Появление сложных технологий в молекулярной и клеточной биологии стимулировало относительно быстрое развитие наук о жизни, включая токсикологию. По сути, фокус токсикологии смещается от целых животных и популяций целых животных к клеткам и молекулам отдельных животных и людей. С середины 1980-х годов токсикологи начали использовать эти новые методологии для оценки воздействия химических веществ на живые системы. В качестве логического развития такие методы адаптируются для целей тестирования на токсичность. Эти научные достижения в сочетании с социальными и экономическими факторами привели к изменениям в оценке безопасности продукции и потенциального риска.

Экономические факторы конкретно связаны с объемом материалов, которые должны быть испытаны. Каждый год на рынок выводится множество новых косметических, фармацевтических препаратов, пестицидов, химикатов и товаров для дома. Все эти продукты должны быть оценены на предмет их потенциальной токсичности. Кроме того, имеется запас уже используемых химикатов, которые не были должным образом протестированы. Колоссальная задача получения подробной информации о безопасности всех этих химических веществ с использованием традиционных методов испытаний на целых животных была бы дорогостоящей с точки зрения денег и времени, если бы ее вообще можно было выполнить.

Существуют также социальные проблемы, связанные со здоровьем и безопасностью населения, а также растущую обеспокоенность общественности по поводу использования животных для проверки безопасности продукции. Что касается безопасности человека, общественные интересы и группы защиты окружающей среды оказали значительное давление на правительственные учреждения, чтобы они применяли более строгие правила в отношении химических веществ. Недавним примером этого стало движение некоторых экологических групп за запрет хлора и хлорсодержащих соединений в Соединенных Штатах. Одна из причин таких экстремальных действий заключается в том, что большинство этих соединений никогда не подвергались адекватным испытаниям. С токсикологической точки зрения концепция запрета целого класса разнообразных химикатов, основанная только на наличии хлора, является научно несостоятельной и безответственной. Тем не менее, понятно, что с точки зрения общественности должны быть определенные гарантии того, что химические вещества, выбрасываемые в окружающую среду, не представляют значительного риска для здоровья. Такая ситуация подчеркивает необходимость более эффективных и быстрых методов оценки токсичности.

Другая общественная проблема, которая повлияла на область тестирования токсичности, - это благополучие животных. Растущее число групп по защите животных во всем мире решительно возражают против использования целых животных для проверки безопасности продукции. Ведутся активные кампании против производителей косметики, товаров для дома и личной гигиены, фармацевтических препаратов в попытках остановить испытания на животных. Такие усилия в Европе привели к принятию Шестой поправки к Директиве 76/768/ЕЕС (Директива о косметике). Следствием этой Директивы является то, что косметические продукты или косметические ингредиенты, которые были протестированы на животных после 1 января 1998 г., не могут продаваться в Европейском Союзе, за исключением случаев, когда альтернативные методы недостаточно проверены. Хотя эта Директива не имеет юрисдикции в отношении продажи таких продуктов в Соединенных Штатах или других странах, она существенно повлияет на те компании, у которых есть международные рынки, включая Европу.

Концепция альтернатив, которая лежит в основе разработки тестов, отличных от тестов на целых животных, определяется тремя Rs: снижение в количестве используемых животных; утонченность протоколов, чтобы животные испытывали меньше стресса или дискомфорта; и замена текущих испытаний на животных с тестами in vitro (т. е. тестами, проводимыми вне живых животных), компьютерными моделями или тестами на низших позвоночных или беспозвоночных. Три Rбыли представлены в книге, опубликованной в 1959 году двумя британскими учеными, У. М. С. Расселом и Рексом Берчем. Принципы гуманной экспериментальной техники. Рассел и Берч утверждали, что единственный способ получить действительные научные результаты - это гуманное обращение с животными, и считали, что следует разработать методы, позволяющие сократить использование животных и, в конечном итоге, заменить его. Интересно, что принципам, изложенным Расселом и Берчем, уделялось мало внимания до возрождения движения за защиту животных в середине 1970-х годов. Сегодня концепция трех Rs занимает лидирующие позиции в области исследований, тестирования и обучения.

Таким образом, на разработку методологий тестирования in vitro повлияло множество факторов, которые сошлись за последние десять-двадцать лет. Трудно установить, оказал ли бы какой-либо из этих факторов столь сильное влияние на стратегии тестирования токсичности.

Концепция испытаний на токсичность in vitro

В этом разделе основное внимание будет уделено исключительно методам оценки токсичности in vitro как одной из альтернатив тестированию на животных. Дополнительные альтернативы, не связанные с животными, такие как компьютерное моделирование и количественные отношения структура-активность, обсуждаются в других статьях этой главы.

