La aparición de tecnologías sofisticadas en biología molecular y celular ha estimulado una evolución relativamente rápida en las ciencias de la vida, incluida la toxicología. En efecto, el enfoque de la toxicología está cambiando de animales completos y poblaciones de animales completos a las células y moléculas de animales individuales y humanos. Desde mediados de la década de 1980, los toxicólogos han comenzado a emplear estas nuevas metodologías para evaluar los efectos de las sustancias químicas en los sistemas vivos. Como una progresión lógica, estos métodos se están adaptando a los fines de las pruebas de toxicidad. Estos avances científicos han trabajado junto con factores sociales y económicos para efectuar cambios en la evaluación de la seguridad del producto y el riesgo potencial.

Los factores económicos están específicamente relacionados con el volumen de materiales que deben ser probados. Cada año se introduce en el mercado una plétora de nuevos cosméticos, productos farmacéuticos, pesticidas, productos químicos y productos para el hogar. Todos estos productos deben ser evaluados por su toxicidad potencial. Además, hay una acumulación de productos químicos que ya están en uso y que no se han probado adecuadamente. La enorme tarea de obtener información de seguridad detallada sobre todos estos productos químicos utilizando métodos tradicionales de prueba con animales completos sería costosa en términos de dinero y tiempo, si es que pudiera lograrse.

También existen problemas sociales relacionados con la salud y la seguridad públicas, así como una creciente preocupación pública sobre el uso de animales para las pruebas de seguridad de los productos. Con respecto a la seguridad humana, los grupos de defensa del interés público y ambiental han ejercido una presión significativa sobre las agencias gubernamentales para que apliquen regulaciones más estrictas sobre los productos químicos. Un ejemplo reciente de esto ha sido un movimiento de algunos grupos ambientalistas para prohibir el cloro y los compuestos que contienen cloro en los Estados Unidos. Una de las motivaciones para una acción tan extrema radica en el hecho de que la mayoría de estos compuestos nunca se han probado adecuadamente. Desde una perspectiva toxicológica, el concepto de prohibir toda una clase de productos químicos diversos basándose simplemente en la presencia de cloro es tanto científicamente erróneo como irresponsable. Sin embargo, es comprensible que, desde la perspectiva del público, debe existir cierta seguridad de que las sustancias químicas liberadas en el medio ambiente no representan un riesgo significativo para la salud. Tal situación subraya la necesidad de métodos más eficientes y rápidos para evaluar la toxicidad.

La otra preocupación social que ha afectado el área de las pruebas de toxicidad es el bienestar animal. El creciente número de grupos de protección animal en todo el mundo ha expresado una oposición considerable al uso de animales completos para las pruebas de seguridad de productos. Se han emprendido campañas activas contra los fabricantes de cosméticos, productos para el hogar y el cuidado personal y productos farmacéuticos en un intento de detener las pruebas con animales. Tales esfuerzos en Europa han resultado en la aprobación de la Sexta Enmienda a la Directiva 76/768/EEC (la Directiva de Cosméticos). La consecuencia de esta Directiva es que los productos cosméticos o ingredientes cosméticos que hayan sido probados en animales después del 1 de enero de 1998 no pueden comercializarse en la Unión Europea, a menos que los métodos alternativos no estén suficientemente validados. Si bien esta Directiva no tiene jurisdicción sobre la venta de dichos productos en los Estados Unidos u otros países, afectará significativamente a aquellas empresas que tienen mercados internacionales que incluyen a Europa.

El concepto de alternativas, que constituye la base para el desarrollo de ensayos distintos de los de animales enteros, se define por los tres Rs: reducción en el número de animales utilizados; refinamiento de protocolos para que los animales experimenten menos estrés o molestias; y reemplazo de las pruebas actuales en animales con pruebas in vitro (es decir, pruebas realizadas fuera del animal vivo), modelos informáticos o pruebas en especies de vertebrados inferiores o invertebrados. El tres Rs fueron introducidos en un libro publicado en 1959 por dos científicos británicos, WMS Russell y Rex Burch, Los principios de la técnica experimental humanitaria. Russell y Burch sostuvieron que la única forma en que se pueden obtener resultados científicos válidos es a través del trato humanitario de los animales y creían que se deberían desarrollar métodos para reducir el uso de animales y, en última instancia, reemplazarlo. Curiosamente, los principios descritos por Russell y Burch recibieron poca atención hasta el resurgimiento del movimiento por el bienestar animal a mediados de la década de 1970. Hoy el concepto de los tres Rs está muy a la vanguardia con respecto a la investigación, las pruebas y la educación.

