A toxicologia desempenha um papel importante no desenvolvimento de regulamentos e outras políticas de saúde ocupacional. A fim de prevenir lesões e doenças ocupacionais, as decisões são cada vez mais baseadas em informações obtidas antes ou na ausência dos tipos de exposições humanas que produziriam informações definitivas sobre o risco, como estudos epidemiológicos. Além disso, os estudos toxicológicos, conforme descritos neste capítulo, podem fornecer informações precisas sobre a dose e a resposta nas condições controladas da pesquisa laboratorial; esta informação é muitas vezes difícil de obter no ambiente não controlado de exposições ocupacionais. No entanto, essas informações devem ser cuidadosamente avaliadas para estimar a probabilidade de efeitos adversos em humanos, a natureza desses efeitos adversos e a relação quantitativa entre exposições e efeitos.

Uma atenção considerável tem sido dada em muitos países, desde a década de 1980, ao desenvolvimento de métodos objetivos para a utilização de informações toxicológicas na tomada de decisões regulatórias. Métodos formais, frequentemente referidos como avaliação de risco, têm sido propostas e utilizadas nesses países por entidades governamentais e não governamentais. A avaliação de risco foi definida de forma variada; fundamentalmente, é um processo avaliativo que incorpora informações toxicológicas, epidemiológicas e de exposição para identificar e estimar a probabilidade de efeitos adversos associados à exposição a substâncias ou condições perigosas. A avaliação de risco pode ser de natureza qualitativa, indicando a natureza de um efeito adverso e uma estimativa geral de probabilidade, ou pode ser quantitativa, com estimativas do número de pessoas afetadas em níveis específicos de exposição. Em muitos sistemas regulatórios, a avaliação de risco é realizada em quatro etapas: identificação de perigo, a descrição da natureza do efeito tóxico; avaliação dose-resposta, uma análise semiquantitativa ou quantitativa da relação entre exposição (ou dose) e gravidade ou probabilidade de efeito tóxico; avaliação de exposição, a avaliação de informações sobre a gama de exposições prováveis ​​de ocorrer para as populações em geral ou para subgrupos dentro das populações; caracterização de risco, a compilação de todas as informações acima em uma expressão da magnitude do risco que se espera que ocorra sob condições de exposição especificadas (ver NRC 1983 para uma declaração desses princípios).

Nesta seção, três abordagens para avaliação de risco são apresentadas como ilustrativas. É impossível fornecer um compêndio abrangente de métodos de avaliação de risco usados ​​em todo o mundo, e essas seleções não devem ser consideradas prescritivas. Deve-se notar que há tendências para a harmonização dos métodos de avaliação de risco, em parte em resposta às disposições dos recentes acordos do GATT. Estão em curso dois processos de harmonização internacional dos métodos de avaliação de risco, através do Programa Internacional de Segurança Química (IPCS) e da Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Económico (OCDE). Essas organizações também mantêm informações atualizadas sobre abordagens nacionais para avaliação de riscos.

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A análise de relações de atividade de estrutura (SAR) é a utilização de informações sobre a estrutura molecular de produtos químicos para prever características importantes relacionadas à persistência, distribuição, captação e absorção e toxicidade. SAR é um método alternativo de identificação de produtos químicos potencialmente perigosos, que promete ajudar indústrias e governos a priorizar substâncias para avaliação posterior ou para tomada de decisões em estágio inicial para novos produtos químicos. A toxicologia é um empreendimento cada vez mais caro e com uso intensivo de recursos. As crescentes preocupações sobre o potencial de produtos químicos causarem efeitos adversos em populações humanas expostas levaram as agências reguladoras e de saúde a expandir o alcance e a sensibilidade dos testes para detectar perigos toxicológicos. Ao mesmo tempo, os encargos reais e percebidos da regulamentação sobre a indústria provocaram preocupações quanto à praticidade dos métodos de teste de toxicidade e análise de dados. Atualmente, a determinação da carcinogenicidade química depende de testes de vida de pelo menos duas espécies, ambos os sexos, em várias doses, com análise histopatológica cuidadosa de múltiplos órgãos, bem como detecção de alterações pré-neoplásicas em células e órgãos-alvo. Nos Estados Unidos, estima-se que o bioensaio do câncer custe mais de US$ 3 milhões (dólares de 1995).

Mesmo com recursos financeiros ilimitados, o ônus de testar os cerca de 70,000 produtos químicos existentes hoje no mundo excederia os recursos disponíveis de toxicologistas treinados. Séculos seriam necessários para concluir até mesmo uma avaliação de primeiro nível desses produtos químicos (NRC 1984). Em muitos países, as preocupações éticas sobre o uso de animais em testes de toxicidade aumentaram, trazendo pressões adicionais sobre o uso de métodos padrão de teste de toxicidade. A SAR tem sido amplamente utilizada na indústria farmacêutica para identificar moléculas com potencial para uso benéfico no tratamento (Hansch e Zhang 1993). Na política ambiental e de saúde ocupacional, o SAR é usado para prever a dispersão de compostos no ambiente físico-químico e para rastrear novos produtos químicos para avaliação adicional de toxicidade potencial. Sob a Lei de Controle de Substâncias Tóxicas dos EUA (TSCA), a EPA tem usado desde 1979 uma abordagem SAR como uma “primeira triagem” de novos produtos químicos no processo de notificação pré-fabricação (PMN); A Austrália usa uma abordagem semelhante como parte de seu procedimento de notificação de novos produtos químicos (NICNAS). Nos EUA, a análise SAR é uma base importante para determinar se há uma base razoável para concluir que a fabricação, processamento, distribuição, uso ou descarte da substância apresentará um risco não razoável de danos à saúde humana ou ao meio ambiente, conforme exigido pela Seção 5(f) do TSCA. Com base nessa descoberta, a EPA pode exigir testes reais da substância sob a Seção 6 da TSCA.

Justificativa para SAR

A justificativa científica para SAR é baseada na suposição de que a estrutura molecular de um produto químico irá prever aspectos importantes de seu comportamento em sistemas físico-químicos e biológicos (Hansch e Leo 1979).

Processo SAR

O processo de revisão SAR inclui a identificação da estrutura química, incluindo formulações empíricas, bem como o composto puro; identificação de substâncias estruturalmente análogas; pesquisar bancos de dados e literatura para obter informações sobre análogos estruturais; e análise de toxicidade e outros dados sobre análogos estruturais. Em alguns casos raros, informações apenas sobre a estrutura do composto podem ser suficientes para apoiar algumas análises de SAR, com base em mecanismos de toxicidade bem compreendidos. Vários bancos de dados sobre SAR foram compilados, bem como métodos baseados em computador para previsão de estruturas moleculares.

Com esta informação, os seguintes endpoints podem ser estimados com SAR:

• parâmetros físico-químicos: ponto de ebulição, pressão de vapor, solubilidade em água, coeficiente de partição octanol/água
• parâmetros de destino biológico/ambiental: biodegradação, sorção do solo, fotodegradação, farmacocinética
• parâmetros de toxicidade: toxicidade para organismos aquáticos, absorção, toxicidade aguda para mamíferos (teste de limite ou LD₅₀), irritação dérmica, pulmonar e ocular, sensibilização, toxicidade subcrônica, mutagenicidade.

Deve-se observar que não existem métodos SAR para parâmetros de saúde importantes como carcinogenicidade, toxicidade para o desenvolvimento, toxicidade reprodutiva, neurotoxicidade, imunotoxicidade ou outros efeitos em órgãos-alvo. Isso se deve a três fatores: a falta de um grande banco de dados para testar as hipóteses de SAR, a falta de conhecimento dos determinantes estruturais da ação tóxica e a multiplicidade de células-alvo e mecanismos envolvidos nesses parâmetros (consulte “The United States abordagem para avaliação de risco de tóxicos reprodutivos e agentes neurotóxicos”). Algumas tentativas limitadas de utilizar o SAR para prever a farmacocinética usando informações sobre coeficientes de partição e solubilidade (Johanson e Naslund 1988). SAR quantitativo mais extenso foi feito para prever o metabolismo dependente de P450 de uma variedade de compostos e a ligação de moléculas semelhantes a dioxina e PCB ao receptor citosólico de “dioxina” (Hansch e Zhang 1993).

A SAR mostrou ter previsibilidade variável para alguns dos parâmetros listados acima, conforme mostrado na tabela 1. Esta tabela apresenta dados de duas comparações de atividade prevista com resultados reais obtidos por medição empírica ou teste de toxicidade. O SAR conduzido por especialistas da EPA dos EUA teve um desempenho pior para prever propriedades físico-químicas do que para prever atividades biológicas, incluindo biodegradação. Para endpoints de toxicidade, o SAR teve o melhor desempenho para prever a mutagenicidade. Ashby e Tennant (1991), em um estudo mais extenso, também encontraram boa previsibilidade de genotoxicidade de curto prazo em sua análise de produtos químicos NTP. Essas descobertas não são surpreendentes, dada a compreensão atual dos mecanismos moleculares de genotoxicidade (consulte “Toxicologia genética”) e o papel da eletrofilicidade na ligação do DNA. Em contraste, a SAR tendeu a subestimar a toxicidade sistêmica e subcrônica em mamíferos e superestimar a toxicidade aguda para organismos aquáticos.

Tabela 1. Comparação de SAR e dados de teste: análises OCDE/NTP

Fonte: Dados da OCDE, comunicação pessoal C. Auer, US EPA. Somente os endpoints para os quais previsões de SAR comparáveis ​​e dados de teste reais estavam disponíveis foram usados ​​nesta análise. Os dados NTP são de Ashby e Tennant 1991.

¹ Preocupante foi a falha do SAR em prever a toxicidade aguda em 12% dos produtos químicos testados.

² Dados da OCDE, com base na concordância do teste Ames com SAR

³ Dados de NTP, baseados em ensaios de genetox em comparação com previsões de SAR para várias classes de “produtos químicos de alerta estrutural”.

⁴ A concordância varia com a classe; maior concordância foi com compostos amino/nitro aromáticos; mais baixo com estruturas “miscelâneas”.

Para outros endpoints tóxicos, conforme observado acima, o SAR tem utilidade menos demonstrável. As previsões de toxicidade em mamíferos são complicadas pela falta de SAR para toxicocinética de moléculas complexas. No entanto, algumas tentativas foram feitas para propor princípios SAR para parâmetros complexos de toxicidade em mamíferos (por exemplo, ver Bernstein (1984) para uma análise SAR de potenciais tóxicos reprodutivos masculinos). Na maioria dos casos, o banco de dados é muito pequeno para permitir testes rigorosos de previsões baseadas em estrutura.

Neste ponto, pode-se concluir que o SAR pode ser útil principalmente para priorizar o investimento em recursos de teste de toxicidade ou para levantar preocupações iniciais sobre perigo potencial. Somente no caso de mutagenicidade é provável que a análise SAR por si só possa ser utilizada com confiabilidade para informar outras decisões. Para nenhum parâmetro, é provável que o SAR possa fornecer o tipo de informação quantitativa necessária para fins de avaliação de risco, conforme discutido em outra parte deste capítulo e enciclopédia.

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O surgimento de tecnologias sofisticadas em biologia molecular e celular estimulou uma evolução relativamente rápida nas ciências da vida, incluindo a toxicologia. Com efeito, o foco da toxicologia está mudando de animais inteiros e populações de animais inteiros para as células e moléculas de animais individuais e humanos. Desde meados da década de 1980, os toxicologistas começaram a empregar essas novas metodologias para avaliar os efeitos dos produtos químicos nos sistemas vivos. Como uma progressão lógica, tais métodos estão sendo adaptados para fins de teste de toxicidade. Esses avanços científicos trabalharam em conjunto com fatores sociais e econômicos para efetuar mudanças na avaliação da segurança do produto e do risco potencial.

Os fatores econômicos estão especificamente relacionados ao volume de materiais que devem ser testados. Uma infinidade de novos cosméticos, produtos farmacêuticos, pesticidas, produtos químicos e produtos domésticos é introduzida no mercado todos os anos. Todos esses produtos devem ser avaliados quanto à sua toxicidade potencial. Além disso, há um acúmulo de produtos químicos já em uso que não foram adequadamente testados. A enorme tarefa de obter informações de segurança detalhadas sobre todos esses produtos químicos usando métodos tradicionais de testes em animais inteiros seria dispendiosa em termos de dinheiro e tempo, se ao menos pudesse ser realizada.

Há também questões sociais relacionadas à saúde e segurança pública, bem como a crescente preocupação pública com o uso de animais para testes de segurança de produtos. No que diz respeito à segurança humana, grupos de interesse público e de defesa do meio ambiente exerceram pressão significativa sobre as agências governamentais para aplicar regulamentos mais rigorosos sobre produtos químicos. Um exemplo recente disso foi um movimento de alguns grupos ambientalistas para proibir o cloro e compostos contendo cloro nos Estados Unidos. Uma das motivações para uma ação tão extrema reside no fato de que a maioria desses compostos nunca foi adequadamente testada. Do ponto de vista toxicológico, o conceito de proibir toda uma classe de diversos produtos químicos com base apenas na presença de cloro é cientificamente infundado e irresponsável. No entanto, é compreensível que, do ponto de vista do público, haja alguma garantia de que os produtos químicos liberados no meio ambiente não representam um risco significativo à saúde. Tal situação ressalta a necessidade de métodos mais eficientes e rápidos para avaliar a toxicidade.

A outra preocupação social que impactou a área de testes de toxicidade é o bem-estar animal. O número crescente de grupos de proteção animal em todo o mundo expressou considerável oposição ao uso de animais inteiros para testes de segurança de produtos. Campanhas ativas foram travadas contra fabricantes de cosméticos, produtos domésticos e de cuidados pessoais e farmacêuticos na tentativa de interromper os testes em animais. Tais esforços na Europa resultaram na aprovação da Sexta Emenda à Diretiva 76/768/EEC (Diretiva de Cosméticos). A consequência desta Diretiva é que os produtos cosméticos ou ingredientes cosméticos que foram testados em animais após 1º de janeiro de 1998 não podem ser comercializados na União Européia, a menos que métodos alternativos sejam insuficientemente validados. Embora esta Diretiva não tenha jurisdição sobre a venda de tais produtos nos Estados Unidos ou em outros países, ela afetará significativamente as empresas que possuem mercados internacionais que incluem a Europa.

O conceito de alternativas, que constitui a base para o desenvolvimento de outros testes além dos animais inteiros, é definido pelos três Rs: redução no número de animais utilizados; refinamento de protocolos para que os animais experimentem menos estresse ou desconforto; e substituição dos atuais testes em animais com testes in vitro (ou seja, testes feitos fora do animal vivo), modelos de computador ou teste em vertebrados inferiores ou espécies de invertebrados. Os três Rs foram introduzidos em um livro publicado em 1959 por dois cientistas britânicos, WMS Russell e Rex Burch, Os Princípios da Técnica Experimental Humanitária. Russell e Burch afirmaram que a única maneira pela qual resultados científicos válidos podem ser obtidos é por meio do tratamento humano dos animais, e acreditavam que métodos deveriam ser desenvolvidos para reduzir o uso de animais e, finalmente, substituí-los. Curiosamente, os princípios delineados por Russell e Burch receberam pouca atenção até o ressurgimento do movimento de bem-estar animal em meados da década de 1970. Hoje o conceito dos três Rs está muito na vanguarda no que diz respeito à pesquisa, testes e educação.

Em resumo, o desenvolvimento de metodologias de testes in vitro foi influenciado por uma variedade de fatores que convergiram nos últimos dez a 20 anos. É difícil determinar se algum desses fatores isoladamente teria um efeito tão profundo nas estratégias de teste de toxicidade.

Conceito de testes de toxicidade in vitro

Esta seção se concentrará apenas nos métodos in vitro para avaliar a toxicidade, como uma das alternativas aos testes em animais inteiros. Alternativas adicionais não animais, como modelagem por computador e relações quantitativas entre estrutura e atividade, são discutidas em outros artigos deste capítulo.

Os estudos in vitro são geralmente conduzidos em células ou tecidos animais ou humanos fora do corpo. In vitro significa literalmente “em vidro” e refere-se a procedimentos realizados em material vivo ou componentes de material vivo cultivados em placas de Petri ou em tubos de ensaio sob condições definidas. Estes podem ser contrastados com estudos in vivo, ou aqueles realizados “no animal vivo”. Embora seja difícil, se não impossível, projetar os efeitos de uma substância química em um organismo complexo quando as observações estão confinadas a um único tipo de células em uma placa, os estudos in vitro fornecem uma quantidade significativa de informações sobre a toxicidade intrínseca também como mecanismos celulares e moleculares de toxicidade. Além disso, eles oferecem muitas vantagens em relação aos estudos in vivo, pois geralmente são menos caros e podem ser conduzidos em condições mais controladas. Além disso, apesar de ainda ser necessário um pequeno número de animais para obter células para culturas in vitro, esses métodos podem ser considerados alternativas de redução (uma vez que são usados ​​muito menos animais em comparação com estudos in vivo) e alternativas de refinamento (porque eliminam a necessidade submeter os animais às consequências tóxicas adversas impostas pelos experimentos in vivo).

Para interpretar os resultados dos testes de toxicidade in vitro, determinar sua utilidade potencial na avaliação da toxicidade e relacioná-los com o processo toxicológico geral in vivo, é necessário entender qual parte do processo toxicológico está sendo examinada. Todo o processo toxicológico consiste em eventos que se iniciam com a exposição do organismo a um agente físico ou químico, progridem por meio de interações celulares e moleculares e, por fim, se manifestam na resposta de todo o organismo. Os testes in vitro são geralmente limitados à parte do processo toxicológico que ocorre no nível celular e molecular. Os tipos de informação que podem ser obtidos a partir de estudos in vitro incluem vias de metabolismo, interação de metabólitos ativos com alvos celulares e moleculares e desfechos tóxicos potencialmente mensuráveis ​​que podem servir como biomarcadores moleculares para exposição. Em uma situação ideal, o mecanismo de toxicidade de cada produto químico decorrente da exposição à manifestação no organismo seria conhecido, de forma que as informações obtidas nos testes in vitro pudessem ser totalmente interpretadas e relacionadas à resposta de todo o organismo. No entanto, isso é virtualmente impossível, uma vez que relativamente poucos mecanismos toxicológicos completos foram elucidados. Assim, os toxicologistas se deparam com uma situação na qual os resultados de um teste in vitro não podem ser usados ​​como uma previsão totalmente precisa da toxicidade in vivo porque o mecanismo é desconhecido. No entanto, frequentemente durante o processo de desenvolvimento de um teste in vitro, componentes do(s) mecanismo(s) celular e molecular de toxicidade são elucidados.