Исследования in vitro обычно проводятся на животных или человеческих клетках или тканях вне организма. In vitro буквально означает «в стекле» и относится к процедурам, проводимым с живым материалом или компонентами живого материала, культивируемыми в чашках Петри или в пробирках при определенных условиях. Их можно противопоставить исследованиям in vivo или исследованиям, проведенным «на живых животных». Хотя трудно, если не невозможно, спроецировать воздействие химического вещества на сложный организм, когда наблюдения ограничиваются одним типом клеток в чашке, исследования in vitro также предоставляют значительный объем информации о внутренней токсичности. как клеточные и молекулярные механизмы токсичности. Кроме того, они обладают многими преимуществами по сравнению с исследованиями in vivo, поскольку они, как правило, менее дороги и могут проводиться в более контролируемых условиях. Кроме того, несмотря на то, что для получения клеток для культур in vitro по-прежнему требуется небольшое количество животных, эти методы можно рассматривать как альтернативы сокращения (поскольку по сравнению с исследованиями in vivo используется намного меньше животных) и альтернативы уточнения (поскольку они устраняют необходимость подвергнуть животных неблагоприятным токсическим последствиям, вызванным экспериментами in vivo).

Чтобы интерпретировать результаты тестов на токсичность in vitro, определить их потенциальную полезность при оценке токсичности и связать их с общим токсикологическим процессом in vivo, необходимо понять, какая часть токсикологического процесса исследуется. Весь токсикологический процесс состоит из событий, которые начинаются с воздействия на организм физического или химического агента, развиваются через клеточные и молекулярные взаимодействия и в конечном итоге проявляются в ответной реакции всего организма. Тесты in vitro обычно ограничиваются той частью токсикологического процесса, которая протекает на клеточном и молекулярном уровне. Типы информации, которую можно получить в результате исследований in vitro, включают пути метаболизма, взаимодействие активных метаболитов с клеточными и молекулярными мишенями и потенциально измеримые токсические конечные точки, которые могут служить молекулярными биомаркерами воздействия. В идеальной ситуации был бы известен механизм токсичности каждого химического вещества в результате воздействия на организм, чтобы можно было полностью интерпретировать информацию, полученную в результате испытаний in vitro, и соотнести ее с реакцией всего организма. Однако это практически невозможно, поскольку полных токсикологических механизмов выяснено относительно немного. Таким образом, токсикологи сталкиваются с ситуацией, когда результаты теста in vitro нельзя использовать в качестве абсолютно точного прогноза токсичности in vivo, поскольку механизм неизвестен. Однако часто в процессе разработки теста in vitro выясняются компоненты клеточного и молекулярного механизма(ов) токсичности.

Один из ключевых нерешенных вопросов, связанных с разработкой и внедрением тестов in vitro, связан со следующим соображением: должны ли они быть механистически обоснованы или достаточно, чтобы они были описательными? Бесспорно, с научной точки зрения лучше использовать только механистически обоснованные тесты вместо тестов in vivo. Однако при отсутствии полных механистических знаний перспектива разработки тестов in vitro, которые в ближайшем будущем полностью заменят тесты на целых животных, практически нулевая. Это, однако, не исключает использования более описательных типов анализов в качестве инструментов раннего скрининга, что имеет место в настоящее время. Эти экраны привели к значительному сокращению использования животных. Следовательно, до тех пор, пока не будет получено больше механистической информации, может оказаться необходимым использовать в более ограниченной степени тесты, результаты которых просто хорошо коррелируют с результатами, полученными in vivo.

Тесты in vitro на цитотоксичность

В этом разделе будет описано несколько тестов in vitro, разработанных для оценки цитотоксического потенциала химического вещества. По большей части эти тесты просты в выполнении, а анализ может быть автоматизирован. Одним из обычно используемых in vitro тестов на цитотоксичность является анализ нейтрального красного. Этот анализ проводится на клетках в культуре, и для большинства применений клетки можно поддерживать в культуральных чашках, которые содержат 96 небольших лунок, каждая диаметром 6.4 мм. Поскольку каждую лунку можно использовать для одного определения, такое расположение позволяет использовать несколько концентраций тестируемого вещества, а также положительные и отрицательные контроли с достаточным количеством повторов для каждого. После обработки клеток различными концентрациями испытуемого химического вещества в диапазоне не менее двух порядков (например, от 0.01 мМ до 1 мМ), а также химическими веществами положительного и отрицательного контроля клетки промывают и обрабатывают нейтральным красным, краситель, который может поглощаться и удерживаться только живыми клетками. Краситель может быть добавлен при удалении испытуемого химического вещества для определения немедленных эффектов или может быть добавлен в разное время после удаления испытуемого химического вещества для определения кумулятивных или отсроченных эффектов. Интенсивность цвета в каждой лунке соответствует количеству живых клеток в этой лунке. Интенсивность окраски измеряют с помощью спектрофотометра, который может быть оснащен планшетным ридером. Считыватель планшетов запрограммирован на выполнение индивидуальных измерений для каждой из 96 лунок чашки для культивирования. Эта автоматизированная методология позволяет исследователю быстро провести эксперимент по зависимости концентрации от реакции и получить статистически полезные данные.

