Процена генетичке токсичности је процена агенса за њихову способност да изазову било коју од три општа типа промена (мутација) у генетском материјалу (ДНК): генске, хромозомске и геномске. У организмима као што су људи, гени се састоје од ДНК, која се састоји од појединачних јединица које се зову нуклеотидне базе. Гени су распоређени у дискретне физичке структуре које се називају хромозоми. Генотоксичност може довести до значајних и неповратних ефеката на људско здравље. Генотоксично оштећење је критичан корак у индукцији рака и такође може бити укључено у индукцију урођених мана и феталне смрти. Три класе мутација које су горе поменуте могу се јавити унутар било којег од два типа ткива које поседују организми као што су људи: сперматозоида или јајашца (герминативне ћелије) и преосталог ткива (соматске ћелије).
Тестови који мере мутацију гена су они који откривају супституцију, додавање или брисање нуклеотида унутар гена. Тестови који мере хромозомску мутацију су они који откривају ломове или хромозомске преуређење које укључује један или више хромозома. Тестови који мере геномску мутацију су они који откривају промене у броју хромозома, стање које се зове анеуплоидија. Процена генетске токсичности се значајно променила од када је Херман Мулер 1927. године развио први тест за откривање генотоксичних (мутагених) агенаса. Од тада је развијено више од 200 тестова који мере мутације у ДНК; међутим, данас се обично користи мање од десет тестова за процену генетске токсичности. Овај чланак даје преглед ових тестова, описује шта они мере и истражује улогу ових тестова у процени токсичности.
Идентификација опасности од рака Пре развоја Поље генетске токсикологије
Генетска токсикологија је постала саставни део целокупног процеса процене ризика и стекла је у последње време као поуздани предиктор канцерогене активности. Међутим, пре развоја генетске токсикологије (пре 1970), друге методе су се користиле и још увек се користе за идентификацију потенцијалних опасности од рака за људе. Постоји шест главних категорија метода које се тренутно користе за идентификацију ризика од рака код људи: епидемиолошке студије, дугорочни ин виво биолошки тестови, средњорочни ин виво биолошки тестови, краткорочни ин виво и ин витро биолошки тестови, вештачка интелигенција (структура-активност), и закључивање засновано на механизму.
Табела 1 даје предности и недостатке ових метода.
Табела 1. Предности и недостаци актуелних метода за идентификацију ризика од рака код људи
| Предности | Мане | |
| Епидемиолошке студије | (1) људи су крајњи показатељи болести; (2) процени осетљиве или осетљиве популације; (3) кохорте професионалне изложености; (4) упозорења за чување животне средине |
(1) генерално ретроспективно (извод из матичне књиге умрлих, пристрасност опозива, итд.); (2) неосетљив, скуп, дуготрајан; (3) поуздани подаци о изложености понекад недоступни или их је тешко добити; (4) комбиноване, вишеструке и сложене изложености; недостатак одговарајућих контролних кохорти; (5) експерименти на људима нису урађени; (6) откривање рака, а не превенција |
| Дугорочни ин виво биолошки тестови | (1) проспективне и ретроспективне (валидационе) евалуације; (2) одлична корелација са идентификованим људским канцерогенима; (3) познати нивои изложености и услови; (4) идентификује хемијску токсичност и ефекте канцерогености; (5) резултати добијени релативно брзо; (6) квалитативна поређења између хемијских класа; (7) интегративни и интерактивни биолошки системи који су блиско повезани са људима | (1) ретко реплициран, интензиван ресурсима; (3) ограничене просторије погодне за такве експерименте; (4) расправа о екстраполацији врста; (5) коришћене експозиције су често на нивоима који су далеко већи од оних које доживљавају људи; (6) излагање једном хемикалијама не опонаша излагање људи, које се углавном односи на више хемикалија истовремено |
| Средњо- и краткорочни ин виво и ин витро биолошки тестови | (1) бржи и јефтинији од других тестова; (2) велики узорци који се лако реплицирају; (3) мере се биолошки значајне крајње тачке (мутација, итд.); (4) могу се користити као скрининг тестови за одабир хемикалија за дуготрајне биотестове |