Uma das principais questões não resolvidas em torno do desenvolvimento e implementação de testes in vitro está relacionada à seguinte consideração: eles devem ser mecanicistas ou basta que sejam descritivos? É indiscutivelmente melhor, do ponto de vista científico, utilizar apenas testes baseados em mecanismos como substitutos para testes in vivo. No entanto, na ausência de conhecimento mecanicista completo, a perspectiva de desenvolver testes in vitro para substituir completamente os testes com animais inteiros em um futuro próximo é quase nula. Isso não exclui, no entanto, o uso de tipos de ensaios mais descritivos como ferramentas de triagem precoce, o que é o caso atualmente. Essas telas resultaram em uma redução significativa no uso de animais. Portanto, até que mais informações mecanísticas sejam geradas, pode ser necessário empregar, de forma mais limitada, testes cujos resultados simplesmente se correlacionam bem com os obtidos in vivo.

Testes in vitro para citotoxicidade

Nesta seção, serão descritos vários testes in vitro que foram desenvolvidos para avaliar o potencial citotóxico de um produto químico. Na maior parte, esses testes são fáceis de realizar e a análise pode ser automatizada. Um teste in vitro comumente usado para citotoxicidade é o ensaio de vermelho neutro. Este ensaio é feito em células em cultura e, para a maioria das aplicações, as células podem ser mantidas em placas de cultura que contêm 96 pequenos poços, cada um com 6.4 mm de diâmetro. Uma vez que cada poço pode ser utilizado para uma única determinação, esta disposição pode acomodar múltiplas concentrações do produto químico em estudo, bem como controlos positivos e negativos com um número suficiente de réplicas para cada um. Após o tratamento das células com várias concentrações do produto químico de teste variando em pelo menos duas ordens de grandeza (por exemplo, de 0.01 mM a 1 mM), bem como produtos químicos de controle positivo e negativo, as células são lavadas e tratadas com vermelho neutro, um corante que pode ser captado e retido apenas por células vivas. O corante pode ser adicionado após a remoção do produto químico em estudo para determinar os efeitos imediatos, ou pode ser adicionado várias vezes após a remoção do produto químico em estudo para determinar os efeitos cumulativos ou retardados. A intensidade da cor em cada poço corresponde ao número de células vivas naquele poço. A intensidade da cor é medida por um espectrofotômetro que pode ser equipado com um leitor de placas. O leitor de placas é programado para fornecer medições individuais para cada um dos 96 poços da placa de cultura. Essa metodologia automatizada permite que o investigador execute rapidamente um experimento de concentração-resposta e obtenha dados estatisticamente úteis.

Outro ensaio relativamente simples para citotoxicidade é o teste MTT. O MTT (brometo de 3[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio) é um corante de tetrazólio que é reduzido por enzimas mitocondriais a uma cor azul. Apenas as células com mitocôndrias viáveis ​​manterão a capacidade de realizar esta reação; portanto, a intensidade da cor está diretamente relacionada ao grau de integridade mitocondrial. Este é um teste útil para detectar compostos citotóxicos gerais, bem como aqueles agentes que visam especificamente as mitocôndrias.

A medição da atividade da lactato desidrogenase (LDH) também é usada como um ensaio de base ampla para citotoxicidade. Esta enzima está normalmente presente no citoplasma de células vivas e é liberada no meio de cultura celular através de membranas celulares permeáveis ​​de células mortas ou moribundas que foram adversamente afetadas por um agente tóxico. Pequenas quantidades de meio de cultura podem ser removidas em vários momentos após o tratamento químico das células para medir a quantidade de LDH liberada e determinar o tempo de toxicidade. Embora o ensaio de liberação de LDH seja uma avaliação muito geral da citotoxicidade, é útil porque é fácil de realizar e pode ser feito em tempo real.

Existem muitos novos métodos sendo desenvolvidos para detectar danos celulares. Métodos mais sofisticados empregam sondas fluorescentes para medir uma variedade de parâmetros intracelulares, como liberação de cálcio e mudanças no pH e potencial de membrana. Em geral, essas sondas são muito sensíveis e podem detectar alterações celulares mais sutis, reduzindo assim a necessidade de usar a morte celular como ponto final. Além disso, muitos desses ensaios fluorescentes podem ser automatizados pelo uso de placas de 96 poços e leitores de placas fluorescentes.

Uma vez que os dados tenham sido coletados em uma série de produtos químicos usando um desses testes, as toxicidades relativas podem ser determinadas. A toxicidade relativa de um produto químico, conforme determinado em um teste in vitro, pode ser expressa como a concentração que exerce um efeito de 50% na resposta final de células não tratadas. Esta determinação é referida como CE₅₀ (Eeficaz Cconcentração para 50% das células) e pode ser usado para comparar toxicidades de diferentes produtos químicos in vitro. (Um termo semelhante usado na avaliação da toxicidade relativa é IC₅₀, indicando a concentração de uma substância química que causa uma inibição de 50% de um processo celular, por exemplo, a capacidade de absorver o vermelho neutro.) Não é fácil avaliar se a toxicidade relativa in vitro das substâncias químicas é comparável à sua relativa em toxicidades in vivo, uma vez que existem muitos fatores de confusão no sistema in vivo, como toxicocinética, metabolismo, reparação e mecanismos de defesa. Além disso, como a maioria desses ensaios mede os pontos finais de citotoxicidade geral, eles não são baseados em mecanismos. Portanto, a concordância entre as toxicidades relativas in vitro e in vivo é simplesmente correlativa. Apesar das inúmeras complexidades e dificuldades em extrapolar de in vitro para in vivo, esses testes in vitro estão se mostrando muito valiosos porque são simples e baratos de realizar e podem ser usados ​​como telas para sinalizar drogas ou produtos químicos altamente tóxicos em estágios iniciais de desenvolvimento.

Toxicidade do Órgão Alvo

Testes in vitro também podem ser usados ​​para avaliar a toxicidade de órgãos-alvo específicos. Há uma série de dificuldades associadas ao planejamento de tais testes, sendo a mais notável a incapacidade dos sistemas in vitro de manter muitas das características do órgão in vivo. Frequentemente, quando as células são retiradas de animais e colocadas em cultura, elas tendem a degenerar rapidamente e/ou a se desdiferenciar, ou seja, perdem suas funções de órgãos e se tornam mais genéricas. Isso representa um problema, pois em um curto período de tempo, geralmente alguns dias, as culturas não são mais úteis para avaliar os efeitos específicos de uma toxina em órgãos.

Muitos desses problemas estão sendo superados por causa dos recentes avanços na biologia molecular e celular. A informação que é obtida sobre o ambiente celular in vivo pode ser utilizada na modulação das condições de cultura in vitro. Desde meados da década de 1980, novos fatores de crescimento e citocinas foram descobertos, e muitos deles estão agora disponíveis comercialmente. A adição desses fatores às células em cultura ajuda a preservar sua integridade e também pode ajudar a reter funções mais diferenciadas por períodos de tempo mais longos. Outros estudos básicos ampliaram o conhecimento das necessidades nutricionais e hormonais das células em cultura, para que novos meios possam ser formulados. Avanços recentes também foram feitos na identificação de matrizes extracelulares naturais e artificiais nas quais as células podem ser cultivadas. A cultura de células nessas diferentes matrizes pode ter efeitos profundos em sua estrutura e função. Uma grande vantagem derivada desse conhecimento é a capacidade de controlar intrincadamente o ambiente das células em cultura e examinar individualmente os efeitos desses fatores nos processos celulares básicos e em suas respostas a diferentes agentes químicos. Em suma, esses sistemas podem fornecer uma grande visão sobre os mecanismos de toxicidade específicos do órgão.

Muitos estudos de toxicidade de órgãos-alvo são conduzidos em células primárias, que por definição são isoladas recentemente de um órgão e geralmente exibem um tempo de vida finito em cultura. Existem muitas vantagens em ter culturas primárias de um único tipo de célula de um órgão para avaliação de toxicidade. De uma perspectiva mecanicista, tais culturas são úteis para estudar alvos celulares específicos de uma substância química. Em alguns casos, dois ou mais tipos de células de um órgão podem ser cultivados juntos, e isso oferece uma vantagem adicional de poder observar as interações célula-célula em resposta a uma toxina. Alguns sistemas de co-cultura para pele foram projetados de modo que formem uma estrutura tridimensional semelhante à pele in vivo. Também é possível co-cultivar células de diferentes órgãos – por exemplo, fígado e rim. Esse tipo de cultura seria útil para avaliar os efeitos específicos das células renais de uma substância química que deve ser bioativada no fígado.

As ferramentas biológicas moleculares também desempenharam um papel importante no desenvolvimento de linhagens celulares contínuas que podem ser úteis para testes de toxicidade de órgãos-alvo. Estas linhas celulares são geradas por transfecção de ADN em células primárias. No procedimento de transfecção, as células e o DNA são tratados de forma que o DNA possa ser absorvido pelas células. O DNA geralmente é de um vírus e contém um gene ou genes que, quando expressos, permitem que as células se tornem imortalizadas (ou seja, capazes de viver e crescer por longos períodos de tempo em cultura). O DNA também pode ser manipulado de modo que o gene imortalizador seja controlado por um promotor induzível. A vantagem desse tipo de construção é que as células se dividirão apenas quando receberem o estímulo químico apropriado para permitir a expressão do gene imortalizador. Um exemplo dessa construção é o grande gene do antígeno T do Simian Virus 40 (SV40) (o gene da imortalização), precedido pela região promotora do gene da metalotioneína, que é induzido pela presença de um metal no meio de cultura. Assim, após o gene ser transfectado nas células, as células podem ser tratadas com baixas concentrações de zinco para estimular o promotor MT e ativar a expressão do gene do antígeno T. Nessas condições, as células proliferam. Quando o zinco é removido do meio, as células param de se dividir e, em condições ideais, retornam a um estado em que expressam suas funções específicas do tecido.

A capacidade de gerar células imortalizadas combinada com os avanços na tecnologia de cultura de células contribuíram muito para a criação de linhagens de células de vários órgãos diferentes, incluindo cérebro, rim e fígado. No entanto, antes que essas linhagens celulares possam ser usadas como substitutas para os tipos celulares genuínos, elas devem ser cuidadosamente caracterizadas para determinar o quão “normais” elas realmente são.

Outros sistemas in vitro para estudar a toxicidade de órgãos-alvo envolvem complexidade crescente. À medida que os sistemas in vitro progridem em complexidade de uma única célula para cultura de órgão inteiro, eles se tornam mais comparáveis ​​ao meio in vivo, mas ao mesmo tempo tornam-se muito mais difíceis de controlar devido ao aumento do número de variáveis. Portanto, o que pode ser ganho ao passar para um nível mais alto de organização pode ser perdido na incapacidade do pesquisador de controlar o ambiente experimental. A Tabela 1 compara algumas das características de vários sistemas in vitro que têm sido usados ​​para estudar a hepatotoxicidade.

Tabela 1. Comparação de sistemas in vitro para estudos de hepatotoxicidade

Fatias de tecido cortadas com precisão estão sendo usadas mais extensivamente para estudos toxicológicos. Existem novos instrumentos disponíveis que permitem ao pesquisador cortar fatias de tecido uniformes em um ambiente estéril. As fatias de tecido oferecem alguma vantagem sobre os sistemas de cultura de células, pois todos os tipos de células do órgão estão presentes e mantêm sua arquitetura in vivo e comunicação intercelular. Assim, estudos in vitro podem ser conduzidos para determinar o tipo de célula-alvo dentro de um órgão, bem como para investigar a toxicidade específica do órgão-alvo. Uma desvantagem das fatias é que elas degeneram rapidamente após as primeiras 24 horas de cultivo, principalmente devido à má difusão de oxigênio para as células no interior das fatias. No entanto, estudos recentes indicaram que uma aeração mais eficiente pode ser alcançada por meio de uma rotação suave. Isso, junto com o uso de um meio mais complexo, permite que as fatias sobrevivam por até 96 horas.

Os explantes de tecido são semelhantes em conceito às fatias de tecido e também podem ser usados ​​para determinar a toxicidade de produtos químicos em órgãos-alvo específicos. Os explantes de tecido são estabelecidos removendo um pequeno pedaço de tecido (para estudos de teratogenicidade, um embrião intacto) e colocando-o em cultura para estudo posterior. As culturas de explantes têm sido úteis para estudos de toxicidade de curto prazo, incluindo irritação e corrosividade na pele, estudos de amianto na traqueia e estudos de neurotoxicidade no tecido cerebral.

Órgãos perfundidos isolados também podem ser usados ​​para avaliar a toxicidade do órgão-alvo. Esses sistemas oferecem uma vantagem semelhante à das fatias de tecido e explantes, pois todos os tipos de células estão presentes, mas sem o estresse ao tecido introduzido pelas manipulações envolvidas na preparação das fatias. Além disso, permitem a manutenção das interações intra-órgãos. Uma grande desvantagem é sua viabilidade a curto prazo, o que limita seu uso para testes de toxicidade in vitro. Em termos de alternativa, essas culturas podem ser consideradas um refinamento, uma vez que os animais não sofrem as consequências adversas do tratamento in vivo com tóxicos. No entanto, seu uso não diminui significativamente o número de animais necessários.

Em resumo, existem vários tipos de sistemas in vitro disponíveis para avaliar a toxicidade do órgão-alvo. É possível obter muitas informações sobre os mecanismos de toxicidade usando uma ou mais dessas técnicas. A dificuldade permanece em saber como extrapolar de um sistema in vitro, que representa uma parte relativamente pequena do processo toxicológico, para todo o processo que ocorre in vivo.

Testes in vitro para irritação ocular

Talvez o teste de toxicidade de animal inteiro mais controverso do ponto de vista do bem-estar animal seja o teste de Draize para irritação ocular, realizado em coelhos. Neste teste, uma pequena dose fixa de uma substância química é colocada em um dos olhos do coelho enquanto o outro olho é usado como controle. O grau de irritação e inflamação é pontuado em vários momentos após a exposição. Um grande esforço está sendo feito para desenvolver metodologias para substituir este teste, que tem sido criticado não apenas por razões humanas, mas também pela subjetividade das observações e variabilidade dos resultados. É interessante notar que, apesar das duras críticas que o teste de Draize recebeu, ele provou ser notavelmente bem-sucedido em prever irritantes oculares humanos, particularmente substâncias levemente a moderadamente irritantes, que são difíceis de identificar por outros métodos. Assim, as demandas por alternativas in vitro são grandes.

A busca por alternativas ao teste de Draize é complicada, embora se preveja um sucesso. Numerosas alternativas in vitro e outras alternativas foram desenvolvidas e, em alguns casos, implementadas. Alternativas de refinamento ao teste de Draize, que por definição são menos dolorosas ou angustiantes para os animais, incluem o Teste do Olho de Baixo Volume, no qual quantidades menores de materiais de teste são colocadas nos olhos dos coelhos, não apenas por razões humanas, mas para imitam mais de perto as quantidades às quais as pessoas podem realmente ser acidentalmente expostas. Outro refinamento é que as substâncias com pH menor que 2 ou maior que 11.5 não são mais testadas em animais, pois são conhecidas por serem severamente irritantes para os olhos.

Entre 1980 e 1989, houve um declínio estimado de 87% no número de coelhos usados ​​para testes de irritação ocular de cosméticos. Testes in vitro foram incorporados como parte de uma abordagem de teste de nível para trazer essa grande redução em testes com animais inteiros. Essa abordagem é um processo de várias etapas que começa com um exame minucioso dos dados históricos de irritação ocular e análises físicas e químicas do produto químico a ser avaliado. Se esses dois processos não fornecerem informações suficientes, uma bateria de testes in vitro é realizada. Os dados adicionais obtidos nos testes in vitro podem então ser suficientes para avaliar a segurança da substância. Caso contrário, a etapa final seria realizar testes in vivo limitados. É fácil ver como esta abordagem pode eliminar ou pelo menos reduzir drasticamente o número de animais necessários para prever a segurança de uma substância de teste.

A bateria de testes in vitro usada como parte dessa estratégia de teste de nível depende das necessidades da indústria em particular. O teste de irritação ocular é feito por uma ampla variedade de indústrias, de cosméticos a produtos farmacêuticos e produtos químicos industriais. O tipo de informação exigida por cada setor varia e, portanto, não é possível definir uma única bateria de testes in vitro. Uma bateria de testes geralmente é projetada para avaliar cinco parâmetros: citotoxicidade, alterações na fisiologia e bioquímica do tecido, relações quantitativas entre estrutura e atividade, mediadores de inflamação e recuperação e reparo. Um exemplo de teste de citotoxicidade, que é uma possível causa de irritação, é o ensaio de vermelho neutro usando células cultivadas (ver acima). Alterações na fisiologia celular e bioquímica resultantes da exposição a um produto químico podem ser analisadas em culturas de células epiteliais da córnea humana. Alternativamente, os investigadores também usaram globos oculares intactos ou dissecados de bovinos ou de galinhas obtidos de matadouros. Muitos dos parâmetros medidos nessas culturas de órgãos inteiros são os mesmos medidos in vivo, como a opacidade da córnea e o inchaço da córnea.

A inflamação é frequentemente um componente da lesão ocular induzida por produtos químicos, e há vários ensaios disponíveis para examinar esse parâmetro. Vários ensaios bioquímicos detectam a presença de mediadores liberados durante o processo inflamatório, como ácido araquidônico e citocinas. A membrana corioalantóide (CAM) do ovo de galinha também pode ser usada como um indicador de inflamação. No ensaio CAM, um pequeno pedaço da casca de um embrião de galinha de dez a 14 dias é removido para expor o CAM. O produto químico é então aplicado ao CAM e os sinais de inflamação, como hemorragia vascular, são pontuados em vários momentos a partir de então.

Um dos processos in vivo mais difíceis de avaliar in vitro é a recuperação e reparação de lesões oculares. Um instrumento recém-desenvolvido, o microfisiômetro de silício, mede pequenas mudanças no pH extracelular e pode ser usado para monitorar células cultivadas em tempo real. Esta análise demonstrou correlacionar-se razoavelmente bem com a recuperação in vivo e tem sido usada como um teste in vitro para este processo. Esta foi uma breve visão geral dos tipos de testes empregados como alternativas ao teste de Draize para irritação ocular. É provável que nos próximos anos uma série completa de baterias de teste in vitro seja definida e cada uma seja validada para sua finalidade específica.

Validação

A chave para a aceitação regulatória e implementação de metodologias de teste in vitro é a validação, o processo pelo qual a credibilidade de um teste candidato é estabelecida para uma finalidade específica. Esforços para definir e coordenar o processo de validação foram feitos tanto nos Estados Unidos quanto na Europa. A União Européia estabeleceu o Centro Europeu para a Validação de Métodos Alternativos (ECVAM) em 1993 para coordenar esforços e interagir com organizações americanas como o Johns Hopkins Center for Alternatives to Animal Testing (CAAT), um centro acadêmico nos Estados Unidos , e o Comitê de Coordenação Interagencial para a Validação de Métodos Alternativos (ICCVAM), composto por representantes dos Institutos Nacionais de Saúde, da Agência de Proteção Ambiental dos EUA, da Administração de Alimentos e Medicamentos dos EUA e da Comissão de Segurança de Produtos de Consumo.