Другим относительно простым тестом на цитотоксичность является МТТ-тест. МТТ (3[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид) представляет собой тетразолиевый краситель, который восстанавливается митохондриальными ферментами до синего цвета. Только клетки с жизнеспособными митохондриями сохранят способность осуществлять эту реакцию; поэтому интенсивность окраски напрямую связана со степенью митохондриальной целостности. Это полезный тест для обнаружения общих цитотоксических соединений, а также тех агентов, которые специально нацелены на митохондрии.

Измерение активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) также используется в качестве универсального анализа цитотоксичности. Этот фермент в норме присутствует в цитоплазме живых клеток и высвобождается в культуральную среду через негерметичные клеточные мембраны мертвых или умирающих клеток, подвергшихся неблагоприятному воздействию токсического агента. Небольшие количества культуральной среды могут быть удалены в разное время после химической обработки клеток для измерения количества высвобождаемой ЛДГ и определения динамики токсичности во времени. Хотя анализ высвобождения ЛДГ является очень общей оценкой цитотоксичности, он полезен, поскольку его легко выполнить и его можно проводить в режиме реального времени.

В настоящее время разрабатывается много новых методов для обнаружения клеточных повреждений. Более сложные методы используют флуоресцентные зонды для измерения различных внутриклеточных параметров, таких как высвобождение кальция и изменения рН и мембранного потенциала. В целом, эти зонды очень чувствительны и могут обнаруживать более тонкие клеточные изменения, тем самым уменьшая необходимость использования гибели клеток в качестве конечной точки. Кроме того, многие из этих флуоресцентных анализов могут быть автоматизированы с использованием 96-луночных планшетов и ридеров для флуоресцентных планшетов.

После сбора данных о ряде химических веществ с использованием одного из этих тестов можно определить относительную токсичность. Относительная токсичность химического вещества, определенная в тесте in vitro, может быть выражена как концентрация, которая оказывает 50%-ное влияние на конечную реакцию необработанных клеток. Это определение упоминается как EC₅₀ (Eрезультативный Cконцентрация на 50% клеток) и может использоваться для сравнения токсичности различных химических веществ in vitro. (Аналогичный термин, используемый при оценке относительной токсичности, — ICXNUMX).₅₀, что указывает на концентрацию химического вещества, вызывающую 50% ингибирование клеточного процесса, например, способность поглощать нейтральный красный цвет.) Нелегко оценить, сопоставима ли относительная токсичность химических веществ in vitro с их относительной токсичностью в лабораторных условиях. токсичности в естественных условиях, поскольку в системе in vivo существует так много смешанных факторов, таких как токсикокинетика, метаболизм, репаративные и защитные механизмы. Кроме того, поскольку большинство этих анализов измеряют конечные точки общей цитотоксичности, они не основаны на механистическом подходе. Таким образом, совпадение относительной токсичности in vitro и in vivo является просто корреляционным. Несмотря на многочисленные сложности и трудности экстраполяции данных in vitro на in vivo, эти тесты in vitro оказались очень ценными, поскольку они просты и недороги в выполнении и могут использоваться в качестве скрининга для выявления высокотоксичных лекарств или химических веществ на ранних стадиях. разработка.

Токсичность органа-мишени

Тесты in vitro также можно использовать для оценки специфической токсичности органов-мишеней. Существует ряд трудностей, связанных с разработкой таких тестов, наиболее заметной из которых является неспособность систем in vitro поддерживать многие характеристики органа in vivo. Часто, когда клетки берут у животных и помещают в культуру, они склонны либо к быстрой дегенерации, либо к дедифференцировке, т. Это представляет собой проблему, заключающуюся в том, что в течение короткого периода времени, обычно нескольких дней, культуры перестают быть полезными для оценки органоспецифических эффектов токсина.

