных ферментов человека, которые являются стабильными и в высоких концентрациях (Gonzalez, Crespi and Gelboin 1991). Успешное производство ферментов человека было достигнуто в различных клеточных линиях из таких источников, как бактерии, дрожжи, насекомые и млекопитающие.

Чтобы еще точнее определить метаболизм химических веществ, несколько ферментов также были успешно получены в одной клеточной линии (Gonzalez, Crespi and Gelboin 1991). Такие клеточные линии дают ценную информацию о точных ферментах, участвующих в метаболической обработке любого данного соединения и вероятных токсичных метаболитов. Если эту информацию затем можно объединить со знаниями о присутствии и уровне фермента в тканях человека, эти данные должны предоставить ценные предикторы ответа.

Cytochrome P450

История и номенклатура

Надсемейство цитохромов Р450 является одним из наиболее изученных надсемейств ферментов, метаболизирующих лекарственные средства, обладающим значительной индивидуальной изменчивостью в ответ на химические вещества. Цитохром Р450 — удобный общий термин, используемый для описания большого суперсемейства ферментов, играющих ключевую роль в метаболизме бесчисленных эндогенных и экзогенных субстратов. Срок цитохром P450 Впервые был придуман в 1962 году для описания неизвестного пигмент в клетках, которые при восстановлении и связывании с окисью углерода давали характерный пик поглощения при 450 нм. С начала 1980-х годов технология клонирования кДНК привела к замечательному пониманию множества ферментов цитохрома Р450. На сегодняшний день идентифицировано более 400 различных генов цитохрома Р450 у животных, растений, бактерий и дрожжей. Было подсчитано, что любой вид млекопитающих, например человек, может обладать 60 или более различными генами P450 (Nebert and Nelson 1991). Множественность генов P450 потребовала разработки стандартизированной системы номенклатуры (Nebert et al., 1987; Nelson et al., 1993). Система номенклатуры, впервые предложенная в 1987 г. и обновляемая раз в два года, основана на дивергентной эволюции сравнений аминокислотных последовательностей между белками P450. Гены P450 делятся на семейства и подсемейства: ферменты внутри семейства демонстрируют сходство аминокислот более чем на 40%, а ферменты в пределах одного подсемейства - на 55%. Гены P450 названы корневым символом CYP за которым следует арабская цифра, обозначающая семейство P450, буква, обозначающая подсемейство, и еще одна арабская цифра, обозначающая индивидуальный ген (Nelson et al. 1993; Nebert et al. 1991). Таким образом, CYP1A1, представляет ген 450 P1 в семействе 1 и подсемействе A.

По состоянию на февраль 1995 года насчитывается 403 CYP генов в базе данных, состоящей из 59 семейств и 105 подсемейств. К ним относятся восемь семейств низших эукариот, 15 семейств растений и 19 семейств бактерий. 15 семейств генов P450 человека включают 26 подсемейств, 22 из которых были картированы в хромосомах на большей части генома. Некоторые последовательности явно ортологичны для многих видов, например, только одна CYP17 (стероид 17α-гидроксилазы) обнаружен у всех исследованных к настоящему времени позвоночных; другие последовательности внутри подсемейства сильно продублированы, что делает невозможным идентификацию ортологичных пар (например, CYP2C подсемейство). Интересно, что человек и дрожжи имеют общий ортологичный ген в CYP51 семья. Читателям, которым нужна дополнительная информация о надсемействе P450, доступны многочисленные всеобъемлющие обзоры (Нельсон и др., 1993; Неберт и др., 1991; Неберт и Маккиннон, 1994; Генгерих, 1993; Гонсалес, 1992).

Успех номенклатурной системы Р450 привел к тому, что сходные терминологические системы были разработаны для UDP-глюкуронозилтрансфераз (Burchell et al., 1991) и флавинсодержащих монооксигеназ (Lawton et al., 1994). Аналогичные номенклатурные системы, основанные на дивергентной эволюции, также находятся в стадии разработки для нескольких других надсемейств ферментов, метаболизирующих лекарственные средства (например, сульфотрансфераз, эпоксидгидролаз и альдегиддегидрогеназ).