A validação de testes in vitro requer organização e planejamento substanciais. Deve haver consenso entre reguladores do governo e cientistas industriais e acadêmicos sobre procedimentos aceitáveis ​​e supervisão suficiente por um conselho consultivo científico para garantir que os protocolos atendam aos padrões estabelecidos. Os estudos de validação devem ser realizados em uma série de laboratórios de referência usando conjuntos calibrados de produtos químicos de um banco químico e células ou tecidos de uma única fonte. Tanto a repetibilidade intralaboratorial quanto a reprodutibilidade interlaboratorial de um teste candidato devem ser demonstradas e os resultados submetidos à análise estatística apropriada. Uma vez compilados os resultados dos diferentes componentes dos estudos de validação, o conselho científico pode fazer recomendações sobre a validade do(s) teste(s) candidato(s) para uma finalidade específica. Além disso, os resultados dos estudos devem ser publicados em periódicos revisados ​​por pares e colocados em um banco de dados.

A definição do processo de validação é atualmente um trabalho em andamento. Cada novo estudo de validação fornecerá informações úteis para o desenho do próximo estudo. A comunicação e a cooperação internacional são essenciais para o desenvolvimento rápido de uma série de protocolos amplamente aceitáveis, especialmente devido à crescente urgência imposta pela aprovação da Diretiva de Cosméticos da CE. Esta legislação pode, de fato, fornecer o ímpeto necessário para um esforço sério de validação a ser realizado. É somente com a conclusão deste processo que a aceitação dos métodos in vitro pelas várias comunidades reguladoras pode começar.

Conclusão

Este artigo forneceu uma ampla visão geral do status atual dos testes de toxicidade in vitro. A ciência da toxicologia in vitro é relativamente jovem, mas está crescendo exponencialmente. O desafio para os próximos anos é incorporar o conhecimento mecanístico gerado por estudos celulares e moleculares no vasto inventário de dados in vivo para fornecer uma descrição mais completa dos mecanismos toxicológicos, bem como estabelecer um paradigma pelo qual os dados in vitro possam ser usados para prever a toxicidade in vivo. Somente por meio dos esforços conjuntos de toxicologistas e representantes do governo é que o valor inerente desses métodos in vitro poderá ser realizado.

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A avaliação da toxicidade genética é a avaliação dos agentes quanto à sua capacidade de induzir qualquer um dos três tipos gerais de alterações (mutações) no material genético (DNA): gene, cromossômico e genômico. Em organismos como os humanos, os genes são compostos de DNA, que consiste em unidades individuais chamadas bases de nucleotídeos. Os genes são arranjados em estruturas físicas discretas chamadas cromossomos. A genotoxicidade pode resultar em efeitos significativos e irreversíveis na saúde humana. O dano genotóxico é um passo crítico na indução do câncer e também pode estar envolvido na indução de defeitos congênitos e morte fetal. As três classes de mutações mencionadas acima podem ocorrer dentro de qualquer um dos dois tipos de tecidos possuídos por organismos como os humanos: esperma ou óvulos (células germinativas) e o tecido remanescente (células somáticas).

Os ensaios que medem a mutação genética são aqueles que detectam a substituição, adição ou deleção de nucleotídeos dentro de um gene. Os ensaios que medem a mutação cromossômica são aqueles que detectam quebras ou rearranjos cromossômicos envolvendo um ou mais cromossomos. Os ensaios que medem a mutação genômica são aqueles que detectam alterações no número de cromossomos, uma condição chamada aneuploidia. A avaliação da toxicidade genética mudou consideravelmente desde o desenvolvimento por Herman Muller em 1927 do primeiro ensaio para detectar agentes genotóxicos (mutagênicos). Desde então, foram desenvolvidos mais de 200 ensaios que medem mutações no DNA; no entanto, menos de dez ensaios são comumente usados ​​atualmente para avaliação de toxicidade genética. Este artigo analisa esses ensaios, descreve o que eles medem e explora o papel desses ensaios na avaliação de toxicidade.

Identificação de Riscos de Câncer Antes do Desenvolvimento do Campo da Toxicologia Genética

A toxicologia genética tornou-se parte integrante do processo geral de avaliação de risco e ganhou estatura nos últimos tempos como um preditor confiável para atividade carcinogênica. No entanto, antes do desenvolvimento da toxicologia genética (antes de 1970), outros métodos foram e ainda estão sendo usados ​​para identificar riscos potenciais de câncer para os seres humanos. Existem seis categorias principais de métodos atualmente usados ​​para identificar riscos de câncer humano: estudos epidemiológicos, bioensaios in vivo de longo prazo, bioensaios in vivo de médio prazo, bioensaios in vivo e in vitro de curto prazo, inteligência artificial (estrutura-atividade), e inferência baseada em mecanismo.

A Tabela 1 apresenta as vantagens e desvantagens desses métodos.

Tabela 1. Vantagens e desvantagens dos métodos atuais para identificar riscos de câncer humano

Justificativa e Base Conceitual para Ensaios de Toxicologia Genética

Embora os tipos e números exatos de ensaios usados ​​para avaliação de toxicidade genética estejam em constante evolução e variem de país para país, os mais comuns incluem ensaios para (1) mutação genética em bactérias e/ou células de mamíferos cultivadas e (2) mutação cromossômica em células de mamíferos cultivadas e/ou medula óssea em camundongos vivos. Alguns dos ensaios dentro desta segunda categoria também podem detectar aneuploidia. Embora esses ensaios não detectem mutações em células germinativas, eles são usados ​​principalmente devido ao custo extra e à complexidade da realização de ensaios de células germinativas. No entanto, ensaios de células germinativas em camundongos são usados ​​quando informações sobre os efeitos das células germinativas são desejadas.

Estudos sistemáticos durante um período de 25 anos (1970-1995), especialmente no Programa Nacional de Toxicologia dos EUA na Carolina do Norte, resultaram no uso de um número discreto de ensaios para detectar a atividade mutagênica dos agentes. A justificativa para avaliar a utilidade dos ensaios foi baseada em sua capacidade de detectar agentes que causam câncer em roedores e que são suspeitos de causar câncer em humanos (ou seja, carcinógenos). Isso ocorre porque estudos durante as últimas décadas indicaram que as células cancerígenas contêm mutações em certos genes e que muitos carcinógenos também são mutagênicos. Assim, as células cancerígenas são vistas como contendo mutações de células somáticas, e a carcinogênese é vista como um tipo de mutagênese de células somáticas.

Os ensaios de toxicidade genética usados ​​mais comumente hoje foram selecionados não apenas por causa de seu grande banco de dados, custo relativamente baixo e facilidade de desempenho, mas porque demonstraram detectar muitos carcinógenos de roedores e, presumivelmente, humanos. Consequentemente, os ensaios de toxicidade genética são usados ​​para prever a potencial carcinogenicidade dos agentes.

Um importante desenvolvimento conceitual e prático no campo da toxicologia genética foi o reconhecimento de que muitos carcinógenos foram modificados por enzimas dentro do corpo, criando formas alteradas (metabólitos) que frequentemente eram a forma carcinogênica e mutagênica definitiva do produto químico original. Para duplicar esse metabolismo em uma placa de Petri, Heinrich Malling mostrou que a inclusão de uma preparação de fígado de roedor continha muitas das enzimas necessárias para realizar essa conversão ou ativação metabólica. Assim, muitos ensaios de toxicidade genética realizados em placas ou tubos (in vitro) empregam a adição de preparações enzimáticas semelhantes. As preparações simples são chamadas de mistura S9 e as preparações purificadas são chamadas de microssomos. Algumas células bacterianas e de mamíferos já foram geneticamente modificadas para conter alguns dos genes de roedores ou humanos que produzem essas enzimas, reduzindo a necessidade de adicionar mistura S9 ou microssomos.

Ensaios e Técnicas de Toxicologia Genética

Os sistemas bacterianos primários usados ​​para triagem de toxicidade genética são o ensaio de mutagenicidade de Salmonella (Ames) e, em uma extensão muito menor, a cepa WP2 de Escherichia coli. Estudos em meados da década de 1980 indicaram que o uso de apenas duas cepas do sistema Salmonella (TA98 e TA100) eram suficientes para detectar aproximadamente 90% dos mutagênicos conhecidos de Salmonella. Assim, essas duas cepas são usadas para a maioria dos propósitos de triagem; no entanto, várias outras cepas estão disponíveis para testes mais extensos.

Esses ensaios são realizados de várias maneiras, mas dois procedimentos gerais são os ensaios de incorporação em placa e suspensão líquida. No ensaio de incorporação de placa, as células, o produto químico de teste e (quando desejado) o S9 são adicionados juntos em um ágar liquefeito e despejados na superfície de uma placa de Petri de ágar. O ágar superior endurece em alguns minutos e as placas são incubadas por dois a três dias, após o que as células mutantes cresceram para formar aglomerados visualmente detectáveis ​​de células chamadas colônias, que são então contadas. O meio de ágar contém agentes seletivos ou é composto de ingredientes de forma que apenas as células recém-mutadas irão crescer. O ensaio de incubação líquida é semelhante, exceto que as células, agente de teste e S9 são incubados juntos em líquido que não contém ágar liquefeito e, em seguida, as células são lavadas para remover o agente de teste e S9 e semeadas no ágar.

Mutações em células de mamíferos cultivadas são detectadas principalmente em um dos dois genes: hprt e tk. Semelhante aos ensaios bacterianos, as linhagens de células de mamíferos (desenvolvidas a partir de roedores ou células humanas) são expostas ao agente de teste em placas de cultura de plástico ou tubos e, em seguida, são semeadas em placas de cultura que contêm meio com um agente seletivo que permite apenas o crescimento de células mutantes . Os ensaios usados ​​para esse fim incluem o CHO/HPRT, o TK6 e o ​​linfoma de camundongo L5178Y/TK^+/- ensaios. Outras linhas de células contendo várias mutações de reparo de DNA, bem como contendo alguns genes humanos envolvidos no metabolismo também são usadas. Esses sistemas permitem a recuperação de mutações dentro do gene (mutação gênica), bem como mutações envolvendo regiões do cromossomo que flanqueiam o gene (mutação cromossômica). No entanto, este último tipo de mutação é recuperado em muito maior extensão pelo tk sistemas de genes do que pelos hprt sistemas de genes devido à localização do tk desconfortável.

Semelhante ao ensaio de incubação líquida para mutagenicidade bacteriana, os ensaios de mutagenicidade de células de mamíferos geralmente envolvem a exposição das células em placas ou tubos de cultura na presença do agente de teste e S9 por várias horas. As células são então lavadas, cultivadas por mais alguns dias para permitir que os produtos gênicos normais (tipo selvagem) sejam degradados e os produtos gênicos recém-mutados sejam expressos e acumulados, e então eles são semeados em meio contendo um agente seletivo que permite apenas as células mutantes para crescer. Como os ensaios bacterianos, as células mutantes crescem em colônias visualmente detectáveis ​​que são então contadas.

A mutação cromossômica é identificada principalmente por ensaios citogenéticos, que envolvem a exposição de roedores e/ou roedores ou células humanas em placas de cultura a um produto químico de teste, permitindo que uma ou mais divisões celulares ocorram, coloração dos cromossomos e, em seguida, exame visual dos cromossomos através de um microscópio para detectar alterações na estrutura ou no número de cromossomos. Embora uma variedade de parâmetros possa ser examinada, os dois que são atualmente aceitos pelas agências reguladoras como sendo os mais significativos são as aberrações cromossômicas e uma subcategoria chamada micronúcleos.

São necessários treinamento e experiência consideráveis ​​para pontuar as células quanto à presença de aberrações cromossômicas, o que torna esse procedimento caro em termos de tempo e dinheiro. Em contraste, os micronúcleos requerem pouco treinamento e sua detecção pode ser automatizada. Os micronúcleos aparecem como pequenos pontos dentro da célula que são distintos do núcleo, que contém os cromossomos. Os micronúcleos resultam de quebra cromossômica ou de aneuploidia. Devido à facilidade de marcar micronúcleos em comparação com aberrações cromossômicas, e porque estudos recentes indicam que os agentes que induzem aberrações cromossômicas na medula óssea de camundongos vivos geralmente induzem micronúcleos neste tecido, os micronúcleos são agora comumente medidos como uma indicação da capacidade de um agente para induzir mutação cromossômica.

Embora os ensaios de células germinativas sejam usados ​​com muito menos frequência do que os outros ensaios descritos acima, eles são indispensáveis ​​para determinar se um agente representa um risco para as células germinativas, cujas mutações podem levar a efeitos na saúde nas gerações seguintes. Os ensaios de células germinativas mais comumente usados ​​são em camundongos e envolvem sistemas que detectam (1) translocações hereditárias (trocas) entre cromossomos (ensaio de translocação hereditária), (2) genes ou mutações cromossômicas envolvendo genes específicos (visíveis ou bioquímicas de locus específico ensaios) e (3) mutações que afetam a viabilidade (ensaio letal dominante). Tal como acontece com os ensaios de células somáticas, a suposição de trabalho com os ensaios de células germinativas é que os agentes positivos nesses ensaios são presumivelmente mutagênicos em células germinativas humanas.

Situação Atual e Perspectivas Futuras

Estudos recentes indicaram que apenas três informações eram necessárias para detectar aproximadamente 90% de um conjunto de 41 carcinógenos de roedores (ou seja, presumíveis carcinógenos humanos e mutagênicos de células somáticas). Estes incluíram (1) conhecimento da estrutura química do agente, especialmente se ele contiver porções eletrofílicas (consulte a seção sobre relações estrutura-atividade); (2) Dados de mutagenicidade de Salmonella; e (3) dados de um ensaio de toxicidade crônica de 90 dias em roedores (camundongos e ratos). De fato, praticamente todos os carcinógenos humanos declarados pela IARC são detectáveis ​​como mutagênicos usando apenas o ensaio de Salmonella e o ensaio de micronúcleo de medula óssea de camundongo. O uso desses ensaios de mutagenicidade para detectar potenciais carcinógenos humanos é apoiado ainda mais pela constatação de que a maioria dos carcinógenos humanos são carcinógenos em ratos e camundongos (carcinógenos transespécies) e que a maioria dos carcinógenos transespécies são mutagênicos em Salmonella e/ou induzem micronúcleos na medula óssea de camundongos.

Com os avanços na tecnologia do DNA, o projeto do genoma humano e uma melhor compreensão do papel da mutação no câncer, estão sendo desenvolvidos novos ensaios de genotoxicidade que provavelmente serão incorporados aos procedimentos de triagem padrão. Entre eles estão o uso de células transgênicas e roedores. Sistemas transgênicos são aqueles em que um gene de outra espécie foi introduzido em uma célula ou organismo. Por exemplo, já estão em uso experimental camundongos transgênicos que permitem a detecção de mutação em qualquer órgão ou tecido do animal, a partir da introdução de um gene bacteriano no camundongo. Células bacterianas, como Salmonella, e células de mamíferos (incluindo linhagens celulares humanas) já estão disponíveis contendo genes envolvidos no metabolismo de agentes carcinogênicos/mutagênicos, como os genes P450. Análise molecular das mutações reais induzidas no gene trans em roedores transgênicos ou em genes nativos, como hprt, ou os genes-alvo dentro da Salmonella podem agora ser realizados, de modo que a natureza exata das mutações induzidas pelos produtos químicos possa ser determinada, fornecendo informações sobre o mecanismo de ação do produto químico e permitindo comparações com mutações em humanos presumivelmente expostos ao agente .

Avanços moleculares em citogenética agora permitem uma avaliação mais detalhada de mutações cromossômicas. Isso inclui o uso de sondas (pequenos pedaços de DNA) que se ligam (hibridizam) a genes específicos. Rearranjos de genes no cromossomo podem então ser revelados pela localização alterada das sondas, que são fluorescentes e facilmente visualizadas como setores coloridos nos cromossomos. O ensaio de eletroforese em gel de célula única para quebra de DNA (comumente chamado de ensaio “cometa”) permite a detecção de quebras de DNA dentro de células individuais e pode se tornar uma ferramenta extremamente útil em combinação com técnicas citogenéticas para detectar danos cromossômicos.

Após muitos anos de uso e a geração de um banco de dados grande e sistematicamente desenvolvido, a avaliação da toxicidade genética pode agora ser feita com apenas alguns ensaios por um custo relativamente pequeno em um curto período de tempo (algumas semanas). Os dados produzidos podem ser usados ​​para prever a capacidade de um agente ser um roedor e, presumivelmente, carcinógeno humano/mutagênico de células somáticas. Esta capacidade permite limitar a introdução no ambiente de agentes mutagénicos e cancerígenos e desenvolver agentes alternativos não mutagénicos. Estudos futuros devem levar a métodos ainda melhores com maior previsibilidade do que os ensaios atuais.

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A palavra biomarcador é a abreviação de marcador biológico, um termo que se refere a um evento mensurável que ocorre em um sistema biológico, como o corpo humano. Esse evento é então interpretado como um reflexo, ou marcador, de um estado mais geral do organismo ou da expectativa de vida. Na saúde ocupacional, um biomarcador é geralmente usado como um indicador do estado de saúde ou risco de doença.

Os biomarcadores são usados ​​para estudos in vitro e in vivo que podem incluir seres humanos. Normalmente, três tipos específicos de marcadores biológicos são identificados. Embora alguns biomarcadores possam ser difíceis de classificar, geralmente eles são separados em biomarcadores de exposição, biomarcadores de efeito ou biomarcadores de suscetibilidade (ver tabela 1).

Tabela 1. Exemplos de biomarcadores de exposição ou biomarcadores de efeito que são utilizados em estudos toxicológicos em saúde ocupacional

Dado um grau aceitável de validade, os biomarcadores podem ser empregados para diversos fins. Em uma base individual, um biomarcador pode ser usado para apoiar ou refutar um diagnóstico de um determinado tipo de envenenamento ou outro efeito adverso induzido quimicamente. Em um indivíduo saudável, um biomarcador também pode refletir a hipersuscetibilidade individual a exposições químicas específicas e, portanto, servir como base para previsão de risco e aconselhamento. Em grupos de trabalhadores expostos, alguns biomarcadores de exposição podem ser aplicados para avaliar a extensão da conformidade com os regulamentos de redução da poluição ou a eficácia dos esforços preventivos em geral.

Biomarcadores de Exposição

Um biomarcador de exposição pode ser um composto exógeno (ou um metabólito) dentro do corpo, um produto interativo entre o composto (ou metabólito) e um componente endógeno ou outro evento relacionado à exposição. Mais comumente, os biomarcadores de exposições a compostos estáveis, como metais, compreendem medições das concentrações de metais em amostras apropriadas, como sangue, soro ou urina. Com produtos químicos voláteis, sua concentração na respiração exalada (após a inalação de ar livre de contaminação) pode ser avaliada. Se o composto for metabolizado no corpo, um ou mais metabólitos podem ser escolhidos como biomarcadores da exposição; os metabolitos são frequentemente determinados em amostras de urina.

Métodos modernos de análise podem permitir a separação de isômeros ou congêneres de compostos orgânicos e a determinação da especiação de compostos metálicos ou proporções isotópicas de certos elementos. Análises sofisticadas permitem a determinação de mudanças na estrutura do DNA ou outras macromoléculas causadas pela ligação com produtos químicos reativos. Sem dúvida, essas técnicas avançadas ganharão consideravelmente em importância para aplicações em estudos de biomarcadores, e limites de detecção mais baixos e melhor validade analítica provavelmente tornarão esses biomarcadores ainda mais úteis.