En resumen, el desarrollo de metodologías de prueba in vitro se ha visto influenciado por una variedad de factores que han convergido en los últimos diez a 20 años. Es difícil determinar si alguno de estos factores por sí solo habría tenido un efecto tan profundo en las estrategias de pruebas de toxicidad.

Concepto de Ensayos de Toxicidad In Vitro

Esta sección se centrará únicamente en los métodos in vitro para evaluar la toxicidad, como una de las alternativas a las pruebas con animales completos. En otros artículos de este capítulo se analizan alternativas adicionales sin animales, como el modelado por computadora y las relaciones cuantitativas entre estructura y actividad.

Los estudios in vitro generalmente se llevan a cabo en células o tejidos animales o humanos fuera del cuerpo. In vitro significa literalmente “en vidrio”, y se refiere a procedimientos llevados a cabo en material vivo o componentes de material vivo cultivados en placas de Petri o en tubos de ensayo bajo condiciones definidas. Estos pueden contrastarse con los estudios in vivo, o los realizados “en el animal vivo”. Si bien es difícil, si no imposible, proyectar los efectos de un químico en un organismo complejo cuando las observaciones se limitan a un solo tipo de células en un plato, los estudios in vitro también brindan una cantidad significativa de información sobre la toxicidad intrínseca. como mecanismos celulares y moleculares de toxicidad. Además, ofrecen muchas ventajas sobre los estudios in vivo, ya que generalmente son menos costosos y pueden realizarse en condiciones más controladas. Además, a pesar de que todavía se necesita un pequeño número de animales para obtener células para cultivos in vitro, estos métodos pueden considerarse alternativas de reducción (ya que se utilizan muchos menos animales en comparación con los estudios in vivo) y alternativas de refinamiento (porque eliminan la necesidad de someter a los animales a las consecuencias tóxicas adversas impuestas por los experimentos in vivo).

Para interpretar los resultados de las pruebas de toxicidad in vitro, determinar su utilidad potencial para evaluar la toxicidad y relacionarlos con el proceso toxicológico general in vivo, es necesario comprender qué parte del proceso toxicológico se está examinando. Todo el proceso toxicológico consiste en eventos que comienzan con la exposición del organismo a un agente físico o químico, progresan a través de interacciones celulares y moleculares y finalmente se manifiestan en la respuesta de todo el organismo. Las pruebas in vitro generalmente se limitan a la parte del proceso toxicológico que tiene lugar a nivel celular y molecular. Los tipos de información que se pueden obtener de los estudios in vitro incluyen vías de metabolismo, interacción de metabolitos activos con objetivos celulares y moleculares y puntos finales tóxicos potencialmente medibles que pueden servir como biomarcadores moleculares para la exposición. En una situación ideal, se conocería el mecanismo de toxicidad de cada sustancia química a partir de la exposición a la manifestación del organismo, de modo que la información obtenida de las pruebas in vitro podría interpretarse completamente y relacionarse con la respuesta de todo el organismo. Sin embargo, esto es prácticamente imposible, ya que se han dilucidado relativamente pocos mecanismos toxicológicos completos. Por lo tanto, los toxicólogos se enfrentan a una situación en la que los resultados de una prueba in vitro no pueden utilizarse como una predicción totalmente precisa de la toxicidad in vivo porque se desconoce el mecanismo. Sin embargo, con frecuencia durante el proceso de desarrollo de una prueba in vitro, se aclaran los componentes de los mecanismos celulares y moleculares de toxicidad.

Una de las cuestiones clave no resueltas que rodean el desarrollo y la implementación de las pruebas in vitro está relacionada con la siguiente consideración: ¿deben basarse mecánicamente o es suficiente que sean descriptivas? Es indiscutiblemente mejor desde una perspectiva científica utilizar únicamente pruebas mecánicas como reemplazo de las pruebas in vivo. Sin embargo, en ausencia de un conocimiento mecanicista completo, la perspectiva de desarrollar pruebas in vitro para reemplazar completamente las pruebas con animales completos en un futuro cercano es casi nula. Sin embargo, esto no descarta el uso de tipos de análisis más descriptivos como herramientas de detección temprana, como es el caso actualmente. Estas pantallas han dado como resultado una reducción significativa en el uso de animales. Por lo tanto, hasta que se genere más información mecanicista, puede ser necesario emplear, en una medida más limitada, pruebas cuyos resultados simplemente se correlacionen bien con los obtenidos in vivo.