Многие из этих проблем решаются благодаря последним достижениям в области молекулярной и клеточной биологии. Информация, полученная о клеточной среде in vivo, может быть использована для модулирования условий культивирования in vitro. С середины 1980-х годов были открыты новые факторы роста и цитокины, и многие из них в настоящее время коммерчески доступны. Добавление этих факторов к клеткам в культуре помогает сохранить их целостность, а также может способствовать сохранению более дифференцированных функций в течение более длительных периодов времени. Другие фундаментальные исследования расширили знания о пищевых и гормональных потребностях клеток в культуре, так что теперь можно создавать новые среды. Недавние успехи также были достигнуты в идентификации как встречающихся в природе, так и искусственных внеклеточных матриц, на которых можно культивировать клетки. Культивирование клеток на этих различных матрицах может оказывать сильное влияние как на их структуру, так и на функцию. Основным преимуществом, полученным из этих знаний, является возможность сложно контролировать среду клеток в культуре и индивидуально исследовать влияние этих факторов на основные клеточные процессы и на их реакцию на различные химические агенты. Короче говоря, эти системы могут обеспечить глубокое понимание органоспецифических механизмов токсичности.

Многие исследования токсичности для органов-мишеней проводятся на первичных клетках, которые по определению являются свежевыделенными из органа и обычно демонстрируют ограниченное время жизни в культуре. Есть много преимуществ в получении первичных культур одного типа клеток из органа для оценки токсичности. С механистической точки зрения такие культуры полезны для изучения конкретных клеточных мишеней химического вещества. В некоторых случаях два или более типов клеток из органа могут культивироваться вместе, и это дает дополнительное преимущество, заключающееся в возможности изучения межклеточных взаимодействий в ответ на токсин. Некоторые системы совместного культивирования кожи были разработаны таким образом, что они образуют трехмерную структуру, напоминающую кожу in vivo. Также возможно совместное культивирование клеток из разных органов, например печени и почек. Этот тип культуры был бы полезен для оценки эффектов, характерных для клеток почек, химического вещества, которое должно быть биоактивировано в печени.

Молекулярно-биологические инструменты также сыграли важную роль в разработке непрерывных клеточных линий, которые могут быть полезны для тестирования токсичности органов-мишеней. Эти клеточные линии создаются путем трансфекции ДНК в первичные клетки. В процедуре трансфекции клетки и ДНК обрабатывают таким образом, чтобы ДНК могла быть поглощена клетками. ДНК обычно происходит от вируса и содержит ген или гены, экспрессия которых позволяет клеткам стать иммортализованными (т. е. способными жить и расти в течение продолжительных периодов времени в культуре). ДНК также можно сконструировать таким образом, чтобы ген иммортализации контролировался индуцируемым промотором. Преимущество этого типа конструкции состоит в том, что клетки будут делиться только тогда, когда они получат соответствующий химический стимул, позволяющий экспрессировать иммортализующий ген. Примером такой конструкции является большой ген Т-антигена вируса обезьян 40 (SV40) (ген иммортализации), которому предшествует промоторная область гена металлотионеина, который индуцируется присутствием металла в культуральной среде. Таким образом, после трансфекции гена в клетки клетки можно обработать низкими концентрациями цинка для стимуляции промотора МТ и включения экспрессии гена Т-антигена. В этих условиях клетки размножаются. При удалении цинка из среды клетки перестают делиться и в идеальных условиях возвращаются в состояние, в котором они проявляют свои тканеспецифические функции.

Способность генерировать иммортализованные клетки в сочетании с достижениями в технологии культивирования клеток в значительной степени способствовала созданию клеточных линий из многих различных органов, включая мозг, почки и печень. Однако, прежде чем эти клеточные линии можно будет использовать в качестве суррогата для настоящих типов клеток, их необходимо тщательно охарактеризовать, чтобы определить, насколько они «нормальны» на самом деле.

Другие системы in vitro для изучения токсичности органов-мишеней требуют все большей сложности. По мере того, как системы in vitro становятся все более сложными, от одной клетки к культуре целого органа, они становятся более сопоставимыми со средой in vivo, но в то же время их становится гораздо труднее контролировать, учитывая возросшее количество переменных. Следовательно, то, что можно получить при переходе на более высокий уровень организации, может быть потеряно из-за неспособности исследователя контролировать экспериментальную среду. В таблице 1 сравниваются некоторые характеристики различных систем in vitro, которые использовались для изучения гепатотоксичности.