Desenvolvimentos particularmente promissores ocorreram com biomarcadores de exposição a produtos químicos mutagênicos. Esses compostos são reativos e podem formar adutos com macromoléculas, como proteínas ou DNA. Adutos de DNA podem ser detectados em glóbulos brancos ou biópsias de tecidos, e fragmentos específicos de DNA podem ser excretados na urina. Por exemplo, a exposição ao óxido de etileno resulta em reações com as bases do DNA e, após a excisão da base danificada, a N-7-(2-hidroxietil)guanina será eliminada na urina. Alguns adutos podem não se referir diretamente a uma exposição específica. Por exemplo, a 8-hidroxi-2'-desoxiguanosina reflete o dano oxidativo ao DNA, e essa reação pode ser desencadeada por vários compostos químicos, muitos dos quais também induzem a peroxidação lipídica.

Outras macromoléculas também podem ser alteradas pela formação de adutos ou oxidação. De especial interesse, tais compostos reativos podem gerar adutos de hemoglobina que podem ser determinados como biomarcadores de exposição aos compostos. A vantagem é que grandes quantidades de hemoglobina podem ser obtidas a partir de uma amostra de sangue e, dada a vida útil de quatro meses das hemácias, os adutos formados com os aminoácidos da proteína indicarão a exposição total nesse período.

Os adutos podem ser determinados por técnicas sensíveis, como cromatografia lipídica de alta eficiência, e alguns métodos imunológicos também estão disponíveis. Em geral, os métodos analíticos são novos, caros e precisam de mais desenvolvimento e validação. Melhor sensibilidade pode ser obtida usando o ³²P pós-ensaio de marcação, que é uma indicação inespecífica de que ocorreu dano ao DNA. Todas essas técnicas são potencialmente úteis para monitoramento biológico e têm sido aplicadas em um número crescente de estudos. No entanto, métodos analíticos mais simples e sensíveis são necessários. Dada a especificidade limitada de alguns métodos em exposições de baixo nível, o tabagismo ou outros fatores podem ter um impacto significativo nos resultados da medição, causando dificuldades de interpretação.

A exposição a compostos mutagênicos, ou a compostos que são metabolizados em mutagênicos, também pode ser determinada pela avaliação da mutagenicidade da urina de um indivíduo exposto. A amostra de urina é incubada com uma cepa de bactéria na qual uma mutação pontual específica é expressa de uma forma que pode ser facilmente medida. Se produtos químicos mutagênicos estiverem presentes na amostra de urina, ocorrerá um aumento na taxa de mutações nas bactérias.

Os biomarcadores de exposição devem ser avaliados em relação à variação temporal da exposição e à relação com os diferentes compartimentos. Assim, o(s) período(s) de tempo representado(s) pelo biomarcador, ou seja, até que ponto a medição do biomarcador reflete a(s) exposição(ões) passada(s) e/ou carga corporal acumulada, deve(m) ser determinado(s) a partir de dados toxicocinéticos para interpretar o resultado. Em particular, o grau em que o biomarcador indica retenção em órgãos-alvo específicos deve ser considerado. Embora as amostras de sangue sejam frequentemente usadas para estudos de biomarcadores, o sangue periférico geralmente não é considerado um compartimento como tal, embora atue como um meio de transporte entre os compartimentos. O grau em que a concentração no sangue reflete os níveis em diferentes órgãos varia amplamente entre diferentes produtos químicos e geralmente também depende da duração da exposição, bem como do tempo desde a exposição.

Às vezes, esse tipo de evidência é usado para classificar um biomarcador como um indicador de dose (total) absorvida ou um indicador de dose efetiva (ou seja, a quantidade que atingiu o tecido-alvo). Por exemplo, a exposição a um determinado solvente pode ser avaliada a partir de dados sobre a concentração real do solvente no sangue em um determinado momento após a exposição. Essa medição refletirá a quantidade de solvente que foi absorvida pelo corpo. Parte da quantidade absorvida será exalada devido à pressão de vapor do solvente. Ao circular no sangue, o solvente interagirá com vários componentes do corpo e, eventualmente, ficará sujeito à degradação por enzimas. O resultado dos processos metabólicos pode ser avaliado pela determinação de ácidos mercaptúricos específicos produzidos por conjugação com glutationa. A excreção cumulativa de ácidos mercaptúricos pode refletir melhor a dose efetiva do que a concentração sanguínea.

Eventos da vida, como reprodução e senescência, podem afetar a distribuição de uma substância química. A distribuição de produtos químicos dentro do corpo é significativamente afetada pela gravidez, e muitos produtos químicos podem atravessar a barreira placentária, causando assim a exposição do feto. A lactação pode resultar na excreção de substâncias químicas lipossolúveis, levando assim a uma diminuição da retenção na mãe, juntamente com uma maior absorção pelo lactente. Durante a perda de peso ou desenvolvimento de osteoporose, produtos químicos armazenados podem ser liberados, o que pode resultar em uma exposição “endógena” renovada e prolongada de órgãos-alvo. Outros fatores podem afetar a absorção individual, metabolismo, retenção e distribuição de compostos químicos, e alguns biomarcadores de suscetibilidade estão disponíveis (ver abaixo).

Biomarcadores de Efeito

Um marcador de efeito pode ser um componente endógeno, ou uma medida da capacidade funcional, ou algum outro indicador do estado ou equilíbrio do corpo ou sistema orgânico, conforme afetado pela exposição. Esses marcadores de efeito são geralmente indicadores pré-clínicos de anormalidades.

Esses biomarcadores podem ser específicos ou inespecíficos. Os biomarcadores específicos são úteis porque indicam um efeito biológico de uma determinada exposição, fornecendo assim evidências que podem ser potencialmente utilizadas para fins preventivos. Os biomarcadores não específicos não apontam para uma causa individual do efeito, mas podem refletir o efeito total e integrado devido a uma exposição mista. Ambos os tipos de biomarcadores podem, portanto, ser de uso considerável na saúde ocupacional.

Não há uma distinção clara entre biomarcadores de exposição e biomarcadores de efeito. Por exemplo, pode-se dizer que a formação do aduto reflete um efeito e não a exposição. No entanto, os biomarcadores de efeito geralmente indicam alterações nas funções das células, tecidos ou do corpo inteiro. Alguns pesquisadores incluem alterações grosseiras, como aumento do peso do fígado de animais de laboratório expostos ou diminuição do crescimento em crianças, como biomarcadores de efeito. Para fins de saúde ocupacional, os biomarcadores de efeito devem ser restritos àqueles que indicam alterações bioquímicas subclínicas ou reversíveis, como inibição de enzimas. O biomarcador de efeito mais utilizado é provavelmente a inibição da colinesterase causada por certos inseticidas, ou seja, organofosforados e carbamatos. Na maioria dos casos, esse efeito é totalmente reversível e a inibição da enzima reflete a exposição total a esse grupo específico de inseticidas.

Algumas exposições não resultam na inibição da enzima, mas sim no aumento da atividade de uma enzima. É o caso de várias enzimas pertencentes à família P450 (ver “Determinantes genéticos da resposta tóxica”). Eles podem ser induzidos por exposições a certos solventes e hidrocarbonetos poliaromáticos (PAHs). Uma vez que essas enzimas são expressas principalmente em tecidos dos quais uma biópsia pode ser difícil de obter, a atividade enzimática é determinada indiretamente in vivo pela administração de um composto que é metabolizado por essa enzima específica e, em seguida, o produto de decomposição é medido na urina ou no plasma.

Outras exposições podem induzir a síntese de uma proteína protetora no organismo. O melhor exemplo é provavelmente a metalotioneína, que se liga ao cádmio e promove a excreção desse metal; a exposição ao cádmio é um dos fatores que resultam no aumento da expressão do gene da metalotioneína. Proteínas protetoras semelhantes podem existir, mas ainda não foram suficientemente exploradas para serem aceitas como biomarcadores. Entre os candidatos a possíveis usos como biomarcadores estão as chamadas proteínas de estresse, originalmente chamadas de proteínas de choque térmico. Essas proteínas são geradas por uma variedade de organismos diferentes em resposta a uma variedade de exposições adversas.

O dano oxidativo pode ser avaliado pela determinação da concentração de malondialdeído no soro ou pela exalação de etano. Da mesma forma, a excreção urinária de proteínas de baixo peso molecular, como a albumina, pode ser utilizada como biomarcador de lesão renal precoce. Vários parâmetros usados ​​rotineiramente na prática clínica (por exemplo, níveis séricos de hormônios ou enzimas) também podem ser úteis como biomarcadores. No entanto, muitos desses parâmetros podem não ser suficientemente sensíveis para detectar comprometimento precoce.

Outro grupo de parâmetros de efeito refere-se aos efeitos genotóxicos (alterações na estrutura dos cromossomos). Tais efeitos podem ser detectados por microscopia de glóbulos brancos que sofrem divisão celular. Danos sérios aos cromossomos – aberrações cromossômicas ou formação de micronúcleos – podem ser vistos em um microscópio. Os danos também podem ser revelados pela adição de um corante às células durante a divisão celular. A exposição a um agente genotóxico pode então ser visualizada como uma troca aumentada do corante entre as duas cromátides de cada cromossomo (troca de cromátides-irmãs). As aberrações cromossômicas estão relacionadas a um risco aumentado de desenvolver câncer, mas o significado de uma taxa aumentada de troca de cromátides-irmãs é menos claro.

Uma avaliação mais sofisticada da genotoxicidade é baseada em mutações pontuais específicas em células somáticas, isto é, glóbulos brancos ou células epiteliais obtidas da mucosa oral. Uma mutação em um locus específico pode tornar as células capazes de crescer em uma cultura que contém uma substância química tóxica (como a 6-tioguanina). Alternativamente, um produto gênico específico pode ser avaliado (por exemplo, concentrações séricas ou teciduais de oncoproteínas codificadas por oncogenes específicos). Obviamente, essas mutações refletem o dano genotóxico total incorrido e não necessariamente indicam nada sobre a exposição causadora. Esses métodos ainda não estão prontos para uso prático em saúde ocupacional, mas o rápido progresso nessa linha de pesquisa sugere que tais métodos estarão disponíveis dentro de alguns anos.

Biomarcadores de Suscetibilidade

Um marcador de suscetibilidade, herdada ou induzida, é um indicador de que o indivíduo é particularmente sensível ao efeito de um xenobiótico ou aos efeitos de um grupo desses compostos. A maior parte da atenção tem sido focada na suscetibilidade genética, embora outros fatores possam ser pelo menos tão importantes. A hipersuscetibilidade pode ser devida a uma característica hereditária, à constituição do indivíduo ou a fatores ambientais.

A capacidade de metabolizar certos produtos químicos é variável e é determinada geneticamente (consulte “Determinantes genéticos da resposta tóxica”). Várias enzimas relevantes parecem ser controladas por um único gene. Por exemplo, a oxidação de produtos químicos estranhos é realizada principalmente por uma família de enzimas pertencentes à família P450. Outras enzimas tornam os metabólitos mais solúveis em água por conjugação (por exemplo, N-acetiltransferase e μ-glutationa).S-transferase). A atividade dessas enzimas é controlada geneticamente e varia consideravelmente. Conforme mencionado acima, a atividade pode ser determinada pela administração de uma pequena dose de um medicamento e, em seguida, pela determinação da quantidade do metabólito na urina. Alguns dos genes já foram caracterizados e as técnicas estão disponíveis para determinar o genótipo. Estudos importantes sugerem que o risco de desenvolver certas formas de câncer está relacionado à capacidade de metabolizar compostos estranhos. Muitas questões ainda permanecem sem resposta, limitando, neste momento, o uso desses potenciais biomarcadores de suscetibilidade na saúde ocupacional.

Outros traços herdados, como alfa₁-deficiência de antitripsina ou deficiência de glicose-6-fosfato desidrogenase, também resultam em mecanismos de defesa deficientes no corpo, causando hipersuscetibilidade a certas exposições.

A maioria das pesquisas relacionadas à suscetibilidade tratou da predisposição genética. Outros fatores também desempenham um papel e foram parcialmente negligenciados. Por exemplo, indivíduos com uma doença crônica podem ser mais sensíveis a uma exposição ocupacional. Além disso, se um processo de doença ou exposição anterior a substâncias químicas tóxicas causou algum dano subclínico de órgão, é provável que a capacidade de resistir a uma nova exposição tóxica seja menor. Os indicadores bioquímicos da função do órgão podem, neste caso, ser usados ​​como biomarcadores de suscetibilidade. Talvez o melhor exemplo em relação à hipersuscetibilidade esteja relacionado às respostas alérgicas. Se um indivíduo se tornou sensível a uma exposição específica, anticorpos específicos podem ser detectados no soro. Mesmo que o indivíduo não tenha se tornado sensibilizado, outras exposições atuais ou passadas podem aumentar o risco de desenvolver um efeito adverso relacionado a uma exposição ocupacional.

Um grande problema é determinar o efeito conjunto de exposições mistas no trabalho. Além disso, hábitos pessoais e uso de drogas podem resultar em maior suscetibilidade. Por exemplo, a fumaça do tabaco geralmente contém uma quantidade considerável de cádmio. Assim, com a exposição ocupacional ao cádmio, um fumante inveterado que acumulou quantidades substanciais desse metal no corpo terá maior risco de desenvolver doença renal relacionada ao cádmio.

Aplicação em Saúde Ocupacional

Os biomarcadores são extremamente úteis na pesquisa toxicológica e muitos podem ser aplicáveis ​​no monitoramento biológico. No entanto, as limitações também devem ser reconhecidas. Muitos biomarcadores até agora foram estudados apenas em animais de laboratório. Os padrões toxicocinéticos em outras espécies podem não refletir necessariamente a situação em seres humanos, e a extrapolação pode exigir estudos confirmatórios em voluntários humanos. Além disso, deve-se levar em consideração as variações individuais devido a fatores genéticos ou constitucionais.

Em alguns casos, os biomarcadores de exposição podem não ser viáveis ​​(por exemplo, para produtos químicos de vida curta in vivo). Outros produtos químicos podem ser armazenados ou afetar órgãos que não podem ser acessados ​​por procedimentos de rotina, como o sistema nervoso. A via de exposição também pode afetar o padrão de distribuição e, portanto, também a medição do biomarcador e sua interpretação. Por exemplo, a exposição direta do cérebro através do nervo olfativo provavelmente escapará da detecção pela medição dos biomarcadores de exposição. Quanto aos biomarcadores de efeito, muitos deles não são nada específicos, e a alteração pode ser devida a uma variedade de causas, incluindo fatores de estilo de vida. Talvez em particular com os biomarcadores de suscetibilidade, a interpretação deva ser muito cautelosa no momento, pois muitas incertezas permanecem sobre o significado geral de saúde de genótipos individuais.

Na saúde ocupacional, o biomarcador ideal deve atender a vários requisitos. Em primeiro lugar, a coleta e análise de amostras devem ser simples e confiáveis. Para uma qualidade analítica ideal, a padronização é necessária, mas os requisitos específicos variam consideravelmente. As principais áreas de preocupação incluem: preparação do indivíduo, procedimento de amostragem e manuseio da amostra e procedimento de medição; o último abrange fatores técnicos, como calibração e procedimentos de garantia de qualidade, e fatores relacionados ao indivíduo, como educação e treinamento de operadores.

Para documentação de validade analítica e rastreabilidade, os materiais de referência devem ser baseados em matrizes relevantes e com concentrações apropriadas de substâncias tóxicas ou metabólitos relevantes em níveis apropriados. Para que os biomarcadores sejam usados ​​para monitoramento biológico ou para fins diagnósticos, os laboratórios responsáveis ​​devem ter procedimentos analíticos bem documentados com características de desempenho definidas e registros acessíveis para permitir a verificação dos resultados. Ao mesmo tempo, no entanto, a economia de caracterizar e usar materiais de referência para complementar os procedimentos de garantia de qualidade em geral deve ser considerada. Assim, a qualidade alcançável dos resultados e os usos a que eles são destinados devem ser equilibrados com os custos adicionais de garantia de qualidade, incluindo materiais de referência, mão de obra e instrumentação.

Outra exigência é que o biomarcador seja específico, pelo menos nas circunstâncias do estudo, para um determinado tipo de exposição, com uma relação clara com o grau de exposição. Caso contrário, o resultado da medição do biomarcador pode ser muito difícil de interpretar. Para uma interpretação adequada do resultado da medição de um biomarcador de exposição, a validade diagnóstica deve ser conhecida (ou seja, a tradução do valor do biomarcador na magnitude de possíveis riscos à saúde). Nesta área, os metais servem de paradigma para a pesquisa de biomarcadores. Pesquisas recentes demonstraram a complexidade e sutileza das relações dose-resposta, com dificuldade considerável em identificar níveis sem efeito e, portanto, também em definir exposições toleráveis. No entanto, esse tipo de pesquisa também ilustrou os tipos de investigação e o refinamento necessários para descobrir as informações relevantes. Para a maioria dos compostos orgânicos, ainda não estão disponíveis associações quantitativas entre as exposições e os correspondentes efeitos adversos à saúde; em muitos casos, mesmo os órgãos-alvo primários não são conhecidos com certeza. Além disso, a avaliação dos dados de toxicidade e concentrações de biomarcadores é muitas vezes complicada pela exposição a misturas de substâncias, em vez da exposição a um único composto no momento.

Antes que o biomarcador seja aplicado para fins de saúde ocupacional, algumas considerações adicionais são necessárias. Primeiro, o biomarcador deve refletir apenas uma alteração subclínica e reversível. Em segundo lugar, dado que os resultados dos biomarcadores podem ser interpretados em relação aos riscos à saúde, esforços preventivos devem estar disponíveis e devem ser considerados realistas caso os dados dos biomarcadores sugiram a necessidade de reduzir a exposição. Em terceiro lugar, o uso prático do biomarcador deve ser geralmente considerado eticamente aceitável.

As medições de higiene industrial podem ser comparadas com os limites de exposição aplicáveis. Da mesma forma, os resultados em biomarcadores de exposição ou biomarcadores de efeito podem ser comparados aos limites de ação biológica, às vezes referidos como índices de exposição biológica. Esses limites devem ser baseados no melhor conselho de médicos e cientistas de disciplinas apropriadas, e os administradores responsáveis ​​como “gerentes de risco” devem levar em consideração os fatores éticos, sociais, culturais e econômicos relevantes. A base científica deve, se possível, incluir relações dose-resposta complementadas por informações sobre variações na suscetibilidade dentro da população em risco. Em alguns países, trabalhadores e membros do público em geral estão envolvidos no processo de estabelecimento de padrões e fornecem contribuições importantes, especialmente quando a incerteza científica é considerável. Uma das maiores incertezas é como definir um efeito adverso à saúde que deve ser evitado - por exemplo, se a formação de aduto como um biomarcador de exposição por si só representa um efeito adverso (ou seja, biomarcador de efeito) que deve ser evitado. É provável que surjam questões difíceis ao decidir se é eticamente defensável, para o mesmo composto, ter limites diferentes para exposição acidental, por um lado, e exposição ocupacional, por outro.

