Оценка генетической токсичности представляет собой оценку агентов по их способности вызывать любой из трех основных типов изменений (мутаций) в генетическом материале (ДНК): генные, хромосомные и геномные. В таких организмах, как человек, гены состоят из ДНК, которая состоит из отдельных единиц, называемых нуклеотидными основаниями. Гены организованы в дискретные физические структуры, называемые хромосомами. Генотоксичность может привести к значительным и необратимым последствиям для здоровья человека. Генотоксическое повреждение является критическим этапом в индукции рака, а также может быть вовлечено в индукцию врожденных дефектов и гибель плода. Три класса мутаций, упомянутых выше, могут возникать в любом из двух типов тканей, которыми обладают такие организмы, как люди: сперматозоиды или яйцеклетки (зародышевые клетки) и оставшаяся ткань (соматические клетки).
Анализы, которые измеряют мутацию гена, - это те, которые обнаруживают замену, добавление или делецию нуклеотидов в гене. Анализы, которые измеряют хромосомную мутацию, — это те, которые обнаруживают разрывы или хромосомные перестройки, затрагивающие одну или несколько хромосом. Анализы, которые измеряют геномную мутацию, - это те, которые обнаруживают изменения в числе хромосом, состояние, называемое анеуплоидией. Оценка генетической токсичности значительно изменилась с момента разработки Германом Мюллером в 1927 году первого теста для обнаружения генотоксических (мутагенных) агентов. С тех пор было разработано более 200 тестов для измерения мутаций в ДНК; однако сегодня для оценки генетической токсичности обычно используется менее десяти тестов. В этой статье рассматриваются эти анализы, описывается, что они измеряют, и исследуется роль этих анализов в оценке токсичности.
Выявление опасностей рака до разработки Область генетической токсикологии
Генетическая токсикология стала неотъемлемой частью общего процесса оценки риска и в последнее время приобрела статус надежного средства прогнозирования канцерогенной активности. Однако до развития генетической токсикологии (до 1970 г.) другие методы использовались и до сих пор используются для выявления потенциальной опасности рака для человека. Существует шесть основных категорий методов, используемых в настоящее время для выявления рисков рака у человека: эпидемиологические исследования, долгосрочные биоанализы in vivo, среднесрочные биоанализы in vivo, краткосрочные биоанализы in vivo и in vitro, искусственный интеллект (структура-активность), и вывод на основе механизмов.
В таблице 1 приведены преимущества и недостатки этих методов.
Таблица 1. Преимущества и недостатки современных методов определения риска развития рака у человека
| Преимущества | Недостатки бонуса без депозита | |
| Эпидемиологические исследования | (1) люди являются конечными индикаторами болезни; (2) оценить чувствительные или восприимчивые группы населения; (3) когорты профессионального воздействия; (4) оповещения об охране окружающей среды |
(1) обычно ретроспективные (свидетельства о смерти, предвзятость припоминания и т. д.); (2) нечувствительный, дорогостоящий, длительный; (3) надежные данные о воздействии иногда недоступны или их трудно получить; (4) комбинированное, многократное и комплексное воздействие; отсутствие соответствующих контрольных когорт; (5) эксперименты на людях не проводились; (6) обнаружение рака, а не профилактика |
| Долгосрочные биоанализы in vivo | (1) перспективные и ретроспективные (валидационные) оценки; (2) отличная корреляция с идентифицированными человеческими канцерогенами; (3) известные уровни воздействия и условия; (4) идентифицирует эффекты химической токсичности и канцерогенности; (5) результаты получены относительно быстро; (6) качественные сравнения химических классов; (7) интегративные и интерактивные биологические системы, тесно связанные с человеком | (1) редко воспроизводимые, ресурсоемкие; (3) ограниченное количество помещений, подходящих для таких экспериментов; (4) дебаты об экстраполяции видов; (5) используемые уровни воздействия часто намного превышают уровни, с которыми сталкиваются люди; (6) воздействие одного химического вещества не имитирует воздействие на человека, которое, как правило, связано с несколькими химическими веществами одновременно. |
| Среднесрочные и краткосрочные биоанализы in vivo и in vitro | (1) быстрее и дешевле, чем другие анализы; (2) большие образцы, которые легко воспроизводятся; (3) измеряются биологически значимые конечные точки (мутации и т. д.); (4) может использоваться в качестве скрининга для выбора химических веществ для долгосрочных биотестов |