Таблица 1. Сравнение систем in vitro для исследования гепатотоксичности

Прецизионные срезы тканей все шире используются для токсикологических исследований. Доступны новые инструменты, которые позволяют исследователю нарезать однородные срезы ткани в стерильной среде. Срезы ткани имеют некоторое преимущество перед системами культивирования клеток, поскольку присутствуют все типы клеток органа, и они сохраняют свою архитектуру in vivo и межклеточную связь. Таким образом, исследования in vitro могут быть проведены для определения типа клеток-мишеней в органе, а также для изучения специфической токсичности для органа-мишени. Недостатком срезов является то, что они быстро дегенерируют после первых 24 часов культивирования, в основном из-за плохой диффузии кислорода к клеткам внутри срезов. Однако недавние исследования показали, что более эффективная аэрация может быть достигнута за счет мягкого вращения. Это, вместе с использованием более сложной среды, позволяет ломтикам сохраняться до 96 часов.

Тканевые эксплантаты по своей концепции аналогичны срезам тканей и могут также использоваться для определения токсичности химических веществ в определенных органах-мишенях. Тканевые эксплантаты получают путем удаления небольшого кусочка ткани (для исследования тератогенности — интактного эмбриона) и помещения его в культуру для дальнейшего изучения. Культуры эксплантов были полезны для краткосрочных исследований токсичности, включая раздражение и коррозию кожи, исследования асбеста в трахее и исследования нейротоксичности в тканях мозга.

Изолированные перфузируемые органы также могут быть использованы для оценки токсичности органов-мишеней. Эти системы обладают тем же преимуществом, что и срезы тканей и эксплантаты, в том, что присутствуют все типы клеток, но без нагрузки на ткань, вызванной манипуляциями, связанными с приготовлением срезов. Кроме того, они позволяют поддерживать внутриорганные взаимодействия. Основным недостатком является их краткосрочная жизнеспособность, что ограничивает их использование для тестирования токсичности in vitro. В качестве альтернативы эти культуры можно считать усовершенствованием, так как животные не испытывают неблагоприятных последствий обработки токсикантами in vivo. Однако их использование не приводит к значительному уменьшению количества необходимых животных.

Таким образом, существует несколько типов систем in vitro для оценки токсичности органов-мишеней. Можно получить много информации о механизмах токсичности, используя один или несколько из этих методов. Остается трудность в том, чтобы узнать, как экстраполировать систему in vitro, которая представляет собой относительно небольшую часть токсикологического процесса, на весь процесс, происходящий in vivo.

Тесты in vitro на раздражение глаз

Возможно, наиболее спорным тестом на токсичность для целых животных с точки зрения благополучия животных является тест Дрейза на раздражение глаз, который проводится на кроликах. В этом тесте небольшая фиксированная доза химического вещества помещается в один глаз кролика, а другой глаз используется в качестве контроля. Степень раздражения и воспаления оценивают в разное время после воздействия. Предпринимаются серьезные усилия по разработке методологий замены этого теста, который подвергался критике не только из гуманных соображений, но и из-за субъективности наблюдений и изменчивости результатов. Интересно отметить, что, несмотря на резкую критику, которую получил тест Дрейза, он оказался чрезвычайно успешным в прогнозировании раздражителей глаз человека, особенно веществ от слабого до умеренно раздражающего, которые трудно идентифицировать другими методами. Таким образом, спрос на альтернативы in vitro велик.

Поиск альтернатив тесту Дрейза является сложным, хотя и прогнозируется, что он увенчается успехом. Были разработаны многочисленные in vitro и другие альтернативы, а в некоторых случаях они были реализованы. Усовершенствованные альтернативы тесту Дрейза, которые по определению являются менее болезненными или мучительными для животных, включают тест глаза с малым объемом, при котором меньшее количество тестовых материалов помещается в глаза кроликов не только из гуманных соображений, но и для более точно имитировать количество, которому люди могут фактически случайно подвергнуться воздействию. Еще одно уточнение заключается в том, что вещества с рН менее 2 или более 11.5 больше не тестируются на животных, поскольку известно, что они сильно раздражают глаза.

В период с 1980 по 1989 год количество кроликов, используемых для тестирования косметики на раздражение глаз, сократилось примерно на 87%. Тесты in vitro были включены как часть многоуровневого подхода к тестированию, чтобы добиться такого значительного сокращения тестов на целых животных. Этот подход представляет собой многоэтапный процесс, который начинается с тщательного изучения исторических данных о раздражении глаз и физического и химического анализа оцениваемого химического вещества. Если эти два процесса не дают достаточно информации, проводится ряд тестов in vitro. Дополнительные данные, полученные в результате испытаний in vitro, могут быть достаточными для оценки безопасности вещества. Если нет, то последним шагом будет проведение ограниченных тестов in vivo. Легко понять, как этот подход может устранить или, по крайней мере, резко сократить количество животных, необходимых для прогнозирования безопасности тестируемого вещества.