As informações geradas pelo uso de biomarcadores geralmente devem ser transmitidas aos indivíduos examinados na relação médico-paciente. As preocupações éticas devem ser consideradas em particular em relação a análises de biomarcadores altamente experimentais que atualmente não podem ser interpretadas em detalhes em termos de riscos reais à saúde. Para a população em geral, por exemplo, existe orientação limitada no momento com relação à interpretação de biomarcadores de exposição além da concentração de chumbo no sangue. Também é importante a confiança nos dados gerados (ou seja, se a amostragem apropriada foi realizada e se procedimentos sólidos de garantia de qualidade foram utilizados no laboratório envolvido). Uma área adicional de preocupação especial está relacionada à hipersuscetibilidade individual. Essas questões devem ser levadas em consideração ao fornecer o feedback do estudo.

Todos os setores da sociedade afetados ou preocupados com a realização de um estudo de biomarcadores precisam ser envolvidos no processo de tomada de decisão sobre como lidar com as informações geradas pelo estudo. Procedimentos específicos para prevenir ou superar conflitos éticos inevitáveis ​​devem ser desenvolvidos dentro dos marcos legais e sociais da região ou país. No entanto, cada situação representa um conjunto diferente de questões e armadilhas, e nenhum procedimento único para envolvimento do público pode ser desenvolvido para cobrir todas as aplicações de biomarcadores de exposição.

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O estudo e caracterização de produtos químicos e outros agentes para propriedades tóxicas é frequentemente realizado com base em órgãos e sistemas de órgãos específicos. Neste capítulo, dois alvos foram selecionados para uma discussão aprofundada: o sistema imunológico e o gene. Esses exemplos foram escolhidos para representar um sistema de órgão alvo complexo e um alvo molecular dentro das células. Para uma discussão mais abrangente da toxicologia dos órgãos-alvo, o leitor deve consultar os textos de toxicologia padrão, como Casarett e Doull e Hayes. O Programa Internacional de Segurança Química (IPCS) também publicou vários documentos de critérios sobre toxicologia de órgãos-alvo, por sistema de órgãos.

Os estudos de toxicologia de órgãos-alvo são geralmente realizados com base em informações que indicam o potencial de efeitos tóxicos específicos de uma substância, seja de dados epidemiológicos ou de estudos gerais de toxicidade aguda ou crônica, ou com base em preocupações especiais para proteger certas funções de órgãos, como como reprodução ou desenvolvimento fetal. Em alguns casos, testes específicos de toxicidade de órgãos-alvo são expressamente exigidos por autoridades estatutárias, como testes de neurotoxicidade sob a lei de pesticidas dos EUA (consulte “A abordagem dos Estados Unidos para avaliação de risco de tóxicos reprodutivos e agentes neurotóxicos” e testes de mutagenicidade sob a Norma Japonesa de Produtos Químicos). Lei de Controle de Substâncias (consulte “Princípios de identificação de perigos: A abordagem japonesa”).

Conforme discutido em “órgão-alvo e efeitos críticos”, a identificação de um órgão crítico é baseada na detecção do órgão ou sistema de órgãos que primeiro responde adversamente ou às doses ou exposições mais baixas. Esta informação é então usada para projetar investigações toxicológicas específicas ou testes de toxicidade mais definidos que são projetados para obter indicações mais sensíveis de intoxicação no órgão-alvo. Estudos de toxicologia de órgãos-alvo também podem ser usados ​​para determinar mecanismos de ação, de uso na avaliação de risco (consulte “A abordagem dos Estados Unidos para avaliação de risco de tóxicos reprodutivos e agentes neurotóxicos”).

Métodos de estudos de toxicidade de órgãos-alvo

Os órgãos-alvo podem ser estudados pela exposição de organismos intactos e análise detalhada da função e histopatologia no órgão-alvo, ou pela exposição in vitro de células, fatias de tecido ou órgãos inteiros mantidos por períodos curtos ou longos em cultura (consulte “Mecanismos de toxicologia: Introdução e conceitos”). Em alguns casos, tecidos de seres humanos também podem estar disponíveis para estudos de toxicidade de órgãos-alvo, e isso pode fornecer oportunidades para validar suposições de extrapolação entre espécies. No entanto, deve-se ter em mente que tais estudos não fornecem informações sobre a toxicocinética relativa.

Em geral, os estudos de toxicidade de órgãos-alvo compartilham as seguintes características comuns: exame histopatológico detalhado do órgão-alvo, incluindo exame post mortem, peso do tecido e exame de tecidos fixados; estudos bioquímicos de vias críticas no órgão-alvo, como sistemas enzimáticos importantes; estudos funcionais da capacidade do órgão e constituintes celulares para realizar funções metabólicas esperadas e outras; e análise de biomarcadores de exposição e efeitos precoces em células de órgãos-alvo.

O conhecimento detalhado da fisiologia, bioquímica e biologia molecular dos órgãos-alvo pode ser incorporado aos estudos dos órgãos-alvo. Por exemplo, como a síntese e secreção de proteínas de baixo peso molecular é um aspecto importante da função renal, os estudos de nefrotoxicidade geralmente incluem atenção especial a esses parâmetros (IPCS 1991). Como a comunicação célula a célula é um processo fundamental da função do sistema nervoso, os estudos de órgãos-alvo na neurotoxicidade podem incluir medições neuroquímicas e biofísicas detalhadas da síntese, captação, armazenamento, liberação e ligação do receptor de neurotransmissores, bem como medições eletrofisiológicas de alterações na membrana potencial associado a esses eventos.

Um alto grau de ênfase está sendo colocado no desenvolvimento de métodos in vitro para toxicidade de órgãos-alvo, para substituir ou reduzir o uso de animais inteiros. Avanços substanciais nesses métodos foram alcançados para tóxicos reprodutivos (Heindel e Chapin 1993).

Em resumo, os estudos de toxicidade de órgãos-alvo são geralmente realizados como um teste de ordem superior para determinar a toxicidade. A seleção de órgãos-alvo específicos para avaliação posterior depende dos resultados dos testes de nível de triagem, como os testes agudos ou subcrônicos usados ​​pela OCDE e pela União Européia; alguns órgãos-alvo e sistemas de órgãos podem ser candidatos a priori para investigação especial devido a preocupações de prevenir certos tipos de efeitos adversos à saúde.

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As funções do sistema imunológico são proteger o corpo de agentes infecciosos invasores e fornecer vigilância imunológica contra o surgimento de células tumorais. Possui uma primeira linha de defesa inespecífica e que pode iniciar ela própria as reações efetoras, e um ramo específico adquirido, no qual linfócitos e anticorpos carregam a especificidade de reconhecimento e posterior reatividade ao antígeno.

A imunotoxicologia foi definida como “a disciplina preocupada com o estudo dos eventos que podem levar a efeitos indesejados como resultado da interação de xenobióticos com o sistema imunológico. Esses eventos indesejados podem resultar como consequência de (1) um efeito direto e/ou indireto do xenobiótico (e/ou seu produto de biotransformação) no sistema imunológico, ou (2) uma resposta imunológica do hospedeiro ao composto e/ou seu(s) metabólito(s) ou antígenos do hospedeiro modificados pelo composto ou seus metabólitos” (Berlin et al. 1987).

Quando o sistema imunológico atua como um alvo passivo de insultos químicos, o resultado pode ser uma diminuição da resistência a infecções e certas formas de neoplasia, ou desregulação/estimulação imunológica que pode exacerbar alergia ou autoimunidade. No caso de o sistema imunológico responder à especificidade antigênica do xenobiótico ou do antígeno do hospedeiro modificado pelo composto, a toxicidade pode se manifestar como alergias ou doenças autoimunes.

Modelos animais para investigar a supressão imunológica induzida por produtos químicos foram desenvolvidos e vários desses métodos são validados (Burleson, Munson e Dean 1995; IPCS 1996). Para fins de teste, uma abordagem em camadas é seguida para fazer uma seleção adequada do grande número de ensaios disponíveis. Geralmente, o objetivo do primeiro nível é identificar potenciais imunotóxicos. Se for identificada potencial imunotoxicidade, uma segunda fase de testes é realizada para confirmar e caracterizar melhor as alterações observadas. As investigações de terceiro nível incluem estudos especiais sobre o mecanismo de ação do composto. Vários xenobióticos foram identificados como imunotóxicos causando imunossupressão em tais estudos com animais de laboratório.

O banco de dados sobre distúrbios da função imune em humanos por produtos químicos ambientais é limitado (Descotes 1986; NRC Subcommittee on Immunotoxicology 1992). O uso de marcadores de imunotoxicidade tem recebido pouca atenção em estudos clínicos e epidemiológicos para investigar o efeito desses produtos químicos na saúde humana. Esses estudos não têm sido realizados com frequência e sua interpretação muitas vezes não permite conclusões inequívocas, devido, por exemplo, à natureza descontrolada da exposição. Portanto, atualmente, a avaliação da imunotoxicidade em roedores, com posterior extrapolação para o homem, forma a base das decisões sobre perigo e risco.

As reações de hipersensibilidade, principalmente asma alérgica e dermatite de contato, são importantes problemas de saúde ocupacional nos países industrializados (Vos, Younes e Smith, 1995). O fenômeno da sensibilização de contato foi investigado primeiro na cobaia (Andersen e Maibach 1985). Até recentemente, esta tem sido a espécie de escolha para testes preditivos. Muitos métodos de teste de cobaia estão disponíveis, sendo os mais freqüentemente empregados o teste de maximização de cobaia e o teste de remendo ocluído de Buehler. Testes de cobaias e abordagens mais recentes desenvolvidas em camundongos, como testes de inchaço da orelha e o ensaio de linfonodo local, fornecem ao toxicologista as ferramentas para avaliar o risco de sensibilização da pele. A situação com relação à sensibilização do trato respiratório é muito diferente. Ainda não existem métodos bem validados ou amplamente aceitos disponíveis para a identificação de alérgenos respiratórios químicos, embora tenha havido progresso no desenvolvimento de modelos animais para a investigação de alergia respiratória química em cobaias e camundongos.

Dados humanos mostram que agentes químicos, em particular drogas, podem causar doenças autoimunes (Kammüller, Bloksma e Seinen 1989). Existem vários modelos animais experimentais de doenças autoimunes humanas. Tal compreende tanto patologia espontânea (por exemplo lúpus eritematoso sistêmico em camundongos New Zealand Black) quanto fenômenos autoimunes induzidos por imunização experimental com um autoantígeno de reação cruzada (por exemplo, artrite induzida pelo adjuvante H37Ra em ratos da linhagem Lewis). Esses modelos são aplicados na avaliação pré-clínica de drogas imunossupressoras. Muito poucos estudos abordaram o potencial desses modelos para avaliar se um xenobiótico exacerba a autoimunidade induzida ou congênita. Modelos animais adequados para investigar a capacidade de substâncias químicas de induzir doenças autoimunes praticamente não existem. Um modelo que é usado de forma limitada é o ensaio do linfonodo poplíteo em camundongos. Como a situação em humanos, fatores genéticos desempenham um papel crucial no desenvolvimento de doença autoimune (DA) em animais de laboratório, o que limitará o valor preditivo de tais testes.

O sistema imunológico

A principal função do sistema imunológico é a defesa contra bactérias, vírus, parasitas, fungos e células neoplásicas. Isso é alcançado pelas ações de vários tipos de células e seus mediadores solúveis em um concerto afinado. A defesa do hospedeiro pode ser dividida em resistência inespecífica ou inata e imunidade específica ou adquirida mediada por linfócitos (Roitt, Brostoff e Male 1989).

Componentes do sistema imunológico estão presentes em todo o corpo (Jones et al. 1990). O compartimento de linfócitos é encontrado dentro dos órgãos linfóides (figura 1). A medula óssea e o timo são classificados como órgãos linfoides primários ou centrais; os órgãos linfóides secundários ou periféricos incluem linfonodos, baço e tecido linfóide ao longo de superfícies secretoras, como os tratos gastrointestinal e respiratório, o chamado tecido linfóide associado à mucosa (MALT). Cerca de metade dos linfócitos do corpo estão localizados a qualquer momento no MALT. Além disso, a pele é um órgão importante para a indução de respostas imunes aos antígenos presentes na pele. Importantes neste processo são as células de Langerhans epidérmicas que possuem uma função de apresentação de antígenos.

Figura 1. Órgãos e tecidos linfoides primários e secundários

Células fagocíticas da linhagem de monócitos/macrófagos, denominadas sistema mononuclear fagocitário (MPS), ocorrem em órgãos linfóides e também em locais extranodais; os fagócitos extranodais incluem células de Kupffer no fígado, macrófagos alveolares no pulmão, macrófagos mesangiais no rim e células gliais no cérebro. Os leucócitos polimorfonucleares (PMNs) estão presentes principalmente no sangue e na medula óssea, mas se acumulam nos locais de inflamação.

Defesa não específica

Uma primeira linha de defesa aos microrganismos é executada por uma barreira física e química, como a pele, o trato respiratório e o trato alimentar. Essa barreira é auxiliada por mecanismos de proteção não específicos, incluindo células fagocíticas, como macrófagos e leucócitos polimorfonucleares, que são capazes de matar patógenos, e células assassinas naturais, que podem lisar células tumorais e células infectadas por vírus. O sistema complemento e certos inibidores microbianos (por exemplo, lisozima) também participam da resposta inespecífica.

Imunidade específica

Após o contato inicial do hospedeiro com o patógeno, respostas imunes específicas são induzidas. A marca desta segunda linha de defesa é o reconhecimento específico de determinantes, chamados de antígenos ou epítopos, dos patógenos por receptores na superfície celular de linfócitos B e T. Após a interação com o antígeno específico, a célula portadora do receptor é estimulada a sofrer proliferação e diferenciação, produzindo um clone de células descendentes que são específicas para o antígeno desencadeante. As respostas imunes específicas auxiliam na defesa inespecífica apresentada aos patógenos, estimulando a eficácia das respostas inespecíficas. Uma característica fundamental da imunidade específica é que a memória se desenvolve. O contato secundário com o mesmo antígeno provoca uma resposta mais rápida e vigorosa, mas bem regulada.

O genoma não tem a capacidade de carregar os códigos de uma matriz de receptores de antígenos suficiente para reconhecer o número de antígenos que podem ser encontrados. O repertório de especificidade se desenvolve por um processo de rearranjos de genes. Este é um processo aleatório, durante o qual várias especificidades são trazidas. Isso inclui especificidades para autocomponentes, que são indesejáveis. Um processo de seleção que ocorre no timo (células T) ou na medula óssea (células B) opera para eliminar essas especificidades indesejáveis.

A função efetora imune normal e a regulação homeostática da resposta imune dependem de uma variedade de produtos solúveis, conhecidos coletivamente como citocinas, que são sintetizados e secretados por linfócitos e por outros tipos de células. As citocinas têm efeitos pleiotrópicos nas respostas imune e inflamatória. A cooperação entre diferentes populações de células é necessária para a resposta imune – a regulação das respostas de anticorpos, o acúmulo de células e moléculas imunes em locais inflamatórios, o início de respostas de fase aguda, o controle da função citotóxica de macrófagos e muitos outros processos centrais para a resistência do hospedeiro . Estes são influenciados e, em muitos casos, dependem de citocinas agindo individualmente ou em conjunto.

Dois braços de imunidade específica são reconhecidos - imunidade humoral e mediada por células ou imunidade celular:

imunidade humoral. No braço humoral, os linfócitos B são estimulados após o reconhecimento do antígeno pelos receptores da superfície celular. Os receptores de antígenos nos linfócitos B são imunoglobulinas (Ig). Células B maduras (células plasmáticas) iniciam a produção de imunoglobulinas específicas do antígeno que atuam como anticorpos no soro ou ao longo das superfícies mucosas. Existem cinco classes principais de imunoglobulinas: (1) IgM, Ig pentamérica com ótima capacidade aglutinante, que é produzida pela primeira vez após estimulação antigênica; (2) IgG, a principal Ig em circulação, que pode atravessar a placenta; (3) IgA, Ig secretora para proteção de superfícies mucosas; (4) IgE, fixação de Ig a mastócitos ou granulócitos basofílicos envolvidos em reações de hipersensibilidade imediata e (5) IgD, cuja principal função é como receptora em linfócitos B.

Imunidade mediada por células. O braço celular do sistema imunológico específico é mediado por linfócitos T. Essas células também possuem receptores de antígenos em suas membranas. Eles reconhecem antígenos se apresentados por células apresentadoras de antígenos no contexto de antígenos de histocompatibilidade. Portanto, essas células têm uma restrição além da especificidade do antígeno. As células T funcionam como células auxiliares para várias respostas imunes (incluindo humorais), mediam o recrutamento de células inflamatórias e podem, como células T citotóxicas, matar células-alvo após o reconhecimento específico do antígeno.

Mecanismos de Imunotoxicidade

Imunossupressão

A resistência efetiva do hospedeiro depende da integridade funcional do sistema imunológico, que por sua vez requer que as células e moléculas componentes que orquestram as respostas imunes estejam disponíveis em número suficiente e de forma operacional. As imunodeficiências congênitas em humanos são frequentemente caracterizadas por defeitos em certas linhagens de células-tronco, resultando em produção prejudicada ou ausente de células imunes. Por analogia com doenças de imunodeficiência humana congênita e adquirida, a imunossupressão induzida por produtos químicos pode resultar simplesmente de um número reduzido de células funcionais (IPCS 1996). A ausência ou número reduzido de linfócitos pode ter efeitos mais ou menos profundos no estado imunológico. Alguns estados de imunodeficiência e imunossupressão grave, como podem ocorrer em transplantes ou terapia citostática, têm sido associados em particular ao aumento da incidência de infecções oportunistas e de certas doenças neoplásicas. As infecções podem ser bacterianas, virais, fúngicas ou protozoárias, e o tipo de infecção predominante depende da imunodeficiência associada. Pode-se esperar que a exposição a produtos químicos ambientais imunossupressores resulte em formas mais sutis de imunossupressão, que podem ser difíceis de detectar. Estes podem levar, por exemplo, a um aumento da incidência de infecções como gripe ou resfriado comum.