Недавно мы разделили суперсемейство генов P450 млекопитающих на три группы (Nebert and McKinnon 1994) — те, что участвуют главным образом в чужеродном химическом метаболизме, те, которые участвуют в синтезе различных стероидных гормонов, и те, которые участвуют в других важных эндогенных функциях. Именно ферменты P450, метаболизирующие ксенобиотики, имеют наибольшее значение для прогнозирования токсичности.

Ферменты P450, метаболизирующие ксенобиотики

Ферменты Р450, участвующие в метаболизме чужеродных соединений и лекарств, почти всегда встречаются в семьях. CYP1, CYP2, CYP3 и CYP4. Эти ферменты P450 катализируют широкий спектр метаболических реакций, при этом один фермент P450 часто способен метаболизировать множество различных соединений. Кроме того, несколько ферментов Р450 могут метаболизировать одно соединение в разных местах. Кроме того, соединение может метаболизироваться в одном и том же месте несколькими P450, хотя и с разной скоростью.

Наиболее важным свойством ферментов Р450, метаболизирующих лекарственные средства, является то, что многие из этих генов индуцируются теми самыми веществами, которые служат их субстратами. С другой стороны, другие гены Р450 индуцируются несубстратами. Этот феномен индукции ферментов лежит в основе многих лекарственных взаимодействий, имеющих терапевтическое значение.

Хотя эти конкретные ферменты Р450 присутствуют во многих тканях, они обнаруживаются в относительно высоких количествах в печени, основном месте метаболизма лекарств. Некоторые ферменты Р450, метаболизирующие ксенобиотики, проявляют активность в отношении определенных эндогенных субстратов (например, арахидоновой кислоты). Однако обычно считается, что большинство из этих ферментов Р450, метаболизирующих ксенобиотики, не играют важной физиологической роли, хотя это еще не установлено экспериментально. Селективное гомозиготное разрушение или «нокаут» отдельных метаболизирующих ксенобиотики генов P450 с помощью методологий нацеливания на гены у мышей, вероятно, скоро предоставит однозначную информацию в отношении физиологических ролей метаболизирующих ксенобиотики P450 (для обзора нацеливание на гены, см. Capecchi 1994).

В отличие от семейств Р450, кодирующих ферменты, участвующие в основном в физиологических процессах, семейства, кодирующие ферменты Р450, метаболизирующие ксенобиотики, демонстрируют выраженную видовую специфичность и часто содержат много активных генов на подсемейство (Nelson et al., 1993; Nebert et al., 1991). Учитывая очевидный недостаток физиологических субстратов, возможно, ферменты Р450 в семействах CYP1, CYP2, CYP3 и CYP4 которые появились в последние несколько сотен миллионов лет, развились как средство детоксикации чужеродных химических веществ, встречающихся в окружающей среде и пище. Ясно, что эволюция метаболизирующих ксенобиотиков P450 должна была произойти в течение периода времени, который намного предшествует синтезу большинства синтетических химических веществ, воздействию которых сейчас подвергаются люди. Гены этих четырех генных семейств, возможно, эволюционировали и разошлись у животных из-за их воздействия на них метаболитов растений в течение последних 1.2 миллиарда лет — процесс, описательно названный «войной животных и растений» (Gonzalez and Nebert, 1990). Война между животными и растениями — это явление, при котором растения вырабатывают новые химические вещества (фитоалексины) в качестве защитного механизма, чтобы предотвратить попадание в организм животных, а животные, в свою очередь, реагируют, вырабатывая новые гены P450 для приспособления к разнообразным субстратам. Дополнительным стимулом для этого предложения являются недавно описанные примеры химической войны между растениями и насекомыми и растениями и грибами, включающей детоксикацию P450 токсичных субстратов (Nebert 1994).