Набор тестов in vitro, который используется как часть этой стратегии многоуровневого тестирования, зависит от потребностей конкретной отрасли. Тесты на раздражение глаз проводятся в самых разных отраслях промышленности, от косметики до фармацевтики и промышленных химикатов. Тип информации, необходимой для каждой отрасли, различается, и поэтому невозможно определить единую группу тестов in vitro. Батарея тестов, как правило, предназначена для оценки пяти параметров: цитотоксичности, изменений в физиологии и биохимии тканей, количественных взаимосвязей между структурой и активностью, медиаторов воспаления, восстановления и репарации. Примером теста на цитотоксичность, которая является одной из возможных причин раздражения, является анализ нейтрального красного с использованием культивируемых клеток (см. выше). Изменения в клеточной физиологии и биохимии, возникающие в результате воздействия химического вещества, можно анализировать в культурах эпителиальных клеток роговицы человека. В качестве альтернативы исследователи также использовали целые или препарированные бычьи или куриные глазные яблоки, полученные на скотобойнях. Многие из конечных точек, измеренных в этих культурах целых органов, такие же, как и измеренные in vivo, такие как помутнение роговицы и отек роговицы.

Воспаление часто является компонентом вызванного химическими веществами поражения глаз, и существует ряд анализов, доступных для изучения этого параметра. Различные биохимические анализы определяют присутствие медиаторов, высвобождаемых во время воспалительного процесса, таких как арахидоновая кислота и цитокины. Хориоаллантоисная мембрана (ХАМ) куриного яйца также может быть использована в качестве индикатора воспаления. В анализе САМ небольшой кусочек скорлупы куриного эмбриона в возрасте от 14 до XNUMX дней удаляют, чтобы обнажить САМ. Затем на САМ наносят химическое вещество, и после этого в разное время оценивают признаки воспаления, такие как сосудистое кровоизлияние.

Одним из самых сложных процессов in vivo для оценки in vitro является восстановление и репарация травмы глаза. Недавно разработанный прибор, кремниевый микрофизиометр, измеряет небольшие изменения внеклеточного pH и может использоваться для мониторинга культивируемых клеток в режиме реального времени. Было показано, что этот анализ довольно хорошо коррелирует с восстановлением in vivo и использовался в качестве теста in vitro для этого процесса. Это был краткий обзор типов тестов, используемых в качестве альтернативы тесту Дрейза на раздражение глаз. Вполне вероятно, что в течение следующих нескольких лет будет определена полная серия наборов тестов in vitro, и каждый из них будет проверен для своей конкретной цели.

Проверка

Ключом к нормативному признанию и внедрению методологий тестирования in vitro является валидация, процесс, посредством которого устанавливается достоверность теста-кандидата для конкретной цели. Усилия по определению и координации процесса валидации были предприняты как в Соединенных Штатах, так и в Европе. Европейский союз учредил Европейский центр проверки альтернативных методов (ECVAM) в 1993 году для координации усилий и взаимодействия с американскими организациями, такими как Центр Джонса Хопкинса по альтернативам испытаниям на животных (CAAT), академический центр в Соединенных Штатах. и Межведомственный координационный комитет по проверке альтернативных методов (ICCVAM), состоящий из представителей Национальных институтов здравоохранения, Агентства по охране окружающей среды США, Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США и Комиссии по безопасности потребительских товаров.

Валидация тестов in vitro требует серьезной организации и планирования. Должен быть консенсус между государственными регулирующими органами, промышленными и академическими учеными в отношении приемлемых процедур, а также достаточный надзор со стороны научного консультативного совета, чтобы обеспечить соответствие протоколов установленным стандартам. Валидационные исследования следует проводить в ряде эталонных лабораторий с использованием калиброванных наборов химических веществ из банка химических веществ и клеток или тканей из одного источника. Должна быть продемонстрирована как внутрилабораторная воспроизводимость, так и межлабораторная воспроизводимость потенциального теста, а результаты должны быть подвергнуты соответствующему статистическому анализу. После того, как результаты различных компонентов валидационных исследований будут собраны, научный консультативный совет может дать рекомендации относительно валидности тестов-кандидатов для конкретной цели. Кроме того, результаты исследований должны быть опубликованы в рецензируемых журналах и помещены в базу данных.