Tendo em vista a complexidade do sistema imunológico, com a grande variedade de células, mediadores e funções que formam uma rede complicada e interativa, os compostos imunotóxicos têm inúmeras oportunidades de exercer um efeito. Embora a natureza das lesões iniciais induzidas por muitos produtos químicos imunotóxicos ainda não tenha sido elucidada, há cada vez mais informações disponíveis, principalmente derivadas de estudos em animais de laboratório, sobre as alterações imunobiológicas que resultam na depressão da função imune (Dean et al. 1994). . Podem ocorrer efeitos tóxicos nas seguintes funções críticas (e são dados alguns exemplos de compostos imunotóxicos que afetam essas funções):

•  desenvolvimento e expansão de diferentes populações de células-tronco (o benzeno exerce efeitos imunotóxicos no nível das células-tronco, causando linfocitopenia)
•  proliferação de várias células linfóides e mielóides, bem como tecidos de suporte nos quais essas células amadurecem e funcionam (compostos de organoestanho imunotóxicos suprimem a atividade proliferativa de linfócitos no córtex tímico através de citotoxicidade direta; a ação timotóxica de 2,3,7,8-tetracloro -dibenzo-p-dioxina (TCDD) e compostos relacionados é provavelmente devido a uma função prejudicada das células epiteliais do timo, em vez de toxicidade direta para os timócitos)
•  captação, processamento e apresentação do antígeno pelos macrófagos e outras células apresentadoras de antígenos (um dos alvos do 7,12-dimetilbenz(a)antraceno (DMBA) e do chumbo é a apresentação do antígeno pelos macrófagos; um alvo da radiação ultravioleta é o antígeno- apresentando células de Langerhans)
•  função reguladora das células T-helper e T-supressoras (a função das células T-helper é prejudicada por organoestanhos, aldicarb, bifenilos policlorados (PCBs), TCDD e DMBA; a função das células T-supressoras é reduzida pelo tratamento com baixa dose de ciclofosfamida)
•  produção de várias citocinas ou interleucinas (benzo(a)pireno (BP) suprime a produção de interleucina-1; a radiação ultravioleta altera a produção de citocinas pelos queratinócitos)
•  a síntese de várias classes de imunoglobulinas IgM e IgG é suprimida após o tratamento com PCB e óxido de tributilestanho (TBT) e aumentada após a exposição ao hexaclorobenzeno (HCB).
•  regulação e ativação do complemento (afetada pelo TCDD)
•  função das células T citotóxicas (3-metilcolantreno (3-MC), DMBA e TCDD suprimem a atividade das células T citotóxicas)
•  função das células assassinas naturais (NK) (a atividade NK pulmonar é suprimida pelo ozônio; a atividade NK esplênica é prejudicada pelo níquel)
•  quimiotaxia de macrófagos e leucócitos polimorfonucleares e funções citotóxicas (o ozônio e o dióxido de nitrogênio prejudicam a atividade fagocítica dos macrófagos alveolares).

Alergia

Alergia pode ser definido como os efeitos adversos à saúde que resultam da indução e eliciação de respostas imunes específicas. Quando ocorrem reações de hipersensibilidade sem envolvimento do sistema imunológico, o termo pseudo-alergia é usado. No contexto da imunotoxicologia, a alergia resulta de uma resposta imune específica a produtos químicos e medicamentos de interesse. A capacidade de um produto químico para sensibilizar os indivíduos está geralmente relacionada com a sua capacidade de se ligar covalentemente às proteínas do corpo. As reações alérgicas podem assumir uma variedade de formas e diferem em relação aos mecanismos imunológicos subjacentes e à velocidade da reação. Quatro tipos principais de reações alérgicas foram reconhecidos: Reações de hipersensibilidade do tipo I, que são efetuadas pelo anticorpo IgE e onde os sintomas se manifestam dentro de minutos após a exposição do indivíduo sensibilizado. As reações de hipersensibilidade do tipo II resultam do dano ou destruição das células hospedeiras por anticorpos. Neste caso, os sintomas tornam-se aparentes dentro de horas. As reações de hipersensibilidade tipo III, ou Arthus, também são mediadas por anticorpos, mas contra antígenos solúveis, e resultam da ação local ou sistêmica de imunocomplexos. Tipo IV, ou hipersensibilidade do tipo retardado, as reações são efetuadas por linfócitos T e normalmente os sintomas se desenvolvem 24 a 48 horas após a exposição do indivíduo sensibilizado.

Os dois tipos de alergia química de maior relevância para a saúde ocupacional são a sensibilidade de contato ou alergia cutânea e a alergia do trato respiratório.

Hipersensibilidade de contato. Um grande número de produtos químicos é capaz de causar sensibilização da pele. Após a exposição tópica de um indivíduo suscetível a um alérgeno químico, uma resposta de linfócitos T é induzida nos gânglios linfáticos de drenagem. Na pele, o alérgeno interage direta ou indiretamente com as células de Langerhans epidérmicas, que transportam o produto químico para os gânglios linfáticos e o apresentam de forma imunogênica aos linfócitos T responsivos. Os linfócitos T ativados por alérgenos proliferam, resultando em expansão clonal. O indivíduo agora está sensibilizado e responderá a uma segunda exposição dérmica ao mesmo produto químico com uma resposta imune mais agressiva, resultando em dermatite alérgica de contato. A reação inflamatória cutânea que caracteriza a dermatite alérgica de contato é secundária ao reconhecimento do alérgeno na pele por linfócitos T específicos. Esses linfócitos tornam-se ativados, liberam citocinas e causam o acúmulo local de outros leucócitos mononucleares. Os sintomas se desenvolvem cerca de 24 a 48 horas após a exposição do indivíduo sensibilizado e, portanto, a dermatite alérgica de contato representa uma forma de hipersensibilidade do tipo retardado. Causas comuns de dermatite alérgica de contato incluem produtos químicos orgânicos (como 2,4-dinitroclorobenzeno), metais (como níquel e cromo) e produtos vegetais (como urushiol da hera venenosa).

Hipersensibilidade respiratória. A hipersensibilidade respiratória é geralmente considerada uma reação de hipersensibilidade do Tipo I. No entanto, as reações de fase tardia e os sintomas mais crônicos associados à asma podem envolver processos imunológicos mediados por células (Tipo IV). Os sintomas agudos associados à alergia respiratória são efetuados pelo anticorpo IgE, cuja produção é provocada após a exposição do indivíduo suscetível ao alérgeno químico indutor. O anticorpo IgE distribui-se sistemicamente e liga-se, via receptores de membrana, a mastócitos que se encontram em tecidos vascularizados, incluindo o trato respiratório. Após a inalação do mesmo produto químico, ocorrerá uma reação de hipersensibilidade respiratória. O alérgeno associa-se à proteína e liga-se e faz ligações cruzadas com o anticorpo IgE ligado aos mastócitos. Isso, por sua vez, causa a degranulação dos mastócitos e a liberação de mediadores inflamatórios, como histamina e leucotrienos. Tais mediadores causam broncoconstrição e vasodilatação, resultando em sintomas de alergia respiratória; asma e/ou rinite. Os produtos químicos conhecidos por causar hipersensibilidade respiratória no homem incluem anidridos ácidos (como anidrido trimelítico), alguns diisocianatos (como diisocianato de tolueno), sais de platina e alguns corantes reativos. Além disso, a exposição crônica ao berílio é conhecida por causar doença pulmonar de hipersensibilidade.

Autoimunidade

Autoimunidade pode ser definida como a estimulação de respostas imunes específicas dirigidas contra antígenos “próprios” endógenos. A autoimunidade induzida pode resultar de alterações no equilíbrio dos linfócitos T reguladores ou da associação de um xenobiótico com componentes normais do tecido, de modo a torná-los imunogênicos (“altered self”). Drogas e produtos químicos conhecidos por induzir ou exacerbar acidentalmente efeitos como os da doença autoimune (AD) em indivíduos suscetíveis são compostos de baixo peso molecular (peso molecular de 100 a 500) que geralmente são considerados não imunogênicos. O mecanismo da DA por exposição química é praticamente desconhecido. A doença pode ser produzida diretamente por meio de anticorpos circulantes, indiretamente por meio da formação de complexos imunes ou como consequência da imunidade mediada por células, mas provavelmente ocorre por meio de uma combinação de mecanismos. A patogênese é mais bem conhecida em distúrbios hemolíticos imunes induzidos por drogas:

•  A droga pode se ligar à membrana dos glóbulos vermelhos e interagir com um anticorpo específico da droga.
•  A droga pode alterar a membrana dos glóbulos vermelhos de modo que o sistema imunológico considere a célula estranha.
•  A droga e seu anticorpo específico formam imunocomplexos que aderem à membrana das hemácias para produzir lesões.
•  A sensibilização das hemácias ocorre devido à produção de autoanticorpos das hemácias.

Verificou-se que uma variedade de substâncias químicas e drogas, em particular as últimas, induzem respostas autoimunes (Kamüller, Bloksma e Seinen 1989). A exposição ocupacional a produtos químicos pode ocasionar incidentalmente síndromes semelhantes à DA. A exposição a cloreto de vinila monomérico, tricloroetileno, percloroetileno, resinas epóxi e pó de sílica pode induzir síndromes semelhantes à esclerodermia. Uma síndrome semelhante ao lúpus eritematoso sistêmico (LES) foi descrita após a exposição à hidrazina. A exposição ao diisocianato de tolueno tem sido associada à indução de púrpura trombocitopênica. Metais pesados, como o mercúrio, têm sido implicados em alguns casos de glomerulonefrite por imunocomplexos.

Avaliação de Risco Humano

A avaliação do estado imunológico humano é realizada principalmente usando sangue periférico para análise de substâncias humorais como imunoglobulinas e complemento, e de leucócitos sanguíneos para composição de subconjuntos e funcionalidade de subpopulações. Esses métodos são geralmente os mesmos usados ​​para investigar a imunidade humoral e mediada por células, bem como a resistência inespecífica de pacientes com suspeita de imunodeficiência congênita. Para estudos epidemiológicos (por exemplo, de populações expostas ocupacionalmente), os parâmetros devem ser selecionados com base em seu valor preditivo em populações humanas, modelos animais validados e a biologia subjacente dos marcadores (ver tabela 1). A estratégia de triagem de efeitos imunotóxicos após exposição (acidental) a poluentes ambientais ou outros tóxicos depende muito das circunstâncias, como tipo de imunodeficiência esperada, tempo entre a exposição e a avaliação do estado imunológico, grau de exposição e número de indivíduos expostos. O processo de avaliação do risco imunotóxico de um determinado xenobiótico em humanos é extremamente difícil e muitas vezes impossível, devido em grande parte à presença de vários fatores de confusão de origem endógena ou exógena que influenciam a resposta dos indivíduos aos danos tóxicos. Isto é particularmente verdadeiro para estudos que investigam o papel da exposição química em doenças autoimunes, onde os fatores genéticos desempenham um papel crucial.

Tabela 1. Classificação dos testes para marcadores imunológicos

Como dados humanos adequados raramente estão disponíveis, a avaliação do risco de imunossupressão induzida por produtos químicos em humanos é, na maioria dos casos, baseada em estudos em animais. A identificação de potenciais xenobióticos imunotóxicos é realizada principalmente em estudos controlados em roedores. Os estudos de exposição in vivo apresentam, a esse respeito, a abordagem ideal para estimar o potencial imunotóxico de um composto. Isso se deve à natureza multifatorial e complexa do sistema imunológico e das respostas imunes. Estudos in vitro são de valor crescente na elucidação dos mecanismos de imunotoxicidade. Além disso, ao investigar os efeitos do composto usando células de origem animal e humana, podem ser gerados dados para comparação de espécies, que podem ser usados ​​na abordagem do “paralelogramo” para melhorar o processo de avaliação de risco. Se houver dados disponíveis para os três pilares do paralelogramo (in vivo animal e in vitro animal e humano), pode ser mais fácil prever o resultado no restante pilar, ou seja, o risco em humanos.

Quando a avaliação do risco de imunossupressão induzida por produtos químicos depende apenas de dados de estudos em animais, uma abordagem pode ser seguida na extrapolação para o homem pela aplicação de fatores de incerteza ao nível de efeito adverso não observado (NOAEL). Este nível pode ser baseado em parâmetros determinados em modelos relevantes, como ensaios de resistência do hospedeiro e avaliação in vivo de reações de hipersensibilidade e produção de anticorpos. Idealmente, a relevância dessa abordagem para avaliação de risco requer confirmação por estudos em humanos. Esses estudos devem combinar a identificação e medição do tóxico, dados epidemiológicos e avaliações do estado imunológico.

Para prever a hipersensibilidade de contato, modelos de cobaias estão disponíveis e têm sido usados ​​na avaliação de risco desde a década de 1970. Embora sensíveis e reprodutíveis, esses testes apresentam limitações por dependerem de avaliação subjetiva; isso pode ser superado por métodos mais novos e quantitativos desenvolvidos no mouse. Em relação à hipersensibilidade química induzida por inalação ou ingestão de alérgenos, testes devem ser desenvolvidos e avaliados quanto ao seu valor preditivo no homem. Quando se trata de definir níveis seguros de exposição ocupacional de alérgenos potenciais, deve-se levar em consideração a natureza bifásica da alergia: a fase de sensibilização e a fase de elicitação. A concentração necessária para provocar uma reação alérgica em um indivíduo previamente sensibilizado é consideravelmente menor do que a concentração necessária para induzir a sensibilização no indivíduo imunologicamente virgem, mas suscetível.

Como praticamente não existem modelos animais para prever a autoimunidade induzida por produtos químicos, deve-se dar ênfase ao desenvolvimento de tais modelos. Para o desenvolvimento de tais modelos, nosso conhecimento da autoimunidade induzida por produtos químicos em humanos deve ser avançado, incluindo o estudo de marcadores genéticos e do sistema imunológico para identificar indivíduos suscetíveis. Os seres humanos expostos a drogas que induzem a autoimunidade oferecem essa oportunidade.

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A toxicologia genética, por definição, é o estudo de como os agentes químicos ou físicos afetam o intrincado processo da hereditariedade. Os produtos químicos genotóxicos são definidos como compostos capazes de modificar o material hereditário das células vivas. A probabilidade de um determinado produto químico causar danos genéticos inevitavelmente depende de várias variáveis, incluindo o nível de exposição do organismo ao produto químico, a distribuição e retenção do produto químico uma vez que entra no corpo, a eficiência da ativação metabólica e/ou sistemas de desintoxicação em tecidos-alvo e a reatividade do produto químico ou de seus metabólitos com macromoléculas críticas dentro das células. A probabilidade de que o dano genético cause doença depende, em última análise, da natureza do dano, da capacidade da célula de reparar ou amplificar o dano genético, da oportunidade de expressar qualquer alteração induzida e da capacidade do corpo de reconhecer e suprimir a multiplicação de células aberrantes.

Em organismos superiores, a informação hereditária é organizada em cromossomos. Os cromossomos consistem em filamentos fortemente condensados ​​de DNA associado a proteínas. Dentro de um único cromossomo, cada molécula de DNA existe como um par de cadeias longas e não ramificadas de subunidades de nucleotídeos ligadas entre si por ligações fosfodiéster que unem o carbono 5 de uma porção de desoxirribose ao carbono 3 da próxima (figura 1). Além disso, uma das quatro bases nucleotídicas diferentes (adenina, citosina, guanina ou timina) está ligada a cada subunidade de desoxirribose como contas em um cordão. Tridimensionalmente, cada par de fitas de DNA forma uma dupla hélice com todas as bases voltadas para o interior da espiral. Dentro da hélice, cada base está associada à sua base complementar na fita de DNA oposta; a ligação de hidrogênio dita o emparelhamento forte e não covalente de adenina com timina e guanina com citosina (figura 1). Como a sequência de bases nucleotídicas é complementar em todo o comprimento da molécula de DNA duplex, ambas as fitas carregam essencialmente a mesma informação genética. De fato, durante a replicação do DNA, cada fita serve como modelo para a produção de uma nova fita parceira.

Figura 1. A organização (a) primária, (b) secundária e (c) terciária da informação hereditária humana

Usando o RNA e uma série de proteínas diferentes, a célula decifra a informação codificada pela sequência linear de bases dentro de regiões específicas do DNA (genes) e produz proteínas que são essenciais para a sobrevivência celular básica, bem como para o crescimento e diferenciação normais. Em essência, os nucleotídeos funcionam como um alfabeto biológico usado para codificar os aminoácidos, os blocos de construção das proteínas.

Quando nucleotídeos incorretos são inseridos ou nucleotídeos são perdidos, ou quando nucleotídeos desnecessários são adicionados durante a síntese de DNA, o erro é chamado de mutação. Estima-se que ocorra menos de uma mutação para cada 10⁹ nucleotídeos incorporados durante a replicação normal das células. Embora as mutações não sejam necessariamente prejudiciais, as alterações que causam inativação ou superexpressão de genes importantes podem resultar em uma variedade de distúrbios, incluindo câncer, doenças hereditárias, anormalidades do desenvolvimento, infertilidade e morte embrionária ou perinatal. Muito raramente, uma mutação pode levar a uma maior sobrevida; tais ocorrências são a base da seleção natural.

Embora alguns produtos químicos reajam diretamente com o DNA, a maioria requer ativação metabólica. No último caso, intermediários eletrofílicos, como epóxidos ou íons de carbono, são responsáveis ​​por induzir lesões em uma variedade de sítios nucleofílicos dentro do material genético (figura 2). Em outros casos, a genotoxicidade é mediada por subprodutos da interação do composto com lipídios intracelulares, proteínas ou oxigênio.

Figura 2. Bioativação de: a) benzo(a)pireno; e b) N-nitrosodimetilamina

Devido à sua relativa abundância nas células, as proteínas são o alvo mais frequente da interação tóxica. No entanto, a modificação do DNA é de maior preocupação devido ao papel central desta molécula na regulação do crescimento e diferenciação através de múltiplas gerações de células.

No nível molecular, os compostos eletrofílicos tendem a atacar o oxigênio e o nitrogênio no DNA. Os locais mais propensos à modificação estão ilustrados na figura 3. Embora os oxigênios dentro dos grupos fosfato no esqueleto do DNA também sejam alvos para modificação química, acredita-se que o dano às bases seja biologicamente mais relevante, uma vez que esses grupos são considerados os principais elementos na molécula de DNA.

Figura 3. Locais primários de danos ao DNA induzidos quimicamente

Os compostos que contêm uma porção eletrofílica normalmente exercem genotoxicidade pela produção de mono-adutos no DNA. Da mesma forma, os compostos que contêm duas ou mais porções reativas podem reagir com dois centros nucleofílicos diferentes e, assim, produzir reticulações intra ou intermoleculares no material genético (figura 4). As ligações cruzadas entre fitas DNA-DNA e DNA-proteína podem ser particularmente citotóxicas, pois podem formar blocos completos para a replicação do DNA. Por razões óbvias, a morte de uma célula elimina a possibilidade de ela sofrer mutação ou transformação neoplásica. Agentes genotóxicos também podem atuar induzindo quebras no esqueleto fosfodiéster, ou entre bases e açúcares (produzindo sítios abásicos) no DNA. Essas quebras podem ser resultado direto da reatividade química no local danificado ou podem ocorrer durante o reparo de um dos tipos de lesão de DNA mencionados acima.

Figura 4. Vários tipos de dano ao complexo proteína-DNA

Nos últimos trinta a quarenta anos, várias técnicas foram desenvolvidas para monitorar o tipo de dano genético induzido por vários produtos químicos. Tais ensaios são descritos em detalhes em outras partes deste capítulo e enciclopédia.