Pruebas in vitro de citotoxicidad

En esta sección, se describirán varias pruebas in vitro que se han desarrollado para evaluar el potencial citotóxico de una sustancia química. En su mayor parte, estas pruebas son fáciles de realizar y el análisis se puede automatizar. Una prueba in vitro de uso común para la citotoxicidad es el ensayo de rojo neutro. Este ensayo se realiza en células en cultivo y, para la mayoría de las aplicaciones, las células se pueden mantener en placas de cultivo que contienen 96 pocillos pequeños, cada uno de 6.4 mm de diámetro. Dado que cada pocillo se puede utilizar para una única determinación, esta disposición puede admitir múltiples concentraciones de la sustancia problema, así como controles positivos y negativos con un número suficiente de réplicas para cada uno. Después del tratamiento de las células con diversas concentraciones de la sustancia problema en un rango de al menos dos órdenes de magnitud (p. ej., de 0.01 mM a 1 mM), así como con productos químicos de control positivo y negativo, las células se enjuagan y se tratan con rojo neutro, un colorante que puede ser absorbido y retenido solo por células vivas. El colorante puede añadirse tras la eliminación de la sustancia problema para determinar los efectos inmediatos, o puede añadirse en varios momentos después de eliminar la sustancia problema para determinar los efectos acumulativos o retardados. La intensidad del color en cada pozo corresponde al número de células vivas en ese pozo. La intensidad del color se mide con un espectrofotómetro que puede estar equipado con un lector de placas. El lector de placas está programado para proporcionar mediciones individuales para cada uno de los 96 pocillos de la placa de cultivo. Esta metodología automatizada permite al investigador realizar rápidamente un experimento de concentración-respuesta y obtener datos estadísticamente útiles.

Otro ensayo relativamente simple para la citotoxicidad es la prueba MTT. El MTT (bromuro de 3[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio) es un colorante de tetrazolio que las enzimas mitocondriales reducen a un color azul. Solo las células con mitocondrias viables conservarán la capacidad de llevar a cabo esta reacción; por lo tanto, la intensidad del color está directamente relacionada con el grado de integridad mitocondrial. Esta es una prueba útil para detectar compuestos citotóxicos generales, así como aquellos agentes que se dirigen específicamente a las mitocondrias.

La medición de la actividad de la lactato deshidrogenasa (LDH) también se utiliza como un ensayo de base amplia para la citotoxicidad. Esta enzima normalmente está presente en el citoplasma de las células vivas y se libera en el medio de cultivo celular a través de membranas celulares con fugas de células muertas o moribundas que han sido afectadas negativamente por un agente tóxico. Se pueden eliminar pequeñas cantidades de medio de cultivo en varios momentos después del tratamiento químico de las células para medir la cantidad de LDH liberada y determinar el curso temporal de la toxicidad. Si bien el ensayo de liberación de LDH es una evaluación muy general de la citotoxicidad, es útil porque es fácil de realizar y se puede realizar en tiempo real.

Se están desarrollando muchos métodos nuevos para detectar daño celular. Los métodos más sofisticados emplean sondas fluorescentes para medir una variedad de parámetros intracelulares, como la liberación de calcio y los cambios en el pH y el potencial de membrana. En general, estas sondas son muy sensibles y pueden detectar cambios celulares más sutiles, lo que reduce la necesidad de utilizar la muerte celular como criterio de valoración. Además, muchos de estos ensayos fluorescentes pueden automatizarse mediante el uso de placas de 96 pocillos y lectores de placas fluorescentes.