(1) ин витро не предвиђа у потпуности ин виво; (2) обично специфично за организам или орган; (3) потенције које се не могу поредити са целим животињама или људима |
| Хемијска структура–биолошка активност | (1) релативно лако, брзо и јефтино; (2) поуздан за одређене хемијске класе (нпр. нитрозамини и бензидинске боје); (3) развијен на основу биолошких података, али не зависи од додатних биолошких експеримената | (1) не „биолошки”; (2) многи изузеци од формулисаних правила; (3) ретроспективан и ретко (али постаје) проспективан |
| Закључци засновани на механизму | (1) разумно тачне за одређене класе хемикалија; (2) дозвољава прецизирање хипотеза; (3) може да оријентише процене ризика на осетљиве популације | (1) механизми хемијске карциногенезе недефинисани, вишеструки и вероватно специфични за хемикалије или класу; (2) може пропустити да истакне изузетке од општих механизама |
Образложење и концептуална основа за генетске токсиколошке анализе
Иако се тачни типови и број тестова који се користе за процену генетске токсичности стално развијају и варирају од земље до земље, најчешћи су тестови за (1) генске мутације у бактеријама и/или култивисаним ћелијама сисара и (2) хромозомске мутације у култивисане ћелије сисара и/или коштану срж унутар живих мишева. Неки од тестова у оквиру ове друге категорије такође могу открити анеуплоидију. Иако ови тестови не откривају мутације у заметним ћелијама, они се првенствено користе због додатних трошкова и сложености извођења тестова заметних ћелија. Без обзира на то, тестови заметних ћелија код мишева се користе када су пожељне информације о ефектима заметних ћелија.
Систематске студије током периода од 25 година (1970-1995), посебно у америчком Националном токсиколошком програму у Северној Каролини, резултирале су употребом дискретног броја тестова за откривање мутагене активности агенаса. Образложење за процену корисности тестова заснивало се на њиховој способности да открију агенсе који изазивају рак код глодара и за које се сумња да изазивају рак код људи (тј. канцерогене). То је зато што су студије током последњих неколико деценија показале да ћелије рака садрже мутације у одређеним генима и да су многи карциногени такође мутагени. Према томе, ћелије рака се посматрају као оне које садрже мутације соматских ћелија, а карциногенеза се посматра као врста мутагенезе соматских ћелија.
Тестови генетске токсичности који се данас најчешће користе одабрани су не само због њихове велике базе података, релативно ниске цене и лакоће извођења, већ и због тога што се показало да откривају многе карциногене за глодаре и, претпоставља се, за људе. Сходно томе, тестови генетске токсичности се користе за предвиђање потенцијалне канцерогености агенаса.
Важан концептуални и практични развој у области генетске токсикологије било је признање да су многи карциногени модификовани ензимима унутар тела, стварајући измењене облике (метаболите) који су често били крајњи канцероген и мутагени облик матичне хемикалије. Да би поновио овај метаболизам у петријевој посуди, Хајнрих Малинг је показао да укључивање препарата из јетре глодара садржи многе ензиме неопходне за обављање ове метаболичке конверзије или активације. Стога, многи тестови генетске токсичности изведени у посудама или епруветама (ин витро) користе додавање сличних ензимских препарата. Једноставни препарати се називају С9 микс, а пречишћени микрозоми. Неке ћелије бактерија и сисара су сада генетски модификоване да садрже неке од гена глодара или људи који производе ове ензиме, смањујући потребу за додавањем С9 мешавине или микрозома.
Генетски токсиколошки тестови и технике
Примарни бактеријски системи који се користе за скрининг генетске токсичности су тест мутагености салмонеле (Амес) и, у много мањој мери, сој ВП2 од Есцхерицхиа цоли. Студије средином 1980-их су показале да је употреба само два соја Салмонелла система (ТА98 и ТА100) била довољна за откривање приближно 90% познатих мутагена салмонеле. Дакле, ова два соја се користе за већину скрининг сврха; међутим, разни други сојеви су доступни за опсежније тестирање.