Ниже приводится краткое введение в некоторые полиморфизмы фермента P450, метаболизирующие ксенобиотики человека, в которых генетические детерминанты токсического ответа, как считается, имеют большое значение. До недавнего времени полиморфизмы Р450 обычно предполагались по неожиданным различиям в реакции пациентов на вводимые терапевтические агенты. Некоторые полиморфизмы Р450 действительно названы в соответствии с лекарством, с которым полиморфизм был впервые идентифицирован. Совсем недавно исследовательские усилия были сосредоточены на идентификации точных ферментов P450, участвующих в метаболизме химических веществ, для которых наблюдается дисперсия, и на точной характеристике вовлеченных генов P450. Как описано ранее, измеримую активность фермента Р450 по отношению к модельному химическому веществу можно назвать фенотипом. Аллельные различия в гене Р450 для каждого человека называются генотипом Р450. По мере того, как все больше и больше внимания уделяется анализу генов P450, точная молекулярная основа ранее задокументированной фенотипической изменчивости становится все более ясной.

Подсемейство CYP1A

Ассоциация CYP1A подсемейство включает два фермента человека и всех других млекопитающих: они обозначаются CYP1A1 и CYP1A2 по стандартной номенклатуре P450. Эти ферменты представляют значительный интерес, поскольку они участвуют в метаболической активации многих проканцерогенов, а также индуцируются некоторыми соединениями, представляющими токсикологическую опасность, включая диоксин. Например, CYP1A1 метаболически активирует многие соединения, содержащиеся в сигаретном дыме. CYP1A2 метаболически активирует многие ариламины, связанные с раком мочевого пузыря, которые встречаются в производстве химических красителей. CYP1A2 также метаболически активирует 4-(метилнитрозамино)-1-(3-пиридил)-1-бутанон (NNK), нитрозамин, полученный из табака. CYP1A1 и CYP1A2 также обнаруживаются на более высоких уровнях в легких курильщиков сигарет из-за индукции полициклическими углеводородами, присутствующими в дыме. Таким образом, уровни активности CYP1A1 и CYP1A2 считаются важными детерминантами индивидуальной реакции на многие потенциально токсичные химические вещества.

Токсикологический интерес к CYP1A подсемейство было значительно усилено отчетом 1973 г., в котором была установлена ​​связь уровня индуцируемости CYP1A1 у курильщиков сигарет с индивидуальной предрасположенностью к раку легких (Kellermann, Shaw and Luyten-Kellermann, 1973). Молекулярная основа индукции CYP1A1 и CYP1A2 была в центре внимания многочисленных лабораторий. Процесс индукции опосредуется белком, называемым рецептором Ah, с которым связываются диоксины и структурно родственные химические вещества. Имя Ah происходит от aрыл hуглеводородная природа многих индукторов CYP1A. Интересно, что различия в гене, кодирующем рецептор Ah, между линиями мышей приводят к заметным различиям в химической реакции и токсичности. Полиморфизм гена рецептора Ah также встречается у людей: примерно у одной десятой населения наблюдается высокая индукция CYP1A1, и они могут подвергаться большему, чем остальные девять десятых населения, риску развития некоторых видов рака, вызванных химическим воздействием. Роль Ah-рецептора в контроле ферментов CYP1A подсемейство и его роль как фактора, определяющего реакцию человека на химическое воздействие, были предметом нескольких недавних обзоров (Неберт, Петерсен и Пуга, 1991; Неберт, Пуга и Василиу, 1993).

Существуют ли другие полиморфизмы, которые могут контролировать уровень белков CYP1A в клетке? полиморфизм в. CYP1A1, ген также был идентифицирован, и он, по-видимому, влияет на риск развития рака легких среди японских курильщиков сигарет, хотя тот же самый полиморфизм, по-видимому, не влияет на риск в других этнических группах (Nebert and McKinnon 1994).

CYP2C19

Различия в скорости метаболизма противосудорожного препарата (S)-мефенитоина у людей хорошо документированы в течение многих лет (Guengerich, 1989). От 2% до 5% представителей европеоидной расы и до 25% жителей Азии испытывают дефицит этой активности и могут подвергаться большему риску токсичности от препарата. Давно известно, что этот дефект фермента связан с членом человеческого CYP2C подсемейство, но точная молекулярная основа этого дефицита была предметом серьезных споров. Основной причиной этой трудности были шесть или более генов в человеческом организме. CYP2C подсемейство. Однако недавно было продемонстрировано, что однонуклеотидная мутация в CYP2C19 ген является основной причиной этого дефицита (Goldstein and de Morais 1994). Также был разработан простой ДНК-тест, основанный на полимеразной цепной реакции (ПЦР), для быстрой идентификации этой мутации в популяциях людей (Goldstein and de Morais, 1994).