Una vez que se han recopilado los datos sobre una serie de productos químicos usando una de estas pruebas, se pueden determinar las toxicidades relativas. La toxicidad relativa de una sustancia química, determinada en una prueba in vitro, puede expresarse como la concentración que ejerce un efecto del 50 % sobre la respuesta de punto final de las células no tratadas. Esta determinación se conoce como la CE₅₀ (Eefectivo Cconcentración para 50% de las células) y se puede utilizar para comparar la toxicidad de diferentes productos químicos in vitro. (Un término similar utilizado para evaluar la toxicidad relativa es IC₅₀, que indica la concentración de una sustancia química que provoca una inhibición del 50 % de un proceso celular, por ejemplo, la capacidad de absorber el rojo neutro). No es fácil evaluar si la toxicidad relativa in vitro de las sustancias químicas es comparable a su relativa en toxicidades vivo, ya que hay tantos factores de confusión en el sistema in vivo, como la toxicocinética, el metabolismo, la reparación y los mecanismos de defensa. Además, dado que la mayoría de estos ensayos miden puntos finales generales de citotoxicidad, no se basan en mecanismos. Por lo tanto, la concordancia entre las toxicidades relativas in vitro e in vivo es simplemente correlativa. A pesar de las numerosas complejidades y dificultades en la extrapolación de in vitro a in vivo, estas pruebas in vitro están demostrando ser muy valiosas porque son simples y económicas de realizar y pueden usarse como pantallas para detectar drogas o productos químicos altamente tóxicos en las primeras etapas de desarrollo.

Toxicidad en órganos diana

Las pruebas in vitro también se pueden utilizar para evaluar la toxicidad específica de órganos diana. Hay una serie de dificultades asociadas con el diseño de tales pruebas, siendo la más notable la incapacidad de los sistemas in vitro para mantener muchas de las características del órgano in vivo. Con frecuencia, cuando las células se toman de animales y se colocan en cultivo, tienden a degenerar rápidamente y/o a desdiferenciarse, es decir, pierden sus funciones similares a las de los órganos y se vuelven más genéricas. Esto presenta el problema de que dentro de un corto período de tiempo, normalmente unos pocos días, los cultivos ya no son útiles para evaluar los efectos de una toxina en órganos específicos.

Muchos de estos problemas se están superando gracias a los recientes avances en biología molecular y celular. La información que se obtiene sobre el entorno celular in vivo puede utilizarse para modular las condiciones de cultivo in vitro. Desde mediados de la década de 1980, se han descubierto nuevos factores de crecimiento y citoquinas, y muchos de ellos ahora están disponibles comercialmente. La adición de estos factores a las células en cultivo ayuda a preservar su integridad y también puede ayudar a conservar funciones más diferenciadas durante períodos de tiempo más prolongados. Otros estudios básicos han aumentado el conocimiento de los requerimientos nutricionales y hormonales de las células en cultivo, de modo que se puedan formular nuevos medios. También se han realizado avances recientes en la identificación de matrices extracelulares tanto naturales como artificiales en las que se pueden cultivar células. El cultivo de células en estas diferentes matrices puede tener efectos profundos tanto en su estructura como en su función. Una gran ventaja derivada de este conocimiento es la capacidad de controlar de forma compleja el entorno de las células en cultivo y examinar individualmente los efectos de estos factores en los procesos celulares básicos y en sus respuestas a diferentes agentes químicos. En resumen, estos sistemas pueden proporcionar una gran comprensión de los mecanismos de toxicidad específicos de órganos.

Muchos estudios de toxicidad en órganos diana se llevan a cabo en células primarias, que por definición se aíslan recientemente de un órgano y, por lo general, exhiben una vida finita en cultivo. Hay muchas ventajas de tener cultivos primarios de un solo tipo de célula de un órgano para la evaluación de la toxicidad. Desde una perspectiva mecanicista, tales cultivos son útiles para estudiar objetivos celulares específicos de una sustancia química. En algunos casos, se pueden cultivar juntos dos o más tipos de células de un órgano, lo que proporciona la ventaja adicional de poder observar las interacciones célula-célula en respuesta a una toxina. Se han diseñado algunos sistemas de cocultivo para la piel de modo que formen una estructura tridimensional que se asemeje a la piel in vivo. También es posible cocultivar células de diferentes órganos, por ejemplo, hígado y riñón. Este tipo de cultivo sería útil para evaluar los efectos específicos en las células renales de una sustancia química que debe bioactivarse en el hígado.