Ови тестови се изводе на различите начине, али две опште процедуре су тестови уградње плоче и тестови суспензије течности. У тесту инкорпорације плоче, ћелије, испитивана хемикалија и (по жељи) С9 се додају заједно у течни агар и сипају на површину агар петријеве плоче. Горњи агар се стврдне у року од неколико минута, а плоче се инкубирају два до три дана, након чега су мутантне ћелије нарасле да формирају визуелно уочљиве групе ћелија које се називају колоније, које се затим броје. Агар медијум садржи селективне агенсе или је састављен од састојака тако да ће расти само новомутиране ћелије. Тест инкубације у течности је сличан, осим што се ћелије, тест агенс и С9 инкубирају заједно у течности која не садржи течни агар, а затим се ћелије исперу од тест агенса и С9 и засеју на агар.
Мутације у култивисаним ћелијама сисара се откривају првенствено у једном од два гена: хпрт tk. Слично као код бактеријских тестова, ћелијске линије сисара (развијене од ћелија глодара или људи) се излажу испитиваном агенсу у пластичним посудама за културу или епруветама, а затим се засеју у посуде за културу које садрже медијум са селективним агенсом који дозвољава само мутантним ћелијама да расту . Тестови који се користе у ову сврху укључују ЦХО/ХПРТ, ТК6 и мишји лимфом Л5178И/ТК+ / - есеји. Користе се и друге ћелијске линије које садрже различите мутације за поправку ДНК, као и неке људске гене укључене у метаболизам. Ови системи дозвољавају опоравак мутација унутар гена (мутација гена), као и мутација које укључују регионе хромозома који прате ген (хромозомска мутација). Међутим, овај други тип мутације се обнавља у много већој мери tk генских система него по хпрт генских система због локације на tk ген.
Слично тесту инкубације у течности за бактеријску мутагеност, тестови мутагености ћелија сисара углавном укључују излагање ћелија у посудама за културу или епруветама у присуству тест агенса и С9 током неколико сати. Ћелије се затим исперу, култивишу још неколико дана да би се омогућило да се нормални (дивљи тип) генских производа разгради и да се нови мутантни генски производи експресују и акумулирају, а затим се засеју у медијум који садржи селективни агенс који дозвољава да расту само мутантне ћелије. Као и код бактеријских тестова, мутантне ћелије расту у визуелно уочљиве колоније које се затим броје.
Хромозомска мутација се идентификује првенствено цитогенетским тестовима, који укључују излагање глодара и/или ћелија глодара или људи у посудама за културу испитиваној хемикалији, омогућавајући једну или више деоба ћелија, бојење хромозома, а затим визуелно испитивање хромозома под микроскопом за откривање промена у структури или броју хромозома. Иако се могу испитати различите крајње тачке, две које регулаторне агенције тренутно прихватају као најзначајније су хромозомске аберације и поткатегорија која се зове микронуклеуси.
Потребна је значајна обука и стручност да би се ћелије процениле на присуство хромозомских аберација, што ову процедуру чини скупом у смислу времена и новца. Насупрот томе, микронуклеуси захтевају мало обуке, а њихово откривање може бити аутоматизовано. Микронуклеуси се појављују као мале тачке унутар ћелије које се разликују од језгра, које садржи хромозоме. Микронуклеуси су резултат или ломљења хромозома или анеуплоидије. Због лакоће оцењивања микронуклеуса у поређењу са хромозомским аберацијама и због тога што недавне студије показују да агенси који изазивају хромозомске аберације у коштаној сржи живих мишева генерално индукују микронуклеусе у овом ткиву, микронуклеуси се данас обично мере као показатељ способности агенс који изазива хромозомске мутације.