CYP2D6

Возможно, наиболее широко охарактеризованная вариация гена Р450 связана с CYP2D6 ген. Описано более дюжины примеров мутаций, перестроек и делеций, влияющих на этот ген (Meyer 1994). Этот полиморфизм был впервые предложен 20 лет назад на основании клинической вариабельности реакции пациентов на антигипертензивный препарат дебризохин. Изменения в CYP2D6 ген, приводящий к изменению активности фермента, поэтому все вместе называются полиморфизм дебризохина.

До появления исследований на основе ДНК люди классифицировались как люди с плохим или интенсивным метаболизмом (PM, EM) дебризохина на основании концентрации метаболитов в образцах мочи. Теперь ясно, что изменения в CYP2D6 ген может привести к тому, что у людей будет проявляться не только плохой или интенсивный метаболизм дебризохина, но и сверхбыстрый метаболизм. Большинство изменений в CYP2D6 гена связаны с частичным или полным дефицитом функции фермента; однако недавно были описаны особи в двух семьях, обладающие множественными функциональными копиями CYP2D6 ген, приводящий к сверхбыстрому метаболизму субстратов CYP2D6 (Meyer 1994). Это замечательное наблюдение дает новое представление о широком спектре активности CYP2D6, ранее наблюдаемом в популяционных исследованиях. Изменения в функции CYP2D6 имеют особое значение, учитывая, что более 30 обычно назначаемых препаратов метаболизируются этим ферментом. Индивидуальная функция CYP2D6, таким образом, является основной детерминантой как терапевтического, так и токсического ответа на проводимую терапию. Действительно, недавно утверждалось, что рассмотрение статуса CYP2D6 пациента необходимо для безопасного использования как психиатрических, так и сердечно-сосудистых препаратов.

Роль CYP2D6 полиморфизм как определяющий фактор индивидуальной предрасположенности человека к таким заболеваниям, как рак легких и болезнь Паркинсона, также был предметом интенсивных исследований (Nebert and McKinnon 1994; Meyer 1994). Хотя выводы сделать сложно, учитывая разнообразный характер используемых протоколов исследований, большинство исследований, по-видимому, указывают на связь между активными метаболизаторами дебризохина (фенотип ЭМ) и раком легких. Причины такой ассоциации в настоящее время неясны. Однако было показано, что фермент CYP2D6 метаболизирует NNK, нитрозамины, полученные из табака.

По мере совершенствования анализов на основе ДНК, позволяющих еще более точно оценивать статус CYP2D6, ожидается, что будет выяснена точная взаимосвязь CYP2D6 с риском заболевания. В то время как экстенсивный метаболизатор может быть связан с предрасположенностью к раку легких, слабый метаболизатор (фенотип PM), по-видимому, связан с болезнью Паркинсона неизвестной причины. Хотя эти исследования также трудно сравнивать, оказывается, что у лиц с ПМ, имеющих сниженную способность метаболизировать субстраты CYP2D6 (например, дебризохин), риск развития болезни Паркинсона повышен в 2–2.5 раза.

CYP2E1

Ассоциация CYP2E1 ген кодирует фермент, который метаболизирует многие химические вещества, в том числе лекарства и многие низкомолекулярные канцерогены. Этот фермент также представляет интерес, поскольку он сильно индуцируется алкоголем и может играть роль в повреждении печени, вызванном такими химическими веществами, как хлороформ, винилхлорид и четыреххлористый углерод. Фермент в основном содержится в печени, и уровень фермента заметно различается у разных людей. Тщательное изучение CYP2E1 ген привел к идентификации нескольких полиморфизмов (Nebert and McKinnon 1994). Сообщалось о связи между наличием определенных структурных вариаций в CYP2E1 ген и очевидное снижение риска рака легких в некоторых исследованиях; однако существуют явные межэтнические различия, которые требуют уточнения этой возможной связи.