(1) in vitro не полностью предсказывает in vivo; (2) обычно специфический для организма или органа; (3) потенции, не сравнимые с целыми животными или людьми |
| Ассоциации химической структуры и биологической активности | (1) относительно простой, быстрый и недорогой; (2) надежными для определенных химических классов (например, нитрозаминов и бензидиновых красителей); (3) разработан на основе биологических данных, но не зависит от дополнительных биологических экспериментов | (1) не «биологический»; (2) множество исключений из сформулированных правил; (3) ретроспективные и редко (но становящиеся) перспективными |
| Выводы на основе механизма | (1) достаточно точны для определенных классов химических веществ; (2) позволяет уточнять гипотезы; (3) может ориентировать оценку риска на чувствительные группы населения | (1) механизмы химического канцерогенеза неопределенные, множественные и, вероятно, специфичные для химических веществ или классов; (2) может не выделять исключения из общих механизмов |
Обоснование и концептуальная основа генетических токсикологических анализов
Хотя точные типы и количество анализов, используемых для оценки генетической токсичности, постоянно развиваются и варьируются от страны к стране, наиболее распространенные из них включают анализы (1) генных мутаций в бактериях и/или культивируемых клетках млекопитающих и (2) хромосомных мутаций в клетках млекопитающих. культивированные клетки млекопитающих и/или костный мозг живых мышей. Некоторые анализы из этой второй категории также могут обнаруживать анеуплоидию. Хотя эти анализы не выявляют мутации в зародышевых клетках, они используются главным образом из-за дополнительных затрат и сложности проведения анализов зародышевых клеток. Тем не менее, анализ зародышевых клеток на мышах используется, когда требуется информация об эффектах зародышевых клеток.
Систематические исследования в течение 25-летнего периода (1970-1995 гг.), особенно в рамках Национальной токсикологической программы США в Северной Каролине, привели к использованию дискретного ряда анализов для выявления мутагенной активности агентов. Обоснование оценки полезности анализов основывалось на их способности обнаруживать агенты, вызывающие рак у грызунов и подозреваемые в том, что они вызывают рак у людей (т.е. канцерогены). Это связано с тем, что исследования, проведенные в течение последних нескольких десятилетий, показали, что раковые клетки содержат мутации в определенных генах и что многие канцерогены также являются мутагенами. Таким образом, раковые клетки рассматриваются как содержащие мутации соматических клеток, а канцерогенез рассматривается как тип мутагенеза соматических клеток.
Анализы генетической токсичности, наиболее часто используемые в настоящее время, были выбраны не только из-за их большой базы данных, относительно низкой стоимости и простоты выполнения, но и потому, что было показано, что они обнаруживают многие канцерогены грызунов и, предположительно, человеческие канцерогены. Следовательно, анализы генетической токсичности используются для прогнозирования потенциальной канцерогенности агентов.
Важным концептуальным и практическим достижением в области генетической токсикологии стало признание того факта, что многие канцерогены модифицируются ферментами в организме, создавая измененные формы (метаболиты), которые часто являются конечной канцерогенной и мутагенной формой исходного химического вещества. Чтобы воспроизвести этот метаболизм в чашке Петри, Генрих Маллинг показал, что включение препарата из печени грызунов содержит многие ферменты, необходимые для осуществления этого метаболического преобразования или активации. Таким образом, во многих анализах генетической токсичности, проводимых в чашках или пробирках (in vitro), используется добавление аналогичных ферментных препаратов. Простые препараты называются S9 mix, а очищенные препараты называются микросомами. Некоторые клетки бактерий и млекопитающих теперь были генетически модифицированы, чтобы содержать некоторые гены грызунов или человека, которые производят эти ферменты, что снижает потребность в добавлении смеси S9 или микросом.
Генетические токсикологические анализы и методы
Основными бактериальными системами, используемыми для скрининга генетической токсичности, являются анализ мутагенности Salmonella (Ames) и, в гораздо меньшей степени, штамм WP2 Кишечная палочка. Исследования середины 1980-х показали, что использование только двух штаммов системы сальмонелл (ТА98 и ТА100) было достаточным для обнаружения примерно 90% известных мутагенов сальмонелл. Таким образом, эти два штамма используются для большинства целей скрининга; однако для более обширного тестирования доступны различные другие штаммы.