Определение процесса проверки в настоящее время находится в стадии разработки. Каждое новое проверочное исследование будет предоставлять информацию, полезную для разработки следующего исследования. Международное общение и сотрудничество необходимы для быстрой разработки широко приемлемой серии протоколов, особенно с учетом повышенной срочности, вызванной принятием Директивы ЕС по косметике. Это законодательство действительно может дать необходимый импульс для проведения серьезной проверки. Только после завершения этого процесса может начаться принятие методов in vitro различными регулирующими органами.

Заключение

В этой статье представлен широкий обзор текущего состояния испытаний на токсичность in vitro. Наука in vitro токсикология относительно молода, но она развивается экспоненциально. Задача на ближайшие годы состоит в том, чтобы включить механистические знания, полученные в результате клеточных и молекулярных исследований, в обширный перечень данных in vivo, чтобы обеспечить более полное описание токсикологических механизмов, а также установить парадигму, с помощью которой можно использовать данные in vitro. для прогнозирования токсичности in vivo. Только совместными усилиями токсикологов и представителей правительства можно будет реализовать неотъемлемую ценность этих методов in vitro.

Назад

Анализ зависимости структура-активность (SAR) представляет собой использование информации о молекулярной структуре химических веществ для прогнозирования важных характеристик, связанных с стойкостью, распределением, поглощением и абсорбцией, а также токсичностью. SAR — это альтернативный метод выявления потенциально опасных химических веществ, который обещает помочь промышленности и правительствам в определении приоритетности веществ для дальнейшей оценки или для принятия решений на ранней стадии в отношении новых химических веществ. Токсикология становится все более дорогостоящим и ресурсоемким направлением. Возросшие опасения по поводу того, что химические вещества могут вызывать неблагоприятные последствия для подвергающихся воздействию людей, побудили регулирующие органы и органы здравоохранения расширить диапазон и чувствительность тестов для выявления токсикологической опасности. В то же время реальное и предполагаемое бремя регулирования, ложащееся на промышленность, вызвало обеспокоенность по поводу практичности методов тестирования токсичности и анализа данных. В настоящее время определение химической канцерогенности зависит от прижизненного тестирования как минимум двух видов животных обоего пола в нескольких дозах с тщательным гистопатологическим анализом нескольких органов, а также выявлением предопухолевых изменений в клетках и органах-мишенях. В Соединенных Штатах стоимость биоанализа рака оценивается более чем в 3 миллиона долларов (в долларах 1995 года).

Даже при неограниченных финансовых ресурсах бремя тестирования примерно 70,000 1984 существующих химических веществ, производимых сегодня в мире, превысило бы доступные ресурсы подготовленных токсикологов. Потребуются столетия, чтобы завершить даже первую оценку этих химических веществ (NRC 1993). Во многих странах возросли этические опасения по поводу использования животных в тестах на токсичность, что создает дополнительные трудности при использовании стандартных методов тестирования на токсичность. SAR широко используется в фармацевтической промышленности для идентификации молекул, потенциально полезных для лечения (Hansch and Zhang, 1979). В политике охраны окружающей среды и гигиены труда SAR используется для прогнозирования дисперсии соединений в физико-химической среде и для проверки новых химических веществ для дальнейшей оценки потенциальной токсичности. В соответствии с Законом США о контроле за токсичными веществами (TSCA) Агентство по охране окружающей среды с 5 года использует подход SAR в качестве «первой проверки» новых химических веществ в процессе уведомления перед производством (PMN); Австралия использует аналогичный подход в рамках своей новой процедуры уведомления о химических веществах (НИКНАС). В SAR США анализ является важной основой для определения наличия разумных оснований для вывода о том, что производство, переработка, распространение, использование или удаление вещества будет представлять необоснованный риск причинения вреда здоровью человека или окружающей среде, как того требует Раздел 6(f) TSCA. На основании этого вывода Агентство по охране окружающей среды может потребовать реальных испытаний вещества в соответствии с разделом XNUMX TSCA.

Обоснование SAR

Научное обоснование SAR основано на предположении, что молекулярная структура химического вещества предсказывает важные аспекты его поведения в физико-химических и биологических системах (Hansch and Leo, 1979).

Процесс SAR

Процесс рассмотрения SAR включает идентификацию химической структуры, включая эмпирические составы, а также чистое соединение; идентификация структурно-аналогичных веществ; поиск в базах данных и литературе информации о структурных аналогах; анализ токсичности и другие данные о структурных аналогах. В некоторых редких случаях информации только о структуре соединения может быть достаточно для проведения анализа SAR, основанного на хорошо изученных механизмах токсичности. Было составлено несколько баз данных по SAR, а также компьютерные методы прогнозирования молекулярной структуры.

