Neurotoxicidade e toxicidade reprodutiva são áreas importantes para avaliação de risco, uma vez que os sistemas nervoso e reprodutivo são altamente sensíveis aos efeitos xenobióticos. Muitos agentes foram identificados como tóxicos para esses sistemas em humanos (Barlow e Sullivan 1982; OTA 1990). Muitos pesticidas são deliberadamente projetados para interromper a reprodução e a função neurológica em organismos-alvo, como insetos, por meio da interferência na bioquímica hormonal e na neurotransmissão.

É difícil identificar substâncias potencialmente tóxicas para esses sistemas por três razões inter-relacionadas: primeiro, eles estão entre os sistemas biológicos mais complexos em humanos, e os modelos animais de função reprodutiva e neurológica são geralmente considerados inadequados para representar eventos críticos como a cognição ou desenvolvimento embriofetal precoce; em segundo lugar, não há testes simples para identificar potenciais tóxicos reprodutivos ou neurológicos; e terceiro, esses sistemas contêm vários tipos de células e órgãos, de modo que nenhum conjunto único de mecanismos de toxicidade pode ser usado para inferir relações dose-resposta ou prever relações estrutura-atividade (SAR). Além disso, sabe-se que a sensibilidade dos sistemas nervoso e reprodutivo varia com a idade, e que exposições em períodos críticos podem ter efeitos muito mais graves do que em outros momentos.

Avaliação de risco de neurotoxicidade

A neurotoxicidade é um importante problema de saúde pública. Conforme mostrado na tabela 1, houve vários episódios de neurotoxicidade humana envolvendo milhares de trabalhadores e outras populações expostas por meio de liberações industriais, alimentos contaminados, água e outros vetores. Exposições ocupacionais a neurotoxinas como chumbo, mercúrio, inseticidas organofosforados e solventes clorados são comuns em todo o mundo (OTA 1990; Johnson 1978).

Tabela 1. Principais incidentes de neurotoxicidade selecionados

Fonte: OTA 1990.

Os produtos químicos podem afetar o sistema nervoso por meio de ações em qualquer um dos vários alvos celulares ou processos bioquímicos no sistema nervoso central ou periférico. Efeitos tóxicos em outros órgãos também podem afetar o sistema nervoso, como no exemplo da encefalopatia hepática. As manifestações de neurotoxicidade incluem efeitos na aprendizagem (incluindo memória, cognição e desempenho intelectual), processos somatossensoriais (incluindo sensação e propriocepção), função motora (incluindo equilíbrio, marcha e controle de movimentos finos), afeto (incluindo estado de personalidade e emocionalidade) e autonômica (controle nervoso da função endócrina e sistemas de órgãos internos). Os efeitos tóxicos de produtos químicos sobre o sistema nervoso geralmente variam em sensibilidade e expressão com a idade: durante o desenvolvimento, o sistema nervoso central pode ser especialmente suscetível a insultos tóxicos devido ao processo prolongado de diferenciação celular, migração e contato célula a célula que ocorre em humanos (OTA 1990). Além disso, o dano citotóxico ao sistema nervoso pode ser irreversível porque os neurônios não são substituídos após a embriogênese. Enquanto o sistema nervoso central (SNC) é um pouco protegido do contato com compostos absorvidos por meio de um sistema de células fortemente unidas (a barreira hematoencefálica, composta de células endoteliais capilares que revestem a vasculatura do cérebro), produtos químicos tóxicos podem obter acesso a o SNC por três mecanismos: solventes e compostos lipofílicos podem atravessar as membranas celulares; alguns compostos podem se ligar a proteínas transportadoras endógenas que servem para fornecer nutrientes e biomoléculas ao SNC; pequenas proteínas, se inaladas, podem ser diretamente captadas pelo nervo olfativo e transportadas para o cérebro.

Autoridades reguladoras dos EUA

A autoridade estatutária para regulamentar substâncias para neurotoxicidade é atribuída a quatro agências nos Estados Unidos: a Food and Drug Administration (FDA), a Environmental Protection Agency (EPA), a Occupational Safety and Health Administration (OSHA) e a Consumer Product Safety Commission (CPSC). Embora a OSHA geralmente regule as exposições ocupacionais a produtos químicos neurotóxicos (e outros), a EPA tem autoridade para regular as exposições ocupacionais e não ocupacionais a pesticidas sob a Lei Federal de Inseticidas, Fungicidas e Rodenticidas (FIFRA). A EPA também regulamenta novos produtos químicos antes da fabricação e comercialização, o que obriga a agência a considerar os riscos ocupacionais e não ocupacionais.