Эти анализы выполняются различными способами, но двумя общими процедурами являются анализы с включением планшета и анализы с жидкой суспензией. В анализе включения в чашку клетки, тестируемое химическое вещество и (при желании) S9 добавляют вместе в жидкий агар и выливают на поверхность чашки Петри с агаром. Верхний агар затвердевает в течение нескольких минут, и чашки инкубируют в течение двух-трех дней, после чего мутантные клетки вырастают, образуя визуально обнаруживаемые скопления клеток, называемые колониями, которые затем подсчитывают. Агаровая среда содержит селективные агенты или состоит из таких ингредиентов, что только новые мутировавшие клетки будут расти. Анализ с инкубацией в жидкости аналогичен, за исключением того, что клетки, тестируемый агент и S9 инкубируют вместе в жидкости, не содержащей жидкого агара, а затем клетки промывают от тестируемого агента и S9 и высевают на агар.
Мутации в культивируемых клетках млекопитающих обнаруживаются преимущественно в одном из двух генов: хпрт и tk. Подобно бактериальным анализам, клеточные линии млекопитающих (разработанные из клеток грызунов или человека) подвергают воздействию тестируемого агента в пластиковых культуральных чашках или пробирках, а затем высевают в культуральные чашки, содержащие среду с селективным агентом, который позволяет расти только мутантным клеткам. . Анализы, используемые для этой цели, включают CHO/HPRT, TK6 и мышиную лимфому L5178Y/TK.+/- пробы. Также используются другие клеточные линии, содержащие различные мутации репарации ДНК, а также содержащие некоторые человеческие гены, участвующие в метаболизме. Эти системы позволяют восстанавливать мутации внутри гена (генная мутация), а также мутации, затрагивающие участки хромосомы, фланкирующие ген (хромосомная мутация). Однако этот последний тип мутаций восстанавливается в гораздо большей степени с помощью tk генные системы, чем хпрт генные системы из-за расположения tk ген.
Подобно анализу бактериальной мутагенности в жидкостной инкубации, анализы мутагенности клеток млекопитающих обычно включают экспозицию клеток в культуральных чашках или пробирках в присутствии тестируемого агента и S9 в течение нескольких часов. Затем клетки промывают, культивируют еще несколько дней, чтобы продукты нормальных (дикого типа) генов расщепились, а продукты новых мутантных генов экспрессировались и накапливались, а затем их высевают в среду, содержащую селективный агент, который позволяет растут только мутантные клетки. Как и при бактериальном анализе, мутантные клетки вырастают в визуально обнаруживаемые колонии, которые затем подсчитывают.
Хромосомная мутация идентифицируется в первую очередь с помощью цитогенетических анализов, которые включают воздействие на грызунов и/или клетки грызунов или человека в культуральных чашках тестируемым химическим веществом, позволяя произойти одному или нескольким клеточным делениям, окрашивая хромосомы, а затем визуально исследуя хромосомы под микроскопом. для обнаружения изменений в структуре или числе хромосом. Хотя можно исследовать множество конечных точек, две из них в настоящее время признаны регулирующими органами наиболее значимыми: хромосомные аберрации и подкатегория, называемая микроядрами.
Для оценки клеток на наличие хромосомных аберраций требуется значительная подготовка и опыт, что делает эту процедуру дорогостоящей с точки зрения времени и денег. Напротив, микроядра требуют небольшого обучения, и их обнаружение может быть автоматизировано. Микроядра выглядят как маленькие точки внутри клетки, отличные от ядра, содержащего хромосомы. Микроядра возникают либо в результате поломки хромосом, либо в результате анеуплоидии. Из-за простоты подсчета микроядер по сравнению с хромосомными аберрациями, а также из-за того, что недавние исследования показали, что агенты, вызывающие хромосомные аберрации в костном мозге живых мышей, обычно индуцируют микроядра в этой ткани, микроядра в настоящее время обычно измеряются как показатель способности агент, вызывающий хромосомную мутацию.