С помощью этой информации с помощью SAR можно оценить следующие конечные точки:

• физико-химические параметры: температура кипения, давление паров, растворимость в воде, коэффициент распределения октанол/вода.
• параметры биологической/экологической судьбы: биодеградация, сорбция почвой, фотодеградация, фармакокинетика
• параметры токсичности: токсичность для водных организмов, абсорбция, острая токсичность для млекопитающих (предельный тест или LD₅₀), раздражение кожи, легких и глаз, сенсибилизация, субхроническая токсичность, мутагенность.

Следует отметить, что не существует методов SAR для таких важных конечных точек для здоровья, как канцерогенность, токсичность для развития, репродуктивная токсичность, нейротоксичность, иммунотоксичность или другие воздействия на органы-мишени. Это связано с тремя факторами: отсутствием большой базы данных для проверки гипотез SAR, отсутствием знаний о структурных детерминантах токсического действия и множественностью клеток-мишеней и механизмов, которые вовлечены в эти конечные точки (см. подход к оценке риска репродуктивных токсикантов и нейротоксических агентов»). Некоторые ограниченные попытки использовать SAR для прогнозирования фармакокинетики с использованием информации о коэффициентах распределения и растворимости (Johanson and Naslund 1988). Для предсказания Р450-зависимого метаболизма ряда соединений и связывания диоксино- и ПХБ-подобных молекул с цитозольным «диоксиновым» рецептором был проведен более обширный количественный SAR (Hansch and Zhang 1993).

Было показано, что SAR имеет различную предсказуемость для некоторых из перечисленных выше конечных точек, как показано в таблице 1. В этой таблице представлены данные двух сравнений прогнозируемой активности с фактическими результатами, полученными путем эмпирических измерений или испытаний на токсичность. SAR, проведенный экспертами Агентства по охране окружающей среды США, оказался хуже для предсказания физико-химических свойств, чем для предсказания биологической активности, включая биодеградацию. Что касается конечных точек токсичности, SAR показал лучшие результаты для прогнозирования мутагенности. Ashby и Tennant (1991) в более расширенном исследовании также обнаружили хорошую предсказуемость краткосрочной генотоксичности при анализе химических веществ NTP. Эти результаты не удивительны, учитывая современные представления о молекулярных механизмах генотоксичности (см. «Генетическая токсикология») и роли электрофильности в связывании ДНК. Напротив, SAR имеет тенденцию занижать прогноз системной и субхронической токсичности у млекопитающих и завышать прогноз острой токсичности для водных организмов.

Таблица 1. Сравнение SAR и данных испытаний: анализ ОЭСР/НТП

Источник: Данные ОЭСР, личное сообщение К. Ауэра, Агентство по охране окружающей среды США. В этом анализе использовались только те конечные точки, для которых были доступны сопоставимые прогнозы SAR и фактические данные испытаний. Данные NTP взяты из Ashby and Tennant 1991.

¹ Обеспокоенность вызвала неспособность SAR предсказать острую токсичность 12% протестированных химических веществ.

² Данные ОЭСР, основанные на соответствии теста Эймса SAR.

³ Данные NTP, основанные на анализах генетоксичности, по сравнению с прогнозами SAR для нескольких классов «химических веществ, вызывающих структурную тревогу».

⁴ Согласованность зависит от класса; наибольшая согласованность была с ароматическими амино/нитросоединениями; самый низкий с «разными» структурами.

Для других токсичных конечных точек, как отмечалось выше, SAR имеет менее доказуемую полезность. Прогнозы токсичности для млекопитающих осложняются отсутствием SAR для токсикокинетики сложных молекул. Тем не менее, были предприняты некоторые попытки предложить принципы SAR для сложных конечных точек токсичности млекопитающих (например, см. Bernstein (1984) для SAR-анализа потенциальных токсикантов мужской репродуктивной системы). В большинстве случаев база данных слишком мала, чтобы можно было провести тщательную проверку прогнозов на основе структуры.

На этом этапе можно сделать вывод, что SAR может быть полезен главным образом для определения приоритетности инвестиций в ресурсы для тестирования токсичности или для раннего выявления опасений относительно потенциальной опасности. Только в случае мутагенности вполне вероятно, что анализ SAR сам по себе может быть надежно использован для принятия других решений. Маловероятно, что SAR может предоставить тип количественной информации, необходимой для целей оценки риска, как описано в других разделах этой главы. Энциклопедия.

Назад