Подсемейство CYP3A

У человека четыре фермента были идентифицированы как члены CYP3A подсемейства из-за их сходства в аминокислотной последовательности. Ферменты CYP3A метаболизируют многие обычно назначаемые препараты, такие как эритромицин и циклоспорин. Канцерогенный пищевой контаминант афлатоксин B₁ также является субстратом CYP3A. Один из членов человеческого CYP3A подсемейство, обозначенное CYP3A4,, является основным P450 в печени человека, а также присутствует в желудочно-кишечном тракте. Как и для многих других ферментов P450, уровень CYP3A4 сильно различается у разных людей. Второй фермент, обозначенный CYP3A5, обнаружен только примерно в 25% печени; генетическая основа этого вывода не выяснена. Важность вариабельности CYP3A4 или CYP3A5 как фактора генетических детерминант токсического ответа еще не установлена ​​(Nebert and McKinnon, 1994).

Полиморфизмы, отличные от P450

Многочисленные полиморфизмы также существуют в других надсемействах ферментов, метаболизирующих ксенобиотики (например, глутатионтрансферазы, UDP-глюкуронозилтрансферазы, параоксоназы, дегидрогеназы, N-ацетилтрансферазы и флавинсодержащие монооксигеназы). Поскольку окончательная токсичность любого промежуточного продукта, генерируемого P450, зависит от эффективности последующих реакций детоксикации Фазы II, комбинированная роль множественных полиморфизмов ферментов важна для определения восприимчивости к химически индуцированным заболеваниям. Таким образом, метаболический баланс между реакциями Фазы I и Фазы II (рис. 3), вероятно, является основным фактором химических заболеваний человека и генетическими детерминантами токсической реакции.

Полиморфизм гена GSTM1

Хорошо изученным примером полиморфизма фермента фазы II является полиморфизм члена надсемейства ферментов глутатион-S-трансферазы, обозначенного как GST mu или GSTM1. Этот конкретный фермент представляет значительный токсикологический интерес, поскольку он, по-видимому, участвует в последующей детоксикации токсичных метаболитов, образующихся из химических веществ, содержащихся в сигаретном дыме, с помощью фермента CYP1A1. Выявленный полиморфизм в этом гене глутатионтрансферазы включает полное отсутствие функционального фермента почти у половины всех изученных представителей европеоидной расы. Этот недостаток фермента фазы II, по-видимому, связан с повышенной восприимчивостью к раку легких. Путем группировки лиц по обоим вариантам CYP1A1, гены и делеция или наличие функциональной GSM1 гена было продемонстрировано, что риск развития рака легких, вызванного курением, значительно различается (Kawajiri, Watanabe and Hayashi 1994). В частности, особи с одним редким CYP1A1, изменение гена в сочетании с отсутствием GSM1 ген, подвергались более высокому риску (в девять раз) развития рака легких при воздействии относительно небольшого количества сигаретного дыма. Интересно, что, по-видимому, существуют межэтнические различия в значении вариантных генов, которые требуют дальнейшего изучения, чтобы выяснить точную роль таких изменений в восприимчивости к болезням (Kalow, 1962; Nebert and McKinnon, 1994; Kawajiri, Watanabe and Hayashi, 1994).

Синергический эффект двух и более полиморфизмов на токсический ответ

Токсическая реакция на агент окружающей среды может быть сильно преувеличена комбинацией двух фармакогенетических дефектов у одного и того же человека, например, комбинированными эффектами полиморфизма N-ацетилтрансферазы (NAT2) и полиморфизма глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (G6PD). .

Профессиональное воздействие ариламинов представляет собой серьезный риск рака мочевого пузыря. После элегантных исследований Cartwright в 1954 году стало ясно, что статус N-ацетилятора является определяющим фактором рака мочевого пузыря, вызванного азокрасителем. Существует высокодостоверная корреляция между фенотипом медленного ацетилятора и возникновением рака мочевого пузыря, а также степенью инвазивности этого рака в стенку мочевого пузыря. Напротив, существует значительная связь между фенотипом быстрого ацетилятора и заболеваемостью колоректальной карциномой. N-ацетилтрансфераза (англ.НАТ1, НАТ2) гены были клонированы и секвенированы, а анализы на основе ДНК теперь способны обнаруживать более дюжины аллельных вариантов, которые объясняют фенотип медленного ацетилятора. NAT2 ген является полиморфным и отвечает за большую часть изменчивости токсической реакции на химические вещества окружающей среды (Weber 1987; Grant 1993).

Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (Г6ФД) является ферментом, имеющим решающее значение для образования и поддержания НАДФН. Низкая или отсутствующая активность G6PD может привести к тяжелому гемолизу, вызванному лекарственными препаратами или ксенобиотиками, из-за отсутствия нормальных уровней восстановленного глутатиона (GSH) в эритроцитах. Дефицит G6PD затрагивает не менее 300 миллионов человек во всем мире. Более 10% афроамериканских мужчин демонстрируют менее тяжелый фенотип, в то время как в некоторых сардинских общинах проявляется более тяжелый «средиземноморский тип» с частотой до одного из трех человек. Г6ФД ген был клонирован и локализован в Х-хромосоме, а многочисленные разнообразные точечные мутации объясняют большую степень фенотипической гетерогенности, наблюдаемую у индивидуумов с дефицитом G6PD (Beutler 1992).

Было обнаружено, что тиозалсульфон, ариламинсульфатный препарат, вызывает бимодальное распределение гемолитической анемии у пациентов, получавших лечение. При лечении определенными препаратами люди с сочетанием дефицита G6PD и фенотипа медленного ацетилятора страдают больше, чем люди с дефицитом G6PD или только с фенотипом медленного ацетилятора. Медленные ацетиляторы с дефицитом G6PD по крайней мере в 40 раз более восприимчивы, чем нормальные G6PD быстрые ацетиляторы, к гемолизу, индуцированному тиозалсульфоном.

Влияние генетических полиморфизмов на оценку воздействия

Для оценки воздействия и биомониторинга (рис. 1) также требуется информация о генетическом составе каждого человека. При идентичном воздействии опасного химического вещества уровень аддуктов гемоглобина (или других биомаркеров) может варьироваться на два или три порядка у разных людей, в зависимости от метаболических характеристик каждого человека.

Такая же комбинированная фармакогенетика была изучена у рабочих химических заводов в Германии (таблица 1). Аддукты гемоглобина среди рабочих, подвергшихся воздействию анилина и ацетанилида, намного выше у медленных ацетиляторов с дефицитом G6PD по сравнению с другими возможными комбинированными фармакогенетическими фенотипами. Это исследование имеет важные последствия для оценки воздействия. Эти данные показывают, что, хотя два человека могут подвергаться воздействию опасного химического вещества при одинаковом уровне окружающей среды на рабочем месте, степень воздействия (через биомаркеры, такие как аддукты гемоглобина) может быть оценена как на два или более порядка меньше из-за обусловленной генетической предрасположенностью человека. Точно так же результирующий риск неблагоприятного воздействия на здоровье может варьироваться на два или более порядка.

Таблица 1: Аддукты гемоглобина у рабочих, подвергшихся воздействию анилина и ацетанилида

Источник: адаптировано из Lewalter and Korallus 1985.

Генетические различия в связывании, а также в метаболизме

Следует подчеркнуть, что тот же самый случай, сделанный здесь для метаболизма, может быть сделан и для связывания. Наследственные различия в связывании агентов окружающей среды будут сильно влиять на токсическую реакцию. Например, различия в мышах кубический дециметр ген может сильно влиять на индивидуальную чувствительность к кадмий-индуцированному некрозу яичек (Taylor, Heiniger and Meier, 1973). Различия в связывающей способности рецептора Ah, вероятно, влияют на индуцированную диоксином токсичность и рак (Nebert, Petersen and Puga 1991; Nebert, Puga and Vasiliou 1993).

На рисунке 5 обобщена роль метаболизма и связывания в токсичности и раке. Токсичные агенты, поскольку они существуют в окружающей среде или после метаболизма или связывания, проявляют свои эффекты либо генотоксическим путем (при котором происходит повреждение ДНК), либо негенотоксическим путем (при котором не обязательно происходит повреждение ДНК и мутагенез). Интересно, что недавно стало ясно, что «классические» агенты, повреждающие ДНК, могут действовать через зависимый от восстановленного глутатиона (GSH) негенотоксический путь передачи сигнала, который инициируется на поверхности клетки или вблизи нее в отсутствие ДНК и вне ядра клетки. (Девари и др., 1993). Однако генетические различия в метаболизме и связывании остаются основными детерминантами в контроле различных индивидуальных токсических реакций.