Хотя анализы на зародышевые клетки используются гораздо реже, чем другие описанные выше анализы, они необходимы для определения того, представляет ли агент риск для зародышевых клеток, мутации в которых могут привести к последствиям для здоровья в последующих поколениях. Наиболее часто используемые анализы зародышевых клеток проводятся на мышах и включают системы, которые обнаруживают (1) наследуемые транслокации (обмены) между хромосомами (анализ наследуемых транслокаций), (2) генные или хромосомные мутации, затрагивающие определенные гены (видимые или биохимические специфические локусы). анализы) и (3) мутации, влияющие на жизнеспособность (доминантный летальный анализ). Как и в случае анализа соматических клеток, рабочее допущение в отношении анализа зародышевых клеток состоит в том, что агенты, положительные в этих анализах, считаются потенциальными мутагенами зародышевых клеток человека.
Текущее состояние и перспективы на будущее
Недавние исследования показали, что для обнаружения примерно 90% набора из 41 канцерогена для грызунов (т. е. предполагаемых канцерогенов человека и мутагенов соматических клеток) было необходимо всего три элемента информации. К ним относятся (1) знание химической структуры агента, особенно если он содержит электрофильные фрагменты (см. раздел о взаимосвязях структура-активность); (2) данные о мутагенности Salmonella; и (3) данные 90-дневного анализа хронической токсичности на грызунах (мышах и крысах). Действительно, практически все канцерогены человека, объявленные IARC, обнаруживаются как мутагены с использованием только анализа на сальмонеллу и микроядерного анализа костного мозга мыши. Использование этих анализов мутагенности для обнаружения потенциальных канцерогенов человека подтверждается тем фактом, что большинство канцерогенов человека являются канцерогенными как для крыс, так и для мышей (межвидовые канцерогены) и что большинство межвидовых канцерогенов являются мутагенными для сальмонелл и/или индуцируют микроядра. в костном мозге мыши.
Благодаря достижениям в технологии ДНК, проекту генома человека и лучшему пониманию роли мутаций в развитии рака разрабатываются новые анализы генотоксичности, которые, вероятно, будут включены в стандартные процедуры скрининга. Среди них использование трансгенных клеток и грызунов. Трансгенные системы — это системы, в которых ген другого вида был введен в клетку или организм. Например, в настоящее время в экспериментальных целях используются трансгенные мыши, которые позволяют обнаруживать мутацию в любом органе или ткани животного на основе введения бактериального гена в мышь. В настоящее время доступны бактериальные клетки, такие как Salmonella, и клетки млекопитающих (включая линии клеток человека), которые содержат гены, участвующие в метаболизме канцерогенных/мутагенных агентов, такие как гены P450. Молекулярный анализ фактических мутаций, индуцированных в трансгене у трансгенных грызунов или в нативных генах, таких как хпрт, или гены-мишени в пределах сальмонеллы теперь могут быть выполнены, чтобы можно было определить точную природу мутаций, вызванных химическими веществами, что дает представление о механизме действия химического вещества и позволяет сравнивать с мутациями у людей, предположительно подвергшихся воздействию агента. .
Молекулярные достижения в цитогенетике теперь позволяют более детально оценивать хромосомные мутации. К ним относится использование зондов (небольших фрагментов ДНК), которые прикрепляются (гибридизуются) к определенным генам. Затем перестройки генов на хромосоме можно выявить по измененному расположению зондов, которые флуоресцируют и легко визуализируются в виде цветных секторов на хромосомах. Гель-электрофорез отдельных клеток для выявления разрывов ДНК (обычно называемый «кометным» анализом) позволяет обнаруживать разрывы ДНК в отдельных клетках и может стать чрезвычайно полезным инструментом в сочетании с цитогенетическими методами для обнаружения хромосомных повреждений.
После многих лет использования и создания большой и систематически разрабатываемой базы данных оценка генетической токсичности теперь может быть выполнена с помощью всего нескольких анализов при относительно небольших затратах за короткий период времени (несколько недель). Полученные данные можно использовать для прогнозирования способности агента быть грызуном и, предположительно, канцерогеном/мутагеном соматических клеток человека. Такая способность позволяет ограничивать поступление в окружающую среду мутагенных и канцерогенных агентов и разрабатывать альтернативные, немутагенные агенты. Будущие исследования должны привести к еще более совершенным методам с большей предсказуемостью, чем текущие анализы.