Identificação de perigo

Agentes que afetam adversamente a fisiologia, bioquímica ou integridade estrutural do sistema nervoso ou a função do sistema nervoso expressa comportamentalmente são definidos como riscos neurotóxicos (EPA 1993). A determinação da neurotoxicidade inerente é um processo difícil, devido à complexidade do sistema nervoso e às múltiplas expressões da neurotoxicidade. Alguns efeitos podem ser retardados no aparecimento, como a neurotoxicidade retardada de certos inseticidas organofosforados. Cuidado e julgamento são necessários para determinar o perigo neurotóxico, incluindo a consideração das condições de exposição, dose, duração e tempo.

A identificação de perigos é geralmente baseada em estudos toxicológicos de organismos intactos, nos quais as funções comportamentais, cognitivas, motoras e somatossensoriais são avaliadas com uma variedade de ferramentas investigativas, incluindo bioquímica, eletrofisiologia e morfologia (Tilson e Cabe 1978; Spencer e Schaumberg 1980). A importância da observação cuidadosa de todo o comportamento do organismo não pode ser subestimada. A identificação de perigos também requer a avaliação da toxicidade em diferentes estágios de desenvolvimento, incluindo o início da vida (intrauterino e neonatal precoce) e a senescência. Em humanos, a identificação de neurotoxicidade envolve avaliação clínica usando métodos de avaliação neurológica da função motora, fluência da fala, reflexos, função sensorial, eletrofisiologia, testes neuropsicológicos e, em alguns casos, técnicas avançadas de imagem cerebral e eletroencefalografia quantitativa. A OMS desenvolveu e validou uma bateria de testes centrais neurocomportamentais (NCTB), que contém testes de função motora, coordenação mão-olho, tempo de reação, memória imediata, atenção e humor. Esta bateria foi validada internacionalmente por um processo coordenado (Johnson 1978).

A identificação de perigos usando animais também depende de métodos observacionais cuidadosos. A US EPA desenvolveu uma bateria observacional funcional como um teste de primeiro nível projetado para detectar e quantificar os principais efeitos neurotóxicos evidentes (Moser 1990). Essa abordagem também está incorporada nos métodos de teste de toxicidade subcrônica e crônica da OCDE. Uma bateria típica inclui as seguintes medidas: postura; maneira de andar; mobilidade; excitação geral e reatividade; presença ou ausência de tremores, convulsões, lacrimejamento, piloereção, salivação, excesso de micção ou defecação, estereotipia, andar em círculos ou outros comportamentos bizarros. Os comportamentos provocados incluem resposta ao manuseio, beliscão da cauda ou cliques; equilíbrio, reflexo de endireitamento e força de preensão dos membros posteriores. Alguns testes representativos e agentes identificados com esses testes são mostrados na tabela 2.

Tabela 2. Exemplos de testes especializados para medir a neurotoxicidade

Fonte: EPA 1993.

Esses testes podem ser seguidos por avaliações mais complexas, geralmente reservadas para estudos mecanísticos, em vez de identificação de perigos. Os métodos in vitro para identificação de perigos de neurotoxicidade são limitados, pois não fornecem indicações de efeitos em funções complexas, como aprendizado, mas podem ser muito úteis na definição de locais-alvo de toxicidade e na melhoria da precisão dos estudos dose-resposta no local-alvo (ver WHO 1986 e EPA 1993 para discussões abrangentes de princípios e métodos para identificar potenciais neurotóxicos).

Avaliação dose-resposta

A relação entre toxicidade e dose pode ser baseada em dados humanos quando disponíveis ou em testes em animais, conforme descrito acima. Nos Estados Unidos, uma abordagem de incerteza ou fator de segurança é geralmente usada para neurotóxicos. Este processo envolve a determinação de um “nível de efeito adverso não observado” (NOAEL) ou “nível de efeito adverso observado mais baixo” (LOAEL) e, em seguida, dividindo esse número por fatores de incerteza ou segurança (geralmente múltiplos de 10) para permitir considerações como incompletude de dados, sensibilidade potencialmente maior de humanos e variabilidade da resposta humana devido à idade ou outros fatores do hospedeiro. O número resultante é denominado dose de referência (RfD) ou concentração de referência (RfC). O efeito que ocorre com a dose mais baixa nas espécies e gêneros animais mais sensíveis é geralmente usado para determinar o LOAEL ou NOAEL. A conversão da dose animal para a exposição humana é feita por métodos padrão de dosimetria entre espécies, levando em consideração as diferenças no tempo de vida e na duração da exposição.