Las herramientas de biología molecular también han jugado un papel importante en el desarrollo de líneas celulares continuas que pueden ser útiles para las pruebas de toxicidad en órganos diana. Estas líneas celulares se generan mediante la transfección de ADN en células primarias. En el procedimiento de transfección, las células y el ADN se tratan de manera que el ADN pueda ser absorbido por las células. El ADN suele ser de un virus y contiene un gen o genes que, cuando se expresan, permiten que las células se inmortalicen (es decir, sean capaces de vivir y crecer durante largos períodos de tiempo en cultivo). El ADN también puede diseñarse de manera que el gen inmortalizador sea controlado por un promotor inducible. La ventaja de este tipo de construcción es que las células se dividirán solo cuando reciban el estímulo químico apropiado para permitir la expresión del gen inmortalizador. Un ejemplo de tal construcción es el gen del antígeno T grande del virus Simian Virus 40 (SV40) (el gen inmortalizador), precedido por la región promotora del gen de la metalotioneína, que es inducida por la presencia de un metal en el medio de cultivo. Por lo tanto, después de transfectar el gen en las células, las células pueden tratarse con bajas concentraciones de zinc para estimular el promotor de MT y activar la expresión del gen del antígeno T. En estas condiciones, las células proliferan. Cuando se elimina el zinc del medio, las células dejan de dividirse y, en condiciones ideales, vuelven a un estado en el que expresan sus funciones específicas de tejido.

La capacidad de generar células inmortalizadas combinada con los avances en la tecnología de cultivo celular han contribuido en gran medida a la creación de líneas celulares de muchos órganos diferentes, incluidos el cerebro, el riñón y el hígado. Sin embargo, antes de que estas líneas celulares puedan usarse como sustitutos de los tipos de células de buena fe, deben caracterizarse cuidadosamente para determinar qué tan "normales" son realmente.

Otros sistemas in vitro para estudiar la toxicidad en órganos diana implican una complejidad creciente. A medida que los sistemas in vitro progresan en complejidad desde el cultivo de una sola célula hasta el cultivo de órganos completos, se vuelven más comparables con el medio in vivo, pero al mismo tiempo se vuelven mucho más difíciles de controlar dado el mayor número de variables. Por lo tanto, lo que se puede ganar al pasar a un nivel superior de organización se puede perder en la incapacidad del investigador para controlar el entorno experimental. La Tabla 1 compara algunas de las características de varios sistemas in vitro que se han utilizado para estudiar la hepatotoxicidad.

Tabla 1. Comparación de sistemas in vitro para estudios de hepatotoxicidad

Las rebanadas de tejido cortadas con precisión se utilizan cada vez más para estudios toxicológicos. Hay nuevos instrumentos disponibles que permiten al investigador cortar rebanadas uniformes de tejido en un ambiente estéril. Los cortes de tejido ofrecen alguna ventaja sobre los sistemas de cultivo celular en el sentido de que todos los tipos de células del órgano están presentes y mantienen su arquitectura in vivo y comunicación intercelular. Por lo tanto, se pueden realizar estudios in vitro para determinar el tipo de célula diana dentro de un órgano, así como para investigar la toxicidad específica del órgano diana. Una desventaja de los cortes es que degeneran rápidamente después de las primeras 24 horas de cultivo, principalmente debido a la mala difusión de oxígeno a las células en el interior de los cortes. Sin embargo, estudios recientes han indicado que se puede lograr una aireación más eficiente mediante una rotación suave. Esto, junto con el uso de un medio más complejo, permite que las rodajas sobrevivan hasta 96 horas.

Los explantes de tejido son similares en concepto a los cortes de tejido y también se pueden utilizar para determinar la toxicidad de los productos químicos en órganos diana específicos. Los explantes de tejido se establecen extrayendo un pequeño trozo de tejido (para estudios de teratogenicidad, un embrión intacto) y colocándolo en cultivo para su posterior estudio. Los cultivos de explantes han sido útiles para estudios de toxicidad a corto plazo que incluyen irritación y corrosividad en la piel, estudios de asbesto en la tráquea y estudios de neurotoxicidad en el tejido cerebral.

Los órganos perfundidos aislados también se pueden utilizar para evaluar la toxicidad en órganos diana. Estos sistemas ofrecen una ventaja similar a la de los cortes de tejido y los explantes en el sentido de que están presentes todos los tipos de células, pero sin el estrés que suponen para el tejido las manipulaciones implicadas en la preparación de los cortes. Además, permiten el mantenimiento de interacciones intraorgánicas. Una desventaja importante es su viabilidad a corto plazo, lo que limita su uso para pruebas de toxicidad in vitro. En términos de servir como una alternativa, estos cultivos pueden considerarse un refinamiento ya que los animales no experimentan las consecuencias adversas del tratamiento in vivo con tóxicos. Sin embargo, su uso no disminuye significativamente el número de animales necesarios.