Иако се тестови заметних ћелија користе много ређе него други горе описани тестови, они су неопходни у одређивању да ли агенс представља ризик за заметне ћелије, мутације у којима могу довести до здравствених ефеката у наредним генерацијама. Најчешће коришћени тестови заметних ћелија су код мишева и укључују системе који откривају (1) наследне транслокације (размену) међу хромозомима (тест наследне транслокације), (2) генске или хромозомске мутације које укључују специфичне гене (видљиви или биохемијски специфични локус тестови) и (3) мутације које утичу на одрживост (доминантни тест смрти). Као и код тестова соматских ћелија, радна претпоставка код тестова заметних ћелија је да се претпоставља да су агенси позитивни у овим тестовима потенцијални мутагени људских заметних ћелија.
Тренутни статус и будући изгледи
Недавне студије су показале да су само три информације биле неопходне да би се открило приближно 90% скупа од 41 канцерогена за глодаре (тј. претпостављених карциногена за људе и мутагена соматских ћелија). Ово укључује (1) познавање хемијске структуре агенса, посебно ако садржи електрофилне делове (видети одељак о односима структуре и активности); (2) подаци о мутагености салмонеле; и (3) податке из 90-дневног теста хроничне токсичности код глодара (мишева и пацова). Заиста, сви хумани карциногени које је прогласио ИАРЦ могу се открити као мутагени користећи само тест салмонеле и микронуклеусни тест мишје коштане сржи. Употреба ових тестова мутагености за откривање потенцијалних канцерогена за људе је додатно подржана налазом да је већина канцерогена за људе канцерогена и код пацова и код мишева (канцерогени за транс-врсте) и да је већина канцерогена за транс-врсте мутагена у салмонели и/или индукују микронуклеусе. у коштаној сржи миша.
Са напретком у ДНК технологији, пројекту људског генома и побољшаним разумевањем улоге мутације у раку, развијају се нови тестови генотоксичности који ће вероватно бити укључени у стандардне процедуре скрининга. Међу њима је употреба трансгених ћелија и глодара. Трансгени системи су они у којима је ген друге врсте унет у ћелију или организам. На пример, трансгени мишеви су сада у експерименталној употреби која омогућава откривање мутације у било ком органу или ткиву животиње, на основу увођења бактеријског гена у миша. Сада су доступне бактеријске ћелије, као што је салмонела, и ћелије сисара (укључујући људске ћелијске линије) које садрже гене укључене у метаболизам канцерогених/мутагених агенаса, као што су гени П450. Молекуларна анализа стварних мутација индукованих у транс-гену код трансгених глодара, или унутар нативних гена као нпр. хпрт, или циљни гени унутар салмонеле сада се могу извести, тако да се може утврдити тачна природа мутација изазваних хемикалијама, пружајући увид у механизам деловања хемикалије и омогућавајући поређења са мутацијама код људи који су вероватно били изложени агенсу .
Молекуларни напредак у цитогенетици сада омогућава детаљнију процену хромозомских мутација. То укључује употребу сонди (малих делова ДНК) које се везују (хибридизују) за специфичне гене. Преуређивање гена на хромозому се тада може открити измењеном локацијом сонди, које су флуоресцентне и лако се визуализују као обојени сектори на хромозомима. Једноћелијски гел електрофорезни тест за ломљење ДНК (који се обично назива „кометски” тест) дозвољава откривање прекида ДНК унутар појединачних ћелија и може постати изузетно користан алат у комбинацији са цитогенетским техникама за откривање хромозомских оштећења.
После много година употребе и стварања велике и систематски развијене базе података, процена генетске токсичности сада се може урадити са само неколико тестова за релативно мале трошкове у кратком временском периоду (неколико недеља). Добијени подаци се могу користити за предвиђање способности неког агенса да буде глодар и, претпоставља се, хумани канцероген/мутаген соматских ћелија. Таква способност омогућава да се ограничи уношење мутагених и канцерогених агенаса у животну средину и да се развију алтернативни, немутагени агенси. Будуће студије би требало да доведу до још бољих метода са већом предиктивношћу од тренутних тестова.