O uso da abordagem do fator de incerteza assume que existe um limite ou dose abaixo da qual nenhum efeito adverso é induzido. Limites para neurotóxicos específicos podem ser difíceis de determinar experimentalmente; eles são baseados em suposições quanto ao mecanismo de ação que pode ou não ser válido para todos os neurotóxicos (Silbergeld 1990).

Avaliação da exposição

Nesta etapa, são avaliadas informações sobre fontes, vias, doses e tempos de exposição ao neurotóxico para populações humanas, subpopulações ou mesmo indivíduos. Essas informações podem ser derivadas do monitoramento de mídia ambiental ou amostragem humana, ou de estimativas baseadas em cenários padrão (como condições de trabalho e descrições de trabalho) ou modelos de destino e dispersão ambiental (consulte EPA 1992 para obter diretrizes gerais sobre métodos de avaliação de exposição). Em alguns casos limitados, marcadores biológicos podem ser usados ​​para validar inferências e estimativas de exposição; no entanto, existem relativamente poucos biomarcadores utilizáveis ​​de neurotóxicos.

caracterização de risco

A combinação de identificação do perigo, resposta à dose e avaliação da exposição é usada para desenvolver a caracterização do risco. Esse processo envolve suposições quanto à extrapolação de doses altas para baixas, extrapolação de animais para humanos e a adequação de suposições de limite e uso de fatores de incerteza.

Toxicologia reprodutiva—Métodos de avaliação de risco

Os riscos reprodutivos podem afetar vários pontos finais funcionais e alvos celulares em humanos, com consequências para a saúde do indivíduo afetado e das gerações futuras. Os riscos reprodutivos podem afetar o desenvolvimento do sistema reprodutivo em homens ou mulheres, comportamentos reprodutivos, função hormonal, hipotálamo e hipófise, gônadas e células germinativas, fertilidade, gravidez e a duração da função reprodutiva (OTA 1985). Além disso, substâncias químicas mutagênicas também podem afetar a função reprodutiva, danificando a integridade das células germinativas (Dixon 1985).

A natureza e a extensão dos efeitos adversos das exposições químicas sobre a função reprodutiva em populações humanas são amplamente desconhecidas. Relativamente poucas informações de vigilância estão disponíveis em parâmetros como fertilidade de homens ou mulheres, idade da menopausa em mulheres ou contagem de esperma em homens. No entanto, tanto homens quanto mulheres trabalham em indústrias onde podem ocorrer exposições a riscos reprodutivos (OTA 1985).

Esta seção não recapitula os elementos comuns à avaliação de risco de tóxicos neurotóxicos e reprodutivos, mas se concentra em questões específicas da avaliação de risco de tóxicos reprodutivos. Tal como acontece com os neurotóxicos, a autoridade para regulamentar produtos químicos para toxicidade reprodutiva é colocada por estatuto na EPA, OSHA, FDA e CPSC. Dessas agências, apenas a EPA tem um conjunto declarado de diretrizes para avaliação de risco de toxicidade reprodutiva. Além disso, o estado da Califórnia desenvolveu métodos para avaliação de risco de toxicidade reprodutiva em resposta a uma lei estadual, Proposição 65 (Pease et al. 1991).

Tóxicos reprodutivos, como os neurotóxicos, podem atuar afetando qualquer um de vários órgãos-alvo ou locais moleculares de ação. Sua avaliação tem complexidade adicional devido à necessidade de avaliar três organismos distintos separadamente e juntos – o macho, a fêmea e a prole (Mattison e Thomford 1989). Embora um ponto final importante da função reprodutiva seja a geração de uma criança saudável, a biologia reprodutiva também desempenha um papel na saúde dos organismos em desenvolvimento e maduros, independentemente de seu envolvimento na procriação. Por exemplo, a perda da função ovulatória por depleção natural ou remoção cirúrgica de oócitos tem efeitos substanciais sobre a saúde das mulheres, envolvendo alterações na pressão sanguínea, metabolismo lipídico e fisiologia óssea. Alterações na bioquímica hormonal podem afetar a suscetibilidade ao câncer.