En resumen, hay varios tipos de sistemas in vitro disponibles para evaluar la toxicidad en órganos diana. Es posible adquirir mucha información sobre los mecanismos de toxicidad usando una o más de estas técnicas. La dificultad permanece en saber cómo extrapolar de un sistema in vitro, que representa una parte relativamente pequeña del proceso toxicológico, a todo el proceso que ocurre in vivo.

Pruebas in vitro para la irritación ocular

Quizás la prueba de toxicidad en animales enteros más polémica desde la perspectiva del bienestar animal es la prueba Draize para la irritación ocular, que se realiza en conejos. En esta prueba, se coloca una pequeña dosis fija de un químico en uno de los ojos del conejo mientras que el otro ojo se usa como control. El grado de irritación e inflamación se puntúa en varios momentos después de la exposición. Se está haciendo un gran esfuerzo para desarrollar metodologías que sustituyan a esta prueba, que ha sido criticada no solo por razones humanas, sino también por la subjetividad de las observaciones y la variabilidad de los resultados. Es interesante señalar que, a pesar de las duras críticas que ha recibido la prueba de Draize, ha demostrado tener un éxito notable en la predicción de los irritantes oculares humanos, en particular las sustancias ligeramente o moderadamente irritantes, que son difíciles de identificar por otros métodos. Por lo tanto, las demandas de alternativas in vitro son grandes.

La búsqueda de alternativas a la prueba de Draize es complicada, aunque se prevé que tenga éxito. Se han desarrollado numerosas alternativas in vitro y de otro tipo y en algunos casos se han implementado. Las alternativas de refinamiento a la prueba Draize, que por definición son menos dolorosas o angustiosas para los animales, incluyen la prueba ocular de bajo volumen, en la que se colocan cantidades más pequeñas de materiales de prueba en los ojos de los conejos, no solo por razones humanitarias, sino también para imitar más de cerca las cantidades a las que las personas pueden estar realmente expuestas accidentalmente. Otro refinamiento es que las sustancias que tienen un pH inferior a 2 o superior a 11.5 ya no se prueban en animales, ya que se sabe que irritan gravemente los ojos.

Entre 1980 y 1989, hubo una disminución estimada del 87% en el número de conejos utilizados para las pruebas de irritación ocular de los cosméticos. Las pruebas in vitro se han incorporado como parte de un enfoque de pruebas por niveles para lograr esta gran reducción en las pruebas con animales completos. Este enfoque es un proceso de varios pasos que comienza con un examen exhaustivo de los datos históricos de irritación ocular y el análisis físico y químico de la sustancia química que se va a evaluar. Si estos dos procesos no arrojan suficiente información, se realiza una batería de pruebas in vitro. Los datos adicionales obtenidos de las pruebas in vitro podrían entonces ser suficientes para evaluar la seguridad de la sustancia. De lo contrario, el paso final sería realizar pruebas in vivo limitadas. Es fácil ver cómo este enfoque puede eliminar o al menos reducir drásticamente el número de animales necesarios para predecir la seguridad de una sustancia de prueba.

La batería de pruebas in vitro que se utiliza como parte de esta estrategia de prueba por niveles depende de las necesidades de la industria en particular. Las pruebas de irritación ocular se realizan en una amplia variedad de industrias, desde cosmética hasta productos farmacéuticos y productos químicos industriales. El tipo de información requerida por cada industria varía y por lo tanto no es posible definir una sola batería de pruebas in vitro. Una batería de pruebas generalmente está diseñada para evaluar cinco parámetros: citotoxicidad, cambios en la fisiología y bioquímica del tejido, relaciones cuantitativas entre estructura y actividad, mediadores de inflamación y recuperación y reparación. Un ejemplo de una prueba de citotoxicidad, que es una posible causa de irritación, es el ensayo de rojo neutro que usa células cultivadas (ver arriba). Los cambios en la fisiología celular y la bioquímica resultantes de la exposición a una sustancia química pueden analizarse en cultivos de células epiteliales corneales humanas. Alternativamente, los investigadores también han utilizado globos oculares de bovinos o pollos intactos o disecados obtenidos de los mataderos. Muchos de los criterios de valoración medidos en estos cultivos de órganos completos son los mismos que los medidos in vivo, como la opacidad de la córnea y la hinchazón de la córnea.