A replicação incorreta de "microlesões", como mono-adutos, locais abásicos ou quebras de fita simples, pode resultar em substituições de pares de bases de nucleotídeos ou na inserção ou exclusão de fragmentos de polinucleotídeos curtos no DNA cromossômico. Em contraste, “macrolesões”, como adutos volumosos, ligações cruzadas ou quebras de fita dupla podem desencadear o ganho, perda ou rearranjo de pedaços relativamente grandes de cromossomos. De qualquer forma, as consequências podem ser devastadoras para o organismo, pois qualquer um desses eventos pode levar à morte celular, perda de função ou transformação maligna das células. Exatamente como o dano ao DNA causa câncer é amplamente desconhecido. Atualmente, acredita-se que o processo pode envolver ativação inadequada de proto-oncogenes, como meu c e ras, e/ou inativação de genes supressores de tumor recentemente identificados, como p53. A expressão anormal de qualquer tipo de gene anula os mecanismos celulares normais para controlar a proliferação e/ou diferenciação celular.

A preponderância da evidência experimental indica que o desenvolvimento de câncer após a exposição a compostos eletrofílicos é um evento relativamente raro. Isso pode ser explicado, em parte, pela capacidade intrínseca da célula de reconhecer e reparar o DNA danificado ou pela falha das células com DNA danificado em sobreviver. Durante o reparo, a base danificada, nucleotídeo ou trecho curto de nucleotídeos ao redor do local danificado é removido e (usando a fita oposta como modelo) um novo pedaço de DNA é sintetizado e inserido no lugar. Para ser eficaz, o reparo do DNA deve ocorrer com grande precisão antes da divisão celular, antes das oportunidades de propagação da mutação.

Estudos clínicos demonstraram que pessoas com defeitos hereditários na capacidade de reparar DNA danificado frequentemente desenvolvem câncer e/ou anormalidades de desenvolvimento em idade precoce (tabela 1). Esses exemplos fornecem fortes evidências que ligam o acúmulo de danos ao DNA a doenças humanas. Da mesma forma, os agentes que promovem a proliferação celular (como o acetato de tetradecanoilforbol) geralmente aumentam a carcinogênese. Para esses compostos, o aumento da probabilidade de transformação neoplásica pode ser consequência direta da diminuição do tempo disponível para a célula realizar o reparo adequado do DNA.

Tabela 1. Distúrbios hereditários propensos ao câncer que parecem envolver defeitos no reparo do DNA

As primeiras teorias sobre como os produtos químicos interagem com o DNA remontam a estudos conduzidos durante o desenvolvimento do gás mostarda para uso em guerra. Uma compreensão maior surgiu dos esforços para identificar agentes anticancerígenos que interromperiam seletivamente a replicação de células tumorais que se dividem rapidamente. O aumento da preocupação pública com os perigos em nosso meio ambiente levou a pesquisas adicionais sobre os mecanismos e consequências da interação química com o material genético. Exemplos de vários tipos de produtos químicos que exercem genotoxicidade são apresentados na tabela 2.

Tabela 2. Exemplos de produtos químicos que exibem genotoxicidade em células humanas

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Praticamente toda a medicina é dedicada a prevenir a morte celular, em doenças como infarto do miocárdio, acidente vascular cerebral, trauma e choque, ou causá-la, como no caso de doenças infecciosas e câncer. É, portanto, essencial entender a natureza e os mecanismos envolvidos. A morte celular tem sido classificada como “acidental”, isto é, causada por agentes tóxicos, isquemia e outros, ou “programada”, como ocorre durante o desenvolvimento embriológico, incluindo formação de dígitos e reabsorção da cauda do girino.

A lesão celular e a morte celular são, portanto, importantes tanto na fisiologia quanto na fisiopatologia. A morte celular fisiológica é extremamente importante durante a embriogênese e o desenvolvimento embrionário. O estudo da morte celular durante o desenvolvimento trouxe importantes e novas informações sobre a genética molecular envolvida, especialmente através do estudo do desenvolvimento em animais invertebrados. Nesses animais, a localização precisa e o significado das células destinadas à morte celular foram cuidadosamente estudados e, com o uso de técnicas clássicas de mutagênese, vários genes envolvidos já foram identificados. Nos órgãos adultos, o equilíbrio entre a morte celular e a proliferação celular controla o tamanho do órgão. Em alguns órgãos, como a pele e o intestino, há uma renovação contínua das células. Na pele, por exemplo, as células se diferenciam à medida que atingem a superfície e, finalmente, sofrem diferenciação terminal e morte celular à medida que a queratinização prossegue com a formação de envelopes reticulados.

Muitas classes de produtos químicos tóxicos são capazes de induzir lesão celular aguda seguida de morte. Estes incluem anóxia e isquemia e seus análogos químicos, como cianeto de potássio; carcinógenos químicos, que formam eletrófilos que se ligam covalentemente a proteínas em ácidos nucléicos; produtos químicos oxidantes, resultando na formação de radicais livres e danos oxidantes; ativação do complemento; e uma variedade de ionóforos de cálcio. A morte celular também é um componente importante da carcinogênese química; muitos carcinógenos químicos completos, em doses carcinogênicas, produzem necrose aguda e inflamação seguida de regeneração e pré-neoplasia.

Definições

lesão celular

A lesão celular é definida como um evento ou estímulo, como um produto químico tóxico, que perturba a homeostase normal da célula, causando assim a ocorrência de vários eventos (figura 1). Os principais alvos de lesão letal ilustrados são a inibição da síntese de ATP, a ruptura da integridade da membrana plasmática ou a retirada de fatores de crescimento essenciais.

Figura 1. Lesão celular

Lesões letais resultam na morte de uma célula após um período de tempo variável, dependendo da temperatura, do tipo de célula e do estímulo; ou podem ser subletais ou crônicos - isto é, a lesão resulta em um estado homeostático alterado que, embora anormal, não resulta em morte celular (Trump e Arstila 1971; Trump e Berezesky 1992; Trump e Berezesky 1995; Trump, Berezesky e Osórnio-Vargas 1981). No caso de uma lesão letal, há uma fase anterior ao momento da morte celular

durante esse tempo, a célula se recuperará; entretanto, após um determinado ponto no tempo (o “ponto sem retorno” ou ponto de morte celular), a remoção da lesão não resulta em recuperação, mas a célula sofre degradação e hidrólise, atingindo finalmente o equilíbrio físico-químico com o meio Ambiente. Esta é a fase conhecida como necrose. Durante a fase pré-letal, vários tipos principais de mudança ocorrem, dependendo da célula e do tipo de lesão. Estes são conhecidos como apoptose e oncose.

Apoptosis

Apoptose é derivado das palavras gregas apo, significando longe de, e ptose, significando cair. O termo caindo longe de deriva do fato de que, durante esse tipo de alteração pré-letal, as células encolhem e sofrem bolhas acentuadas na periferia. As bolhas então se desprendem e flutuam. A apoptose ocorre em uma variedade de tipos de células após vários tipos de lesão tóxica (Wyllie, Kerr e Currie 1980). É especialmente proeminente nos linfócitos, onde é o mecanismo predominante para renovação de clones de linfócitos. Os fragmentos resultantes resultam nos corpos basofílicos vistos dentro dos macrófagos nos gânglios linfáticos. Em outros órgãos, a apoptose ocorre tipicamente em células únicas que são rapidamente eliminadas antes e após a morte por fagocitose dos fragmentos por células parenquimatosas adjacentes ou por macrófagos. A apoptose que ocorre em células únicas com subsequente fagocitose normalmente não resulta em inflamação. Antes da morte, as células apoptóticas apresentam um citosol muito denso com mitocôndrias normais ou condensadas. O retículo endoplasmático (ER) é normal ou apenas ligeiramente dilatado. A cromatina nuclear é marcadamente agrupada ao longo do envelope nuclear e ao redor do nucléolo. O contorno nuclear também é irregular e ocorre fragmentação nuclear. A condensação da cromatina está associada à fragmentação do DNA que, em muitos casos, ocorre entre os nucleossomos, dando uma aparência característica de escada na eletroforese.

Na apoptose, aumentou [Ca²⁺]_i pode estimular K⁺ efluxo resultando em encolhimento celular, o que provavelmente requer ATP. Lesões que inibem totalmente a síntese de ATP, portanto, têm maior probabilidade de resultar em apoptose. Um aumento sustentado de [Ca²⁺]_i tem uma série de efeitos deletérios, incluindo a ativação de proteases, endonucleases e fosfolipases. A ativação da endonuclease resulta em quebras simples e duplas de DNA que, por sua vez, estimulam níveis aumentados de p53 e na poli-ADP ribosilação, e de proteínas nucleares essenciais no reparo do DNA. A ativação de proteases modifica uma série de substratos, incluindo actina e proteínas relacionadas, levando à formação de bolhas. Outro substrato importante é a poli(ADP-ribose) polimerase (PARP), que inibe o reparo do DNA. Aumentou [Ca²⁺]_i também está associada à ativação de várias proteínas quinases, como MAP quinase, calmodulina quinase e outras. Essas quinases estão envolvidas na ativação de fatores de transcrição que iniciam a transcrição de genes precoces imediatos, por exemplo, c-fos, c-jun e c-myc, e na ativação da fosfolipase A₂ que resulta na permeabilização da membrana plasmática e das membranas intracelulares, como a membrana interna da mitocôndria.

oncose

Oncose, derivado da palavra grega É s, inchar, é assim chamado porque neste tipo de alteração pré-letal a célula começa a inchar quase imediatamente após a lesão (Majno e Joris 1995). A razão para o inchaço é um aumento de cátions na água dentro da célula. O principal cátion responsável é o sódio, que normalmente é regulado para manter o volume celular. No entanto, na ausência de ATP ou se a Na-ATPase do plasmalema for inibida, o controle do volume é perdido devido à proteína intracelular e o sódio na água continua a aumentar. Entre os eventos precoces na oncose estão, portanto, o aumento da [Na⁺]_i que leva ao inchaço celular e aumento da [Ca²⁺]_i resultante do influxo do espaço extracelular ou da liberação dos estoques intracelulares. Isso resulta em inchaço do citosol, inchaço do retículo endoplasmático e do aparelho de Golgi e na formação de bolhas aquosas ao redor da superfície celular. As mitocôndrias inicialmente sofrem condensação, mas depois elas também mostram um inchaço de alta amplitude devido a danos na membrana mitocondrial interna. Nesse tipo de alteração pré-letal, a cromatina sofre condensação e, por fim, degradação; no entanto, o padrão de escada característico da apoptose não é observado.

Necrose

Necrose refere-se à série de alterações que ocorrem após a morte celular, quando a célula é convertida em detritos que normalmente são removidos pela resposta inflamatória. Dois tipos podem ser distinguidos: necrose oncótica e necrose apoptótica. A necrose oncótica geralmente ocorre em grandes zonas, por exemplo, em um infarto do miocárdio ou regionalmente em um órgão após toxicidade química, como o túbulo renal proximal após a administração de HgCl₂. Amplas zonas de um órgão estão envolvidas e as células necróticas rapidamente incitam uma reação inflamatória, primeiro aguda e depois crônica. No caso de o organismo sobreviver, em muitos órgãos a necrose é seguida pela eliminação das células mortas e regeneração, por exemplo, no fígado ou rim após toxicidade química. Em contraste, a necrose apoptótica ocorre tipicamente em uma única célula e os detritos necróticos são formados dentro dos fagócitos de macrófagos ou células parenquimatosas adjacentes. As primeiras características das células necróticas incluem interrupções na continuidade da membrana plasmática e o aparecimento de densidades floculentas, representando proteínas desnaturadas dentro da matriz mitocondrial. Em algumas formas de lesão que inicialmente não interferem no acúmulo mitocondrial de cálcio, depósitos de fosfato de cálcio podem ser vistos dentro da mitocôndria. Outros sistemas de membrana são fragmentados de forma semelhante, como o RE, os lisossomos e o aparelho de Golgi. Por fim, a cromatina nuclear sofre lise, resultante do ataque das hidrolases lisossômicas. Após a morte celular, as hidrolases lisossômicas desempenham um papel importante na remoção de detritos com catepsinas, nucleolases e lipases, uma vez que estas têm um pH ácido ótimo e podem sobreviver ao baixo pH das células necróticas, enquanto outras enzimas celulares são desnaturadas e inativadas.

Mecanismos

estímulo inicial

No caso de lesões letais, as interações iniciais mais comuns que resultam em lesões que levam à morte celular são a interferência no metabolismo energético, como anoxia, isquemia ou inibidores da respiração, e glicólise, como cianeto de potássio, monóxido de carbono, iodo-acetato e em breve. Como mencionado acima, altas doses de compostos que inibem o metabolismo energético normalmente resultam em oncose. O outro tipo comum de lesão inicial que resulta em morte celular aguda é a modificação da função da membrana plasmática (Trump e Arstila 1971; Trump, Berezesky e Osornio-Vargas 1981). Isso pode ser dano direto e permeabilização, como no caso de trauma ou ativação do complexo C5b-C9 do complemento, dano mecânico à membrana celular ou inibição do sódio-potássio (Na⁺-K⁺) bomba com glicosídeos como ouabaína. Ionóforos de cálcio, como ionomicina ou A23187, que transportam rapidamente [Ca²⁺] descendo o gradiente para dentro da célula, também causam lesões letais agudas. Em alguns casos, o padrão na alteração pré-letal é a apoptose; em outros, é oncose.

Vias de sinalização

Com muitos tipos de lesão, a respiração mitocondrial e a fosforilação oxidativa são rapidamente afetadas. Em algumas células, isso estimula a glicólise anaeróbia, que é capaz de manter o ATP, mas em muitas lesões isso é inibido. A falta de ATP resulta na incapacidade de energizar vários processos homeostáticos importantes, em particular, o controle da homeostase iônica intracelular (Trump e Berezesky 1992; Trump, Berezesky e Osornio-Vargas 1981). Isso resulta em aumentos rápidos de [Ca²⁺]_i, e aumentou [Na⁺] e [Cl^-] resulta em inchaço celular. Aumentos em [Ca²⁺]_i resultam na ativação de vários outros mecanismos de sinalização discutidos abaixo, incluindo uma série de quinases, que podem resultar em aumento imediato da transcrição precoce de genes. Aumentou [Ca²⁺]_i também modifica a função do citoesqueleto, resultando em parte na formação de bolhas e na ativação de endonucleases, proteases e fosfolipases. Estes parecem desencadear muitos dos efeitos importantes discutidos acima, como danos à membrana através da ativação de protease e lipase, degradação direta do DNA pela ativação de endonuclease e ativação de quinases como MAP quinase e calmodulina quinase, que atuam como fatores de transcrição.

Através de um extenso trabalho de desenvolvimento em invertebrados C. elegans e Drosophila, assim como células humanas e animais, uma série de genes pró-morte foram identificados. Descobriu-se que alguns desses genes de invertebrados têm contrapartes de mamíferos. Por exemplo, o gene ced-3, essencial para a morte celular programada em C. elegans, tem atividade de protease e uma forte homologia com a enzima de conversão de interleucina (ICE) de mamíferos. Um gene intimamente relacionado chamado apopaína ou prICE foi recentemente identificado com uma homologia ainda mais estreita (Nicholson et al. 1995). No Drosophila, o gene reaper parece estar envolvido em um sinal que leva à morte celular programada. Outros genes pró-morte incluem a proteína de membrana Fas e o importante gene supressor de tumor, p53, que é amplamente conservado. A p53 é induzida no nível da proteína após o dano ao DNA e quando fosforilada atua como um fator de transcrição para outros genes, como gadd45 e waf-1, que estão envolvidos na sinalização da morte celular. Outros genes precoces imediatos, como c-fos, c-jun e c-myc, também parecem estar envolvidos em alguns sistemas.

Ao mesmo tempo, existem genes anti-morte que parecem neutralizar os genes pró-morte. O primeiro deles a ser identificado foi o ced-9 de C. elegans, que é homólogo ao bcl-2 em humanos. Esses genes agem de uma maneira ainda desconhecida para impedir a morte celular por toxinas genéticas ou químicas. Algumas evidências recentes indicam que o bcl-2 pode atuar como um antioxidante. Atualmente, há muito esforço em andamento para entender os genes envolvidos e desenvolver maneiras de ativar ou inibir esses genes, dependendo da situação.

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A toxicologia mecanicista é o estudo de como agentes químicos ou físicos interagem com organismos vivos para causar toxicidade. O conhecimento do mecanismo de toxicidade de uma substância aumenta a capacidade de prevenir a toxicidade e projetar produtos químicos mais desejáveis; constitui a base para a terapia de superexposição e freqüentemente permite uma maior compreensão dos processos biológicos fundamentais. Para fins deste enciclopédia a ênfase será colocada em animais para prever a toxicidade humana. Diferentes áreas da toxicologia incluem toxicologia mecanicista, descritiva, regulatória, forense e ambiental (Klaassen, Amdur e Doull 1991). Todos eles se beneficiam da compreensão dos mecanismos fundamentais da toxicidade.

Por que entender os mecanismos de toxicidade?

Compreender o mecanismo pelo qual uma substância causa toxicidade aprimora diferentes áreas da toxicologia de maneiras diferentes. A compreensão mecanicista ajuda o regulador governamental a estabelecer limites seguros legalmente obrigatórios para a exposição humana. Ele ajuda os toxicologistas a recomendar cursos de ação em relação à limpeza ou remediação de locais contaminados e, juntamente com as propriedades físicas e químicas da substância ou mistura, pode ser usado para selecionar o grau de equipamento de proteção necessário. O conhecimento mecanicista também é útil para formar a base da terapia e o projeto de novos medicamentos para o tratamento de doenças humanas. Para o toxicologista forense, o mecanismo de toxicidade geralmente fornece informações sobre como um agente químico ou físico pode causar morte ou incapacitação.

Se o mecanismo de toxicidade for compreendido, a toxicologia descritiva torna-se útil para prever os efeitos tóxicos de produtos químicos relacionados. É importante entender, no entanto, que a falta de informações mecanísticas não impede os profissionais de saúde de proteger a saúde humana. Decisões prudentes baseadas em estudos com animais e na experiência humana são usadas para estabelecer níveis seguros de exposição. Tradicionalmente, uma margem de segurança foi estabelecida usando o “nível de nenhum efeito adverso” ou um “nível de efeito adverso mais baixo” de estudos em animais (usando projetos de exposição repetida) e dividindo esse nível por um fator de 100 para exposição ocupacional ou 1,000 para exposição ocupacional. outra exposição ambiental humana. O sucesso desse processo é evidente a partir dos poucos incidentes de efeitos adversos à saúde atribuídos à exposição a produtos químicos em trabalhadores onde os limites de exposição apropriados foram estabelecidos e respeitados no passado. Além disso, o tempo de vida humano continua a aumentar, assim como a qualidade de vida. Em geral, o uso de dados de toxicidade levou a um controle regulamentar e voluntário eficaz. O conhecimento detalhado dos mecanismos tóxicos aumentará a previsibilidade dos novos modelos de risco atualmente em desenvolvimento e resultará em melhoria contínua.

A compreensão dos mecanismos ambientais é complexa e pressupõe o conhecimento da perturbação e homeostase (equilíbrio) do ecossistema. Embora não discutido neste artigo, uma compreensão aprimorada dos mecanismos tóxicos e suas consequências finais em um ecossistema ajudaria os cientistas a tomar decisões prudentes sobre o manuseio de resíduos municipais e industriais. A gestão de resíduos é uma área de pesquisa em crescimento e continuará a ser muito importante no futuro.