Identificação de perigo

A identificação de um perigo reprodutivo pode ser feita com base em dados humanos ou animais. Em geral, os dados de humanos são relativamente escassos, devido à necessidade de vigilância cuidadosa para detectar alterações na função reprodutiva, como contagem ou qualidade de espermatozóides, frequência ovulatória e duração do ciclo ou idade na puberdade. A detecção de riscos reprodutivos por meio da coleta de informações sobre taxas de fertilidade ou dados sobre o resultado da gravidez pode ser confundida pela supressão intencional da fertilidade exercida por muitos casais por meio de medidas de planejamento familiar. O monitoramento cuidadoso de populações selecionadas indica que as taxas de falha reprodutiva (aborto espontâneo) podem ser muito altas, quando os biomarcadores de gravidez precoce são avaliados (Sweeney et al. 1988).

Protocolos de teste usando animais experimentais são amplamente usados ​​para identificar tóxicos reprodutivos. Na maioria desses projetos, conforme desenvolvidos nos Estados Unidos pela FDA e pela EPA e internacionalmente pelo programa de diretrizes de teste da OCDE, os efeitos de agentes suspeitos são detectados em termos de fertilidade após exposição masculina e/ou feminina; observação de comportamentos sexuais relacionados ao acasalamento; e exame histopatológico de gônadas e glândulas sexuais acessórias, como glândulas mamárias (EPA 1994). Freqüentemente, os estudos de toxicidade reprodutiva envolvem dosagens contínuas de animais por uma ou mais gerações, a fim de detectar efeitos no processo reprodutivo integrado, bem como estudar efeitos em órgãos específicos de reprodução. Estudos multigeracionais são recomendados porque permitem a detecção de efeitos que podem ser induzidos pela exposição durante o desenvolvimento do sistema reprodutivo in utero. Um protocolo de teste especial, a Avaliação Reprodutiva por Reprodução Contínua (RACB), foi desenvolvido nos Estados Unidos pelo Programa Nacional de Toxicologia. Este teste fornece dados sobre mudanças no espaçamento temporal das gestações (refletindo a função ovulatória), bem como o número e tamanho das ninhadas durante todo o período de teste. Quando estendido ao longo da vida da fêmea, pode fornecer informações sobre falhas reprodutivas precoces. As medidas de esperma podem ser adicionadas ao RACB para detectar alterações na função reprodutiva masculina. Um teste especial para detectar a perda pré ou pós-implantação é o teste letal dominante, projetado para detectar efeitos mutagênicos na espermatogênese masculina.

Testes in vitro também foram desenvolvidos como telas para toxicidade reprodutiva (e de desenvolvimento) (Heindel e Chapin 1993). Esses testes são geralmente usados ​​para complementar os resultados dos testes in vivo, fornecendo mais informações sobre o local-alvo e o mecanismo dos efeitos observados.

A Tabela 3 mostra os três tipos de endpoints na avaliação da toxicidade reprodutiva – mediada pelo casal, específica para mulheres e específica para homens. Os endpoints mediados por pares incluem aqueles detectáveis ​​em estudos multigeracionais e de organismo único. Eles geralmente incluem a avaliação da prole também. Deve-se notar que a medição da fertilidade em roedores é geralmente insensível, em comparação com tal medição em humanos, e que efeitos adversos na função reprodutiva podem ocorrer em doses mais baixas do que aquelas que afetam significativamente a fertilidade (EPA 1994). Os pontos finais específicos do sexo masculino podem incluir testes de letalidade dominante, bem como avaliação histopatológica de órgãos e esperma, medição de hormônios e marcadores de desenvolvimento sexual. A função do esperma também pode ser avaliada por métodos de fertilização in vitro para detectar as propriedades das células germinativas de penetração e capacitação; esses testes são valiosos porque são diretamente comparáveis ​​às avaliações in vitro realizadas em clínicas de fertilidade humana, mas não fornecem, por si só, informações sobre dose-resposta. Os endpoints específicos para mulheres incluem, além da histopatologia do órgão e das medições hormonais, a avaliação das sequelas da reprodução, incluindo a lactação e o crescimento da prole.