Рисунок 5. Общие способы возникновения токсичности

Роль фермента, метаболизирующего лекарственные средства, в клеточной функции

Генетически обусловленные вариации в функции ферментов, метаболизирующих лекарственные средства, имеют большое значение для определения индивидуальной реакции на химические вещества. Эти ферменты играют ключевую роль в определении судьбы и течения инородного химического вещества после воздействия.

Как показано на рис. 5, значение ферментов, метаболизирующих лекарственные средства, в индивидуальной восприимчивости к химическому воздействию может на самом деле представлять собой гораздо более сложный вопрос, чем это видно из этого простого обсуждения метаболизма ксенобиотиков. Другими словами, в течение последних двух десятилетий особое внимание уделялось механизмам генотоксичности (измерения аддуктов ДНК и аддуктов белков). Однако что, если негенотоксические механизмы не менее важны, чем генотоксические механизмы, в возникновении токсических реакций?

Как упоминалось ранее, физиологическая роль многих ферментов, метаболизирующих лекарственные средства, участвующих в метаболизме ксенобиотиков, точно не определена. Nebert (1994) предположил, что из-за их присутствия на этой планете более 3.5 миллиардов лет ферменты, метаболизирующие лекарственные средства, первоначально (и до сих пор в первую очередь) ответственны за регуляцию клеточных уровней многих непептидных лигандов, важных для активации транскрипции. генов, влияющих на рост, дифференцировку, апоптоз, гомеостаз и нейроэндокринные функции. Кроме того, токсичность большинства, если не всех, агентов окружающей среды возникает посредством агонист or антагонист воздействие на эти пути передачи сигнала (Nebert 1994). Основываясь на этой гипотезе, генетическая изменчивость ферментов, метаболизирующих лекарственные средства, может оказывать весьма сильное влияние на многие критические биохимические процессы внутри клетки, что приводит к важным различиям в токсической реакции. Действительно возможно, что такой сценарий может также лежать в основе многих идиосинкразических побочных реакций, возникающих у пациентов, принимающих обычно назначаемые препараты.

Выводы

За последнее десятилетие мы значительно продвинулись в понимании генетической основы дифференциальной реакции на химические вещества в лекарствах, пищевых продуктах и ​​загрязнителях окружающей среды. Ферменты, метаболизирующие лекарства, оказывают глубокое влияние на то, как люди реагируют на химические вещества. По мере того, как наше понимание множественности ферментов, метаболизирующих лекарственные средства, продолжает развиваться, мы все в большей степени способны делать более точные оценки токсического риска для многих лекарств и экологических химических веществ. Это, возможно, наиболее ярко проиллюстрировано в случае фермента цитохрома Р2 CYP6D450. Используя относительно простые тесты на основе ДНК, можно предсказать вероятную реакцию любого препарата, преимущественно метаболизирующегося этим ферментом; этот прогноз обеспечит более безопасное использование ценных, но потенциально токсичных лекарств.

В будущем, несомненно, произойдет взрыв в идентификации дополнительных полиморфизмов (фенотипов), включающих ферменты, метаболизирующие лекарственные средства. Эта информация будет сопровождаться улучшенными минимально инвазивными тестами на основе ДНК для выявления генотипов в популяциях человека.

Такие исследования должны быть особенно информативными при оценке роли химических веществ во многих экологических заболеваниях неизвестного в настоящее время происхождения. Рассмотрение множественных полиморфизмов ферментов, метаболизирующих лекарственные средства, в комбинации (например, таблица 1), также, вероятно, представляет собой особенно плодотворную область исследований. Такие исследования прояснят роль химических веществ в возникновении рака. В совокупности эта информация должна позволить сформулировать все более индивидуализированные рекомендации по избеганию химических веществ, которые могут представлять интерес для отдельных лиц. Это область профилактической токсикологии. Такой совет, несомненно, очень поможет всем людям справиться с постоянно растущим химическим бременем, которому мы подвергаемся.

Назад