Técnicas para estudar mecanismos de toxicidade

A maioria dos estudos mecanísticos começa com um estudo toxicológico descritivo em animais ou observações clínicas em humanos. Idealmente, os estudos em animais incluem observações comportamentais e clínicas cuidadosas, exame bioquímico cuidadoso de elementos do sangue e da urina para sinais de função adversa dos principais sistemas biológicos do corpo e uma avaliação post-mortem de todos os sistemas de órgãos por exame microscópico para verificar se há lesões (consulte as diretrizes de teste da OCDE; diretivas da CE sobre avaliação química; regras de teste da EPA dos EUA; regulamentos de produtos químicos do Japão). Isso é análogo a um exame físico humano completo que ocorreria em um hospital durante um período de dois a três dias, exceto para o exame post-mortem.

Compreender os mecanismos de toxicidade é a arte e a ciência da observação, criatividade na seleção de técnicas para testar várias hipóteses e integração inovadora de sinais e sintomas em uma relação causal. Os estudos mecanísticos começam com a exposição, seguem a distribuição relacionada ao tempo e o destino no corpo (farmacocinética) e medem o efeito tóxico resultante em algum nível do sistema e em algum nível de dose. Diferentes substâncias podem atuar em diferentes níveis do sistema biológico causando toxicidade.

Exposição

A rota de exposição em estudos mecanísticos é geralmente a mesma da exposição humana. A rota é importante porque pode haver efeitos que ocorrem localmente no local da exposição, além de efeitos sistêmicos após a substância química ter sido absorvida pelo sangue e distribuída por todo o corpo. Um exemplo simples, mas convincente, de um efeito local seria a irritação e eventual corrosão da pele após a aplicação de soluções ácidas ou alcalinas fortes projetadas para limpar superfícies duras. Da mesma forma, irritação e morte celular podem ocorrer nas células que revestem o nariz e/ou os pulmões após a exposição a vapores ou gases irritantes, como óxidos de nitrogênio ou ozônio. (Ambos são constituintes da poluição do ar, ou smog). Após a absorção de um produto químico no sangue através da pele, pulmões ou trato gastrointestinal, a concentração em qualquer órgão ou tecido é controlada por muitos fatores que determinam a farmacocinética do produto químico no corpo. O corpo tem a capacidade de ativar e desintoxicar vários produtos químicos, conforme observado abaixo.

Papel da Farmacocinética na Toxicidade

A farmacocinética descreve as relações de tempo para absorção química, distribuição, metabolismo (alterações bioquímicas no corpo) e eliminação ou excreção do corpo. Em relação aos mecanismos de toxicidade, essas variáveis ​​farmacocinéticas podem ser muito importantes e, em alguns casos, determinar se a toxicidade ocorrerá ou não. Por exemplo, se um material não for absorvido em quantidade suficiente, não ocorrerá toxicidade sistêmica (dentro do corpo). Por outro lado, um produto químico altamente reativo que é desintoxicado rapidamente (segundos ou minutos) por enzimas digestivas ou hepáticas pode não ter tempo para causar toxicidade. Algumas substâncias e misturas halogenadas policíclicas, bem como certos metais como o chumbo, não causariam toxicidade significativa se a excreção fosse rápida; mas o acúmulo em níveis suficientemente altos determina sua toxicidade, uma vez que a excreção não é rápida (às vezes medida em anos). Felizmente, a maioria dos produtos químicos não tem uma retenção tão longa no corpo. A acumulação de um material inócuo ainda não induziria toxicidade. A taxa de eliminação do corpo e desintoxicação é frequentemente referida como a meia-vida do produto químico, que é o tempo para 50% do produto químico ser excretado ou alterado para uma forma não tóxica.

No entanto, se um produto químico se acumula em uma determinada célula ou órgão, isso pode sinalizar um motivo para examinar mais detalhadamente sua potencial toxicidade nesse órgão. Mais recentemente, modelos matemáticos foram desenvolvidos para extrapolar variáveis ​​farmacocinéticas de animais para humanos. Esses modelos farmacocinéticos são extremamente úteis para gerar hipóteses e testar se o animal experimental pode ser uma boa representação para humanos. Numerosos capítulos e textos foram escritos sobre este assunto (Gehring et al. 1976; Reitz et al. 1987; Nolan et al. 1995). Um exemplo simplificado de um modelo fisiológico é representado na figura 1.

Figura 1. Um modelo farmacocinético simplificado

Diferentes níveis e sistemas podem ser afetados adversamente

A toxicidade pode ser descrita em diferentes níveis biológicos. A lesão pode ser avaliada na pessoa como um todo (ou animal), no sistema orgânico, na célula ou na molécula. Os sistemas de órgãos incluem os sistemas imunológico, respiratório, cardiovascular, renal, endócrino, digestivo, musculoesquelético, sanguíneo, reprodutivo e nervoso central. Alguns órgãos-chave incluem o fígado, rim, pulmão, cérebro, pele, olhos, coração, testículos ou ovários e outros órgãos importantes. No nível celular/bioquímico, os efeitos adversos incluem interferência com a função normal da proteína, função do receptor endócrino, inibição da energia metabólica ou inibição ou indução de enzimas xenobióticas (substâncias estranhas). Os efeitos adversos no nível molecular incluem alteração da função normal da transcrição do DNA-RNA, da ligação específica do receptor citoplasmático e nuclear e dos genes ou produtos gênicos. Em última análise, a disfunção em um sistema de órgão principal é provavelmente causada por uma alteração molecular em uma célula-alvo específica dentro desse órgão. No entanto, nem sempre é possível rastrear um mecanismo de volta a uma origem molecular de causalidade, nem é necessário. A intervenção e a terapia podem ser planejadas sem uma compreensão completa do alvo molecular. No entanto, o conhecimento sobre o mecanismo específico de toxicidade aumenta o valor preditivo e a precisão da extrapolação para outros produtos químicos. A Figura 2 é uma representação esquemática dos vários níveis onde a interferência de processos fisiológicos normais pode ser detectada. As setas indicam que as consequências para um indivíduo podem ser determinadas de cima para baixo (exposição, farmacocinética à toxicidade do sistema/órgão) ou de baixo para cima (alteração molecular, efeito celular/bioquímico para toxicidade do sistema/órgão).

Figura 2. Representação dos mecanismos de toxicidade

Exemplos de Mecanismos de Toxicidade

Os mecanismos de toxicidade podem ser diretos ou muito complexos. Freqüentemente, há uma diferença entre o tipo de toxicidade, o mecanismo de toxicidade e o nível do efeito, relacionado a se os efeitos adversos são devidos a uma única dose aguda alta (como um envenenamento acidental) ou a uma dose mais baixa exposição repetida (de exposição ocupacional ou ambiental). Classicamente, para fins de teste, uma dose única alta aguda é administrada por intubação direta no estômago de um roedor ou exposição a uma atmosfera de gás ou vapor por duas a quatro horas, o que melhor se assemelhar à exposição humana. Os animais são observados durante um período de duas semanas após a exposição e, em seguida, os principais órgãos externos e internos são examinados quanto a lesões. O teste de dose repetida varia de meses a anos. Para espécies de roedores, dois anos é considerado um estudo crônico (durante toda a vida) suficiente para avaliar toxicidade e carcinogenicidade, enquanto para primatas não humanos, dois anos seriam considerados um estudo subcrônico (menos que uma vida inteira) para avaliar toxicidade de dose repetida. Após a exposição, é realizado um exame completo de todos os tecidos, órgãos e fluidos para determinar quaisquer efeitos adversos.

Mecanismos de Toxicidade Aguda

Os exemplos a seguir são específicos para efeitos agudos de altas doses que podem levar à morte ou incapacitação grave. No entanto, em alguns casos, a intervenção resultará em efeitos transitórios e totalmente reversíveis. A dose ou gravidade da exposição determinará o resultado.

Asfixiantes simples. O mecanismo de toxicidade para gases inertes e algumas outras substâncias não reativas é a falta de oxigênio (anoxia). Esses produtos químicos, que causam privação de oxigênio no sistema nervoso central (SNC), são denominados asfixiantes simples. Se uma pessoa entra em um espaço fechado que contém nitrogênio sem oxigênio suficiente, ocorre uma depleção imediata de oxigênio no cérebro e leva à inconsciência e eventual morte se a pessoa não for removida rapidamente. Em casos extremos (próximo de oxigênio zero), a inconsciência pode ocorrer em poucos segundos. O resgate depende da rápida remoção para um ambiente oxigenado. A sobrevida com dano cerebral irreversível pode ocorrer a partir do resgate tardio, devido à morte de neurônios, que não conseguem se regenerar.

Asfixiantes químicos. O monóxido de carbono (CO) compete com o oxigênio pela ligação à hemoglobina (nos glóbulos vermelhos) e, portanto, priva os tecidos de oxigênio para o metabolismo energético; morte celular pode resultar. A intervenção inclui a remoção da fonte de CO e o tratamento com oxigênio. O uso direto do oxigênio é baseado na ação tóxica do CO. Outro potente asfixiante químico é o cianeto. O íon cianeto interfere no metabolismo celular e na utilização de oxigênio para energia. O tratamento com nitrito de sódio provoca uma alteração da hemoglobina nos glóbulos vermelhos para metahemoglobina. A metahemoglobina tem maior afinidade de ligação com o íon cianeto do que o alvo celular do cianeto. Consequentemente, a metahemoglobina se liga ao cianeto e mantém o cianeto longe das células-alvo. Isso forma a base para a terapia antídoto.

Depressores do sistema nervoso central (SNC). A toxicidade aguda é caracterizada por sedação ou inconsciência para uma série de materiais como solventes que não são reativos ou que são transformados em intermediários reativos. Supõe-se que a sedação/anestesia se deva a uma interação do solvente com as membranas das células do SNC, o que prejudica sua capacidade de transmitir sinais elétricos e químicos. Embora a sedação possa parecer uma forma leve de toxicidade e tenha sido a base para o desenvolvimento dos primeiros anestésicos, “a dose ainda faz o veneno”. Se uma dose suficiente for administrada por ingestão ou inalação, o animal pode morrer devido a parada respiratória. Se a morte anestésica não ocorrer, esse tipo de toxicidade geralmente é prontamente reversível quando o indivíduo é removido do ambiente ou o produto químico é redistribuído ou eliminado do corpo.

Efeitos de pele. Os efeitos adversos na pele podem variar de irritação a corrosão, dependendo da substância encontrada. Ácidos fortes e soluções alcalinas são incompatíveis com tecidos vivos e são corrosivos, causando queimaduras químicas e possíveis cicatrizes. A cicatrização ocorre devido à morte das células dérmicas profundas da pele, responsáveis ​​pela regeneração. Concentrações mais baixas podem apenas causar irritação da primeira camada da pele.

Outro mecanismo tóxico específico da pele é o da sensibilização química. Por exemplo, a sensibilização ocorre quando o 2,4-dinitroclorobenzeno se liga a proteínas naturais da pele e o sistema imunológico reconhece o complexo ligado à proteína alterado como um material estranho. Ao responder a esse material estranho, o sistema imunológico ativa células especiais para eliminar a substância estranha por meio da liberação de mediadores (citocinas) que causam erupção cutânea ou dermatite (consulte “Imunotoxicologia”). Esta é a mesma reação do sistema imunológico quando ocorre a exposição à hera venenosa. A sensibilização imune é muito específica para o produto químico em particular e leva pelo menos duas exposições antes que uma resposta seja eliciada. A primeira exposição sensibiliza (configura as células para reconhecer o produto químico) e as exposições subsequentes desencadeiam a resposta do sistema imunológico. A remoção do contato e a terapia sintomática com cremes anti-inflamatórios contendo esteróides geralmente são eficazes no tratamento de indivíduos sensibilizados. Em casos graves ou refratários, um imunossupressor de ação sistêmica, como a prednisona, é usado em conjunto com o tratamento tópico.

Sensibilização pulmonar. Uma resposta de sensibilização imune é provocada por diisocianato de tolueno (TDI), mas o local-alvo são os pulmões. A superexposição ao TDI em indivíduos suscetíveis causa edema pulmonar (acúmulo de líquido), constrição brônquica e respiração prejudicada. Esta é uma condição séria e requer a remoção do indivíduo de possíveis exposições subsequentes. O tratamento é principalmente sintomático. A sensibilização da pele e dos pulmões segue uma resposta à dose. Exceder o nível estabelecido para exposição ocupacional pode causar efeitos adversos.

Efeitos oculares. As lesões oculares variam desde o avermelhamento da camada externa (vermelhidão da piscina) até a formação de catarata da córnea e danos à íris (parte colorida do olho). Os testes de irritação ocular são realizados quando se acredita que não ocorrerão ferimentos graves. Muitos dos mecanismos que causam a corrosão da pele também podem causar lesões nos olhos. Materiais corrosivos à pele, como ácidos fortes (pH menor que 2) e álcalis (pH maior que 11.5), não são testados nos olhos de animais porque a maioria causará corrosão e cegueira devido a um mecanismo semelhante ao que causa a corrosão da pele . Além disso, agentes ativos de superfície, como detergentes e surfactantes, podem causar lesões oculares, desde irritação até corrosão. Um grupo de materiais que requer cautela são os surfactantes carregados positivamente (catiônicos), que podem causar queimaduras, opacidade permanente da córnea e vascularização (formação de vasos sanguíneos). Outra substância química, o dinitrofenol, tem um efeito específico na formação de catarata. Isso parece estar relacionado à concentração dessa substância química no olho, que é um exemplo de especificidade de distribuição farmacocinética.

Embora a lista acima esteja longe de ser exaustiva, ela é projetada para dar ao leitor uma apreciação de vários mecanismos de toxicidade aguda.

Mecanismos de Toxicidade Subcrônica e Crônica

Quando administrados em dose alta única, alguns produtos químicos não apresentam o mesmo mecanismo de toxicidade de quando administrados repetidamente em doses menores, mas ainda tóxicas. Quando uma única dose alta é administrada, há sempre a possibilidade de exceder a capacidade da pessoa de desintoxicar ou excretar o produto químico, e isso pode levar a uma resposta tóxica diferente do que quando doses repetidas mais baixas são administradas. O álcool é um bom exemplo. Altas doses de álcool levam a efeitos primários no sistema nervoso central, enquanto baixas doses repetitivas resultam em lesão hepática.

Inibição da anticolinesterase. A maioria dos pesticidas organofosforados, por exemplo, tem pouca toxicidade para mamíferos até que sejam metabolicamente ativados, principalmente no fígado. O principal mecanismo de ação dos organofosforados é a inibição da acetilcolinesterase (AChE) no cérebro e no sistema nervoso periférico. AChE é a enzima normal que termina a estimulação do neurotransmissor acetilcolina. A leve inibição da AChE por um período prolongado não foi associada a efeitos adversos. Em altos níveis de exposição, a incapacidade de terminar esta estimulação neuronal resulta em superestimulação do sistema nervoso colinérgico. A superestimulação colinérgica acaba resultando em uma série de sintomas, incluindo parada respiratória, seguida de morte se não for tratada. O tratamento primário é a administração de atropina, que bloqueia os efeitos da acetilcolina, e a administração de cloreto de pralidoxima, que reativa a AChE inibida. Portanto, tanto a causa quanto o tratamento da toxicidade do organofosforado são abordados pela compreensão da base bioquímica da toxicidade.

ativação metabólica. Muitos produtos químicos, incluindo tetracloreto de carbono, clorofórmio, acetilaminofluoreno, nitrosaminas e paraquat são metabolicamente ativados em radicais livres ou outros intermediários reativos que inibem e interferem na função celular normal. Em altos níveis de exposição, isso resulta em morte celular (consulte “Lesão celular e morte celular”). Embora as interações específicas e os alvos celulares permaneçam desconhecidos, os sistemas de órgãos que têm a capacidade de ativar essas substâncias químicas, como fígado, rim e pulmão, são todos alvos potenciais para lesões. Especificamente, determinadas células dentro de um órgão têm uma capacidade maior ou menor de ativar ou desintoxicar esses intermediários, e essa capacidade determina a suscetibilidade intracelular dentro de um órgão. O metabolismo é uma das razões pelas quais a compreensão da farmacocinética, que descreve esses tipos de transformações e a distribuição e eliminação desses intermediários, é importante para reconhecer o mecanismo de ação desses produtos químicos.

Mecanismos do câncer. O câncer é uma multiplicidade de doenças e, embora a compreensão de certos tipos de câncer esteja aumentando rapidamente devido às muitas técnicas de biologia molecular desenvolvidas desde 1980, ainda há muito a aprender. No entanto, está claro que o desenvolvimento do câncer é um processo de vários estágios, e genes críticos são a chave para diferentes tipos de câncer. Alterações no DNA (mutações somáticas) em vários desses genes críticos podem causar aumento da suscetibilidade ou lesões cancerígenas (consulte “Toxicologia genética”). A exposição a produtos químicos naturais (em alimentos cozidos como carne e peixe) ou produtos químicos sintéticos (como benzidina, usada como corante) ou agentes físicos (luz ultravioleta do sol, radônio do solo, radiação gama de procedimentos médicos ou atividades industriais) são todos contribuintes para mutações genéticas somáticas. No entanto, existem substâncias naturais e sintéticas (como antioxidantes) e processos de reparo do DNA que são protetores e mantêm a homeostase. É claro que a genética é um fator importante no câncer, uma vez que síndromes de doenças genéticas como xeroderma pigmentoso, onde há uma falta de reparo normal do DNA, aumentam dramaticamente a suscetibilidade ao câncer de pele devido à exposição à luz ultravioleta do sol.

Mecanismos reprodutivos. Semelhante ao câncer, muitos mecanismos de toxicidade reprodutiva e/ou de desenvolvimento são conhecidos, mas há muito a ser aprendido. Sabe-se que certos vírus (como a rubéola), infecções bacterianas e medicamentos (como a talidomida e a vitamina A) afetarão adversamente o desenvolvimento. Recentemente, o trabalho de Khera (1991), revisado por Carney (1994), mostra boas evidências de que os efeitos anormais no desenvolvimento em testes com animais com etileno glicol são atribuíveis a metabólitos ácidos metabólicos maternos. Isso ocorre quando o etileno glicol é metabolizado em metabólitos ácidos, incluindo ácido glicólico e oxálico. Os efeitos subsequentes na placenta e no feto parecem ser devidos a este processo de intoxicação metabólica.

Conclusão

A intenção deste artigo é dar uma perspectiva sobre vários mecanismos conhecidos de toxicidade e a necessidade de estudos futuros. É importante entender que o conhecimento mecanicista não é absolutamente necessário para proteger a saúde humana ou ambiental. Esse conhecimento aumentará a capacidade do profissional de prever e gerenciar melhor a toxicidade. As técnicas reais usadas na elucidação de qualquer mecanismo particular dependem do conhecimento coletivo dos cientistas e do pensamento daqueles que tomam decisões sobre a saúde humana.

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