Tabela 3. Parâmetros em toxicologia reprodutiva

¹ Pontos finais que podem ser obtidos de forma relativamente não invasiva com humanos.

Fonte: EPA 1994.

Nos Estados Unidos, a identificação do perigo é concluída com uma avaliação qualitativa dos dados de toxicidade pelos quais os produtos químicos são julgados como tendo evidência suficiente ou insuficiente de perigo (EPA 1994). Evidências “suficientes” incluem dados epidemiológicos que fornecem evidências convincentes de uma relação causal (ou falta dela), com base em estudos de caso-controle ou coorte, ou séries de casos bem fundamentadas. Dados animais suficientes podem ser combinados com dados humanos limitados para apoiar a descoberta de um perigo reprodutivo: para serem suficientes, os estudos experimentais são geralmente necessários para utilizar as diretrizes de teste de duas gerações da EPA e devem incluir um mínimo de dados que demonstrem um efeito reprodutivo adverso em um estudo apropriado e bem conduzido em uma espécie de teste. Dados humanos limitados podem ou não estar disponíveis; não é necessário para efeitos de identificação de perigos. Para descartar um risco reprodutivo potencial, os dados do animal devem incluir uma gama adequada de parâmetros de mais de um estudo que não mostre nenhum efeito reprodutivo adverso em doses minimamente tóxicas para o animal (EPA 1994).

Avaliação dose-resposta

Assim como na avaliação de neurotóxicos, a demonstração de efeitos relacionados à dose é uma parte importante da avaliação de risco para tóxicos reprodutivos. Duas dificuldades particulares nas análises dose-resposta surgem devido à toxicocinética complicada durante a gravidez e à importância de distinguir a toxicidade reprodutiva específica da toxicidade geral para o organismo. Animais debilitados ou animais com toxicidade inespecífica substancial (como perda de peso) podem não ovular ou acasalar. A toxicidade materna pode afetar a viabilidade da gravidez ou apoiar a lactação. Esses efeitos, embora sejam evidências de toxicidade, não são específicos da reprodução (Kimmel et al. 1986). A avaliação da resposta à dose para um ponto final específico, como a fertilidade, deve ser feita no contexto de uma avaliação geral da reprodução e do desenvolvimento. As relações dose-resposta para diferentes efeitos podem diferir significativamente, mas interferem na detecção. Por exemplo, agentes que reduzem o tamanho da ninhada podem resultar em nenhum efeito sobre o peso da ninhada devido à redução da competição pela nutrição intrauterina.

Avaliação da exposição

Um componente importante da avaliação da exposição para a avaliação do risco reprodutivo está relacionado às informações sobre o momento e a duração das exposições. As medidas de exposição cumulativa podem ser insuficientemente precisas, dependendo do processo biológico afetado. Sabe-se que exposições em diferentes estágios de desenvolvimento em machos e fêmeas podem resultar em resultados diferentes tanto em humanos quanto em animais experimentais (Gray et al. 1988). A natureza temporal da espermatogênese e da ovulação também afeta o resultado. Os efeitos na espermatogênese podem ser reversíveis se as exposições cessarem; no entanto, a toxicidade do oócito não é reversível, uma vez que as fêmeas têm um conjunto fixo de células germinativas para a ovulação (Mattison e Thomford, 1989).

caracterização de risco

Tal como acontece com os neurotóxicos, a existência de um limite é geralmente assumida para tóxicos reprodutivos. No entanto, as ações de compostos mutagênicos em células germinativas podem ser consideradas uma exceção a essa suposição geral. Para outros parâmetros, um RfD ou RfC é calculado como com neurotóxicos pela determinação do NOAEL ou LOAEL e aplicação de fatores de incerteza apropriados. O efeito usado para determinar o NOAEL ou LOAEL é o ponto final reprodutivo adverso mais sensível das espécies de mamíferos mais apropriadas ou mais sensíveis (EPA 1994). Os fatores de incerteza incluem a consideração da variação interespécies e intraespécies, a capacidade de definir um verdadeiro NOAEL e a sensibilidade do ponto final detectado.

As caracterizações de risco também devem ser focadas em subpopulações específicas em risco, possivelmente especificando homens e mulheres, estado de gravidez e idade. Indivíduos especialmente sensíveis, como mulheres lactantes, mulheres com número reduzido de oócitos ou homens com contagem reduzida de esperma e adolescentes pré-púberes também podem ser considerados.

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