La inflamación es con frecuencia un componente de las lesiones oculares inducidas por sustancias químicas y hay varios ensayos disponibles para examinar este parámetro. Diversos ensayos bioquímicos detectan la presencia de mediadores liberados durante el proceso inflamatorio como el ácido araquidónico y las citoquinas. La membrana corioalantoidea (CAM) del huevo de gallina también se puede utilizar como indicador de inflamación. En el ensayo CAM, se extrae un pequeño trozo de la cáscara de un embrión de pollo de diez a 14 días para exponer la CAM. A continuación, se aplica el producto químico a la CAM y se puntúan los signos de inflamación, como hemorragia vascular, en varios momentos posteriores.

Uno de los procesos in vivo más difíciles de evaluar in vitro es la recuperación y reparación de lesiones oculares. Un instrumento recientemente desarrollado, el microfisiómetro de silicio, mide pequeños cambios en el pH extracelular y puede usarse para monitorear células cultivadas en tiempo real. Se ha demostrado que este análisis se correlaciona bastante bien con la recuperación in vivo y se ha utilizado como prueba in vitro para este proceso. Este ha sido un breve resumen de los tipos de pruebas que se emplean como alternativas a la prueba de Draize para la irritación ocular. Es probable que en los próximos años se defina una serie completa de baterías de pruebas in vitro y cada una se valide para su propósito específico.

Validación

La clave para la aceptación regulatoria y la implementación de metodologías de prueba in vitro es la validación, el proceso mediante el cual se establece la credibilidad de una prueba candidata para un propósito específico. Se han realizado esfuerzos para definir y coordinar el proceso de validación tanto en los Estados Unidos como en Europa. La Unión Europea estableció el Centro Europeo para la Validación de Métodos Alternativos (ECVAM) en 1993 para coordinar esfuerzos allí e interactuar con organizaciones estadounidenses como el Johns Hopkins Center for Alternatives to Animal Testing (CAAT), un centro académico en los Estados Unidos. , y el Comité Coordinador Interinstitucional para la Validación de Métodos Alternativos (ICCVAM), compuesto por representantes de los Institutos Nacionales de Salud, la Agencia de Protección Ambiental de EE. UU., la Administración de Drogas y Alimentos de EE. UU. y la Comisión de Seguridad de Productos de Consumo.

La validación de las pruebas in vitro requiere una organización y planificación sustanciales. Debe haber consenso entre los reguladores gubernamentales y los científicos académicos e industriales sobre los procedimientos aceptables, y la supervisión suficiente por parte de un consejo asesor científico para garantizar que los protocolos cumplan con los estándares establecidos. Los estudios de validación deben realizarse en una serie de laboratorios de referencia utilizando conjuntos calibrados de productos químicos de un banco químico y células o tejidos de una sola fuente. Tanto la repetibilidad intralaboratorio como la reproducibilidad entre laboratorios de una prueba candidata deben demostrarse y los resultados deben someterse a un análisis estadístico apropiado. Una vez que se han compilado los resultados de los diferentes componentes de los estudios de validación, el consejo asesor científico puede hacer recomendaciones sobre la validez de la(s) prueba(s) candidata(s) para un propósito específico. Además, los resultados de los estudios deben publicarse en revistas revisadas por pares y colocarse en una base de datos.

La definición del proceso de validación es actualmente un trabajo en progreso. Cada nuevo estudio de validación proporcionará información útil para el diseño del próximo estudio. La comunicación y la cooperación internacionales son esenciales para el rápido desarrollo de una serie de protocolos ampliamente aceptables, particularmente dada la mayor urgencia impuesta por la aprobación de la Directiva de Cosméticos de la CE. De hecho, esta legislación puede proporcionar el impulso necesario para emprender un esfuerzo serio de validación. Solo a través de la finalización de este proceso puede comenzar la aceptación de los métodos in vitro por parte de las diversas comunidades reguladoras.

Conclusión

Este artículo ha proporcionado una visión general amplia del estado actual de las pruebas de toxicidad in vitro. La ciencia de la toxicología in vitro es relativamente joven, pero está creciendo exponencialmente. El desafío para los próximos años es incorporar el conocimiento mecanicista generado por los estudios celulares y moleculares al vasto inventario de datos in vivo para proporcionar una descripción más completa de los mecanismos toxicológicos, así como para establecer un paradigma mediante el cual se puedan utilizar los datos in vitro. para predecir la toxicidad in vivo. Solo será a través de los esfuerzos concertados de toxicólogos y representantes gubernamentales que se podrá realizar el valor inherente de estos métodos in vitro